給予CCP 技術(shù)的北蟲(chóng)草液體菌種培養(yǎng)工藝的優(yōu)化試驗(yàn)

錢葉會(huì)，葉世森，李 凌

（福建林業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，福建 南平353000）

北冬蟲(chóng)夏草，又北蟲(chóng)草、蟲(chóng)草花，草長(zhǎng)5～8cm，金黃、桔黃色，是一種名貴的藥用真菌，與青海冬蟲(chóng)夏草同屬于真菌門蟲(chóng)草屬，有相似的藥用和滋補(bǔ)功效。國(guó)內(nèi)外對(duì)已經(jīng)成為誘發(fā)蟲(chóng)草子實(shí)體的種類研究認(rèn)為，北蟲(chóng)草食用和藥用價(jià)值可與傳統(tǒng)的冬蟲(chóng)夏草媲美。近年來(lái)隨著野生冬蟲(chóng)夏草資源的枯竭，人工栽培的北蟲(chóng)草其有效成分與冬蟲(chóng)夏草類似，部分活性成分含量甚至高于冬蟲(chóng)夏草，人工栽培的北蟲(chóng)草成為冬蟲(chóng)夏草的理想替代品，這使得北冬蟲(chóng)夏草的開(kāi)發(fā)充滿了潛力。液體菌種是食用菌栽培新技術(shù)的發(fā)展方向，但是液體菌種技術(shù)的推廣，還存在技術(shù)路線難度高、過(guò)程控制工藝不夠成熟等問(wèn)題。本文對(duì)北蟲(chóng)草液體菌種栽培工藝進(jìn)行了試驗(yàn)研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)確定了母種的選擇、培養(yǎng)基的制備、培養(yǎng)基的滅菌、接種空間的消毒、搖床培養(yǎng)、發(fā)菌管理等階段的北蟲(chóng)草培養(yǎng)的關(guān)鍵步驟的關(guān)鍵控制點(diǎn)（CCP）的參數(shù)和操作方法。

1 種源

本次試驗(yàn)所選的4個(gè)品系的菌種，根據(jù)食用菌菌種命名規(guī)則分別進(jìn)行命名編號(hào)為CM－1、CM－2、CM－3、CM－4，所有菌種的母種的轉(zhuǎn)代次數(shù)不得超過(guò)3次。

2 母種的選擇

2.1 母種轉(zhuǎn)管實(shí)驗(yàn)

母種培養(yǎng)基配方和制備方法如下：馬鈴薯200g，瓊脂20g，葡萄糖20g，牛肉膏10g，磷酸二氫鉀1g，硫酸鎂0.5g。制備好馬鈴薯濾液，加蒸餾水至1 000mL煮沸加入各種輔助物質(zhì)，最后加入瓊脂，并不停地?cái)嚢枋弓傊耆诨?，高壓蒸汽滅?.1～0.12MPa、121℃、30min。

每個(gè)菌種接種40支，置于18℃培養(yǎng)箱暗培養(yǎng)12h升溫到24℃培養(yǎng)，濕度自然，無(wú)光照。每天觀察1次，觀察并統(tǒng)計(jì)菌種生長(zhǎng)速度，氣生性、色澤、長(zhǎng)滿斜面時(shí)間，最后通過(guò)顯微鏡觀察是否有雜菌孢子及其菌絲。從發(fā)菌時(shí)間、菌絲生長(zhǎng)情況、長(zhǎng)滿斜面時(shí)間和轉(zhuǎn)色速度等對(duì)母種培養(yǎng)生長(zhǎng)情況進(jìn)行評(píng)估，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 母種培養(yǎng)生產(chǎn)情況記錄表

2.2 子實(shí)體生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 培養(yǎng)基配方

選用成分較為綜合的培養(yǎng)基（本文中所有百分比含量均為質(zhì)量百分比）：大米99%，磷酸二氫鉀0.15%，VB1每千克大米5片，蛋清0.85%，料水質(zhì)量比1∶1。

2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.2.1 培養(yǎng)方法

接種后將最初的培養(yǎng)溫度保持在15～18℃，遮光培養(yǎng)。當(dāng)菌絲生長(zhǎng)至培養(yǎng)基一半時(shí)，可將溫度升至24℃，培養(yǎng)20d，當(dāng)培養(yǎng)基上部出現(xiàn)密集的菌絲突起時(shí)，就給予10～15℃的溫差刺激，并增加可見(jiàn)光照射刺激轉(zhuǎn)色。7～10d轉(zhuǎn)完色后用紫外燈對(duì)培養(yǎng)室進(jìn)行30min光照消毒，然后揭開(kāi)栽培瓶蓋子改用消毒的橡皮筋和塑料薄膜封口，當(dāng)子座長(zhǎng)至1cm時(shí)，在封口薄膜上打小孔通氣。溫度保持18～22℃，空氣相對(duì)濕度80%～90%。

2.2.2.2 性狀比較分析

每個(gè)菌種接種每次接種培養(yǎng)20瓶，重復(fù)3次。待棒狀子座成熟后采摘下進(jìn)行烘干計(jì)算干重。本階段所要記錄數(shù)據(jù)為：生長(zhǎng)周期、生長(zhǎng)速度、子座密度、整齊度、產(chǎn)量。以生長(zhǎng)周期最短，產(chǎn)量最高，蟲(chóng)草品相以長(zhǎng)度、密度、整齊度為分級(jí)統(tǒng)計(jì)，得到不同菌種栽培性狀觀察表見(jiàn)表2。

表2 不同菌種栽培性狀觀察表

根據(jù)培養(yǎng)結(jié)果，CM－1菌種從菌絲培養(yǎng)到子實(shí)體均表現(xiàn)出優(yōu)良的性狀，其中通過(guò)子實(shí)體生長(zhǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證CM－2型子實(shí)體屬于大孢子頭型，另行安排試驗(yàn)計(jì)劃，CM－3和CM－4的綜合性狀最劣，故選用CM－1進(jìn)行液體菌種培養(yǎng)試驗(yàn)。

3 液體培養(yǎng)基的選擇

3.1 培養(yǎng)基配方

液體培養(yǎng)基的配方主要選擇了3種報(bào)道過(guò)的配方進(jìn)行對(duì)比，篩選確定最優(yōu)配方：配方一（%）：玉米粉1%、葡萄糖2%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、水95.35%、硫酸鎂0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、pH值調(diào)至6.5左右。配方二（%）：馬鈴薯10%、蔗糖2%、牛肉膏0.5%、蛋白胨1.5%、磷酸二輕氫鉀0.2%、硫酸鎂0.1%、維生素B22片／L、B11片／L。配方三（%）：馬鈴薯20%、玉米粉3%、葡萄糖2%、蛋白胨0.3%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、pH值調(diào)至6.5左右。

3.2 實(shí)驗(yàn)方案

以上3組配方，各制備培養(yǎng)基3 000mL，分別分裝菌種培養(yǎng)搖瓶10瓶，每瓶接入LN－1試管中1／3支，在24℃，靜止培養(yǎng)24h后，放置于24℃搖床內(nèi)，130r／min，恒溫?fù)u床培養(yǎng)5d。

3.3 結(jié)果分析

根據(jù)對(duì)菌絲體萌發(fā)時(shí)間、菌球出現(xiàn)時(shí)間、菌球數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，得到菌種在培養(yǎng)階段生長(zhǎng)情況，見(jiàn)表3。

表3 液體菌種生長(zhǎng)記錄表

通過(guò)對(duì)菌球大小和菌絲體干重的測(cè)定得到液體 菌種培養(yǎng)生長(zhǎng)量數(shù)據(jù)，見(jiàn)表4。

表4 液體菌種生長(zhǎng)量記錄表

以上各項(xiàng)最高數(shù)值為“＋＋＋”，其次為“＋＋”，最低為“＋”，以一個(gè)“＋”得1分，進(jìn)行計(jì)算，得出綜合分析比較表5。

表5 綜合分析比較表

從表5不難看出，配方一綜合評(píng)定得分為14分，其余2個(gè)配方綜合評(píng)定得分均為8分，所以配方一是3個(gè)培養(yǎng)基配方中綜合性能最優(yōu)的配方組合。

4 高壓滅菌條件的優(yōu)化

4.1 實(shí)驗(yàn)方案

為了達(dá)到徹底滅菌的效果，本方案選擇高壓蒸汽滅菌法，根據(jù)相關(guān)資料滅菌條件設(shè)定為3個(gè)值，具體見(jiàn)表6。

表6 高壓蒸汽滅菌條件

4.2 結(jié)果分析

每組方案各配制6瓶培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌操作，滅菌完成后通過(guò)對(duì)pH值下降情況和滅菌情況進(jìn)行檢測(cè)得出的結(jié)果見(jiàn)表7。根據(jù)結(jié)果分析，方法1出現(xiàn)了滅菌不徹底的情況，方法2和方法3均能起到滅菌的徹底性，再次根據(jù)pH值的下降情況，并同時(shí)考慮高溫長(zhǎng)時(shí)間對(duì)培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的破壞作用，進(jìn)而導(dǎo)致培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的降低，所以，綜合以上因數(shù)考慮，方法2，在0.05MPa時(shí)排冷氣是在本6個(gè)方案中最優(yōu)的方案組合。

表7 滅菌效果檢測(cè)表

5 搖床培養(yǎng)條件的優(yōu)化選擇

5.1 設(shè)備選擇

本方案選用的搖床型號(hào)為BDY－2102恒溫?fù)u床。

5.2 方案制定

根據(jù)設(shè)備性能和液體菌種培養(yǎng)的振幅需求，選用培養(yǎng)溫度24℃，振幅設(shè)為3種：1）低速檔90r／min；2）高速檔140r／min；3）每天觀察3次，根據(jù)培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)泡沫生產(chǎn)情況和液體震動(dòng)幅度，隨時(shí)調(diào)換震動(dòng)幅度。各個(gè)方案選擇培養(yǎng)基10瓶，每瓶溶液體積為300mL。

5.3 結(jié)果分析

在相同的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，培養(yǎng)結(jié)束后，根據(jù)培養(yǎng)液表面泡沫多少、菌球大小、菌球數(shù)量和污染情況來(lái)對(duì)振幅大小進(jìn)行判斷，得到數(shù)據(jù)表8。

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)過(guò)程的觀察和結(jié)合以上數(shù)據(jù)的分析，方案①由于震動(dòng)幅度偏低，所生成的菌球偏大，且大小不是非常均勻，個(gè)別菌球直徑甚至達(dá)到了10mm，并且個(gè)數(shù)偏少。方案②由于震動(dòng)幅度偏大，震動(dòng)過(guò)程中形成了大量起泡，同時(shí)由于培養(yǎng)液的飛濺，導(dǎo)致部分瓶塞和瓶口會(huì)滲透出培養(yǎng)液而出現(xiàn)污染現(xiàn)象。方案③，由于通過(guò)不停的觀察，根據(jù)實(shí)際需要選擇震動(dòng)幅度，能很好地控制培養(yǎng)瓶溶液的震動(dòng)幅度和泡沫的生成幅度，并促進(jìn)了菌球直徑的均勻性和大小的適宜，根據(jù)觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)震動(dòng)幅度在120r／min±10之間調(diào)整即可，當(dāng)然相比較前面的2種，方案③因?yàn)橐煌Ｓ^察，所以消耗時(shí)間較多，綜合所有因素考慮，本實(shí)驗(yàn)中方案③為最優(yōu)方案。

表8 液體菌種發(fā)酵結(jié)果情況表

6 栽培培養(yǎng)基的優(yōu)化選擇

6.1 栽培配方的選擇

本實(shí)驗(yàn)方案在綜合有關(guān)資料的基礎(chǔ)上并結(jié)合生產(chǎn)成本和原料獲得的難易程度，選擇了3個(gè)培養(yǎng)基配方：配方一：大米100%，料水質(zhì)量比1∶1.1；配方二：小麥100%，料水質(zhì)量比1∶1.1；配方三：大米99%，磷酸二氫鉀0.15%，VB1每千克大米5片，蛋清0.85%，料水比1∶1。

各個(gè)配方制作3kg培養(yǎng)基三批制備培養(yǎng)基，接種培養(yǎng)，接種的菌種為每瓶菌種接種10瓶，每瓶培養(yǎng)基培養(yǎng)料干重30g。每配方培養(yǎng)基接種100瓶，重復(fù)3次，即每個(gè)菌種有300個(gè)重復(fù)。

6.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

通過(guò)觀察記錄，得到菌種栽培形狀觀察表9。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，配方一和配方二從每瓶出草根數(shù)、產(chǎn)量和品相判斷效果相當(dāng)，配方三由于添加了蛋清，N含量較高，導(dǎo)致菌絲體生長(zhǎng)濃密，原基生產(chǎn)困難，單根蟲(chóng)草直徑偏大，綜合考慮培養(yǎng)料的獲取性，選擇配方一作為栽培培養(yǎng)基配方

表9 不同菌種栽培性狀觀察表

7 栽培方法優(yōu)化

通過(guò)以上2個(gè)方案選擇最優(yōu)菌種和最優(yōu)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)方法優(yōu)化：主要控制指標(biāo)為培養(yǎng)溫度、分化溫度和溫差、光照時(shí)間和光強(qiáng)（說(shuō)明：以下所有實(shí)驗(yàn)使用樣品為每瓶培養(yǎng)基干重30g）。

7.1 發(fā)菌溫度的優(yōu)化

培養(yǎng)溫度優(yōu)化：培養(yǎng)溫度對(duì)比，3個(gè)對(duì)比，每組40瓶則40個(gè)重復(fù)，于生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為19℃，22℃，24℃，每天觀察記錄菌絲生長(zhǎng)速率。通過(guò)觀察，得到如下菌絲體生長(zhǎng)數(shù)據(jù)表10。

表10 菌絲體生長(zhǎng)記錄表

7.2 轉(zhuǎn)色管理

1）每天散射光照12h、10h、8h各一組，晚上用日光燈補(bǔ)照射3h和5h和不補(bǔ)照各一組，共9組；

2）室內(nèi)溫度白天22～24℃，夜間降低2～5℃；

3）室內(nèi)空氣濕度控制在65%左右；

4）通氣2～3次／d，通氣20min／次，待菌絲由白色轉(zhuǎn)為桔黃色或橘紅色后并陸續(xù)紐結(jié)成長(zhǎng)出原基，分泌出來(lái)黃色的水珠，就可以進(jìn)行生長(zhǎng)北蟲(chóng)草子的準(zhǔn)備工作。

通過(guò)觀察記錄，得到轉(zhuǎn)色管理記錄表11。通過(guò)觀察，北蟲(chóng)草在自然光照射12h，24h內(nèi)即可完成轉(zhuǎn)色，夜晚可以不安排補(bǔ)照射燈光。

7.3 分化溫度和溫差優(yōu)化

相同溫度培養(yǎng)同一批菌種分3組各40瓶，等菌絲發(fā)滿后分別予以8℃、10℃和15℃的溫差，光照時(shí)間和光強(qiáng)控制相同，記錄轉(zhuǎn)色時(shí)間和子座出現(xiàn)時(shí)間和整齊性以及子座密度，通過(guò)觀察得到菌絲體轉(zhuǎn)色和分化記錄表12。

表11 轉(zhuǎn)色管理記錄表

表12 菌絲體轉(zhuǎn)色和分化記錄表

通過(guò)對(duì)分化溫差的控制和數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，得出15℃分化溫差效果最好。

8 結(jié)語(yǔ)

本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證北蟲(chóng)草液體菌種工藝中各個(gè)步驟的參數(shù)和操作方法，確定了菌源LN－1，培養(yǎng)液體菌種的培養(yǎng)基為葡萄糖2%、玉米粉1%、酵母粉0.5%、蛋白胨1%、水95.35%、硫酸鎂0.5%、磷酸二氫鉀0.1%、pH值調(diào)至6.5左右，滅菌條件為121℃，40min，在壓力到0.05MPa時(shí)排冷氣，搖床震蕩培養(yǎng)在120r／min±10之間根據(jù)觀察結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，培養(yǎng)溫度24℃，轉(zhuǎn)色光照散射光每天照射12h，照射2d，原基誘導(dǎo)溫差15℃為最優(yōu)培養(yǎng)條件。通過(guò)本研究可以為進(jìn)一步制定北蟲(chóng)草栽培的標(biāo)準(zhǔn)化栽培甚至是構(gòu)建北蟲(chóng)草液體菌種栽培工藝的HACCP計(jì)劃提供參考依據(jù)。

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