電針刺激對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌ERK及JNK蛋白表達(dá)的影響

唐思詩，唐念珍，唐成林，楊 輝，張 毅，田 源

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2008級(jí)七年制本碩連讀生，四川 成都 610075；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院2012級(jí)碩士研究生，重慶 401331；3.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331；4.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院2012級(jí)碩士研究生，重慶 400016；5.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，重慶 401331）

論 著

電針刺激對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌ERK及JNK蛋白表達(dá)的影響

唐思詩1，唐念珍2，唐成林3，楊 輝4，張 毅5，田 源5

（1.成都中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院2008級(jí)七年制本碩連讀生，四川 成都 610075；2.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院2012級(jí)碩士研究生，重慶 401331；3.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 401331；4.重慶醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院2012級(jí)碩士研究生，重慶 400016；5.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院2013級(jí)碩士研究生，重慶 401331）

目的：探討電針對(duì)胰島素抵抗大鼠骨骼肌ERK、JNK蛋白表達(dá)的影響。方法：將SD雄性大鼠隨機(jī)分為空白組、模型1組、模型2組、電針1組、電針2組，用高脂高糖飲食喂養(yǎng)法建立胰島素抵抗大鼠模型，用葡萄糖氧化酶法檢測FBG、放射免疫分析法檢測FINS，并計(jì)算Homa-IR。確定造模成功后，電針組大鼠取足三里、三陰交、胃脘下俞行電針治療，用Western blot技術(shù)檢測大鼠骨骼肌中ERK、JNK蛋白的表達(dá)。結(jié)果：模型組大鼠FBG、FINS、Homa-IR較空白組顯著升高（P＜0.05），電針組大鼠FBG、FINS、Homa-IR較模型組顯著下降（P＜0.05），模型組大鼠ERK、JNK蛋白表達(dá)較空白組顯著上升（P＜0.05），電針組大鼠ERK、JNK蛋白表達(dá)較模型組顯著下降（P＜0.05）。結(jié)論：電針可降低ERK、JNK蛋白表達(dá)水平，從而改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

胰島素抵抗；大鼠模型；電針；ERK；JNK；

肥胖、2型糖尿病、多囊卵巢綜合癥、代謝綜合征、冠心病、高血壓等病理改變過程中胰島素抵抗是共同存在的病理基礎(chǔ)，即“共同土壤”學(xué)說所闡述的理論思想［1］。近年來，電針治療胰島素抵抗的研究取得較大進(jìn)展。我們用高脂高糖飲食誘導(dǎo)大鼠發(fā)生胰島素抵抗，電針治療后通過Western blot技術(shù)檢測大鼠骨骼肌中ERK、JNK蛋白的表達(dá)，以觀察電針對(duì)胰島素抵抗模型大鼠骨骼肌中胰島素抵抗的影響，總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組及造模

4周齡雄性SD清潔級(jí)大鼠40只，體質(zhì)量（80±20）g，適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機(jī)分為空白組、模型1組、模型2組、電針1組、電針2組。空白組給予普通飼料喂養(yǎng)，其余組參考王艷軍等［2］造模法給予高脂高糖飲食喂養(yǎng)建立胰島素抵抗模型。高脂高糖飲食配方（質(zhì)量比）為普通飼料60%，豬油15%，蔗糖25%。從第6周開始，每隔1周對(duì)空白組及造模組大鼠從眼眶靜脈竇采血1次，檢測空腹血糖（FBG）、血漿胰島素（FINS），并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR）［3］進(jìn)行對(duì)比，當(dāng)造模組大鼠FBG、FINS、Homa-IR與空白組比較明顯升高（P＜0.05）時(shí)為造模成功。第8周造模成功后，空白組繼續(xù)以普通飼料喂養(yǎng)，模型1組及電針1組繼續(xù)給予高脂高糖飲食，模型2組及電針2組各8只轉(zhuǎn)為普食喂養(yǎng)。

1.2 試劑及儀器

普通飼料由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心配制提供，豬油、蔗糖為市售，胰島素放射免疫試劑盒購自北方生物技術(shù)研究所，葡萄糖測定試劑盒購自上海博谷生物科技有限公司，華佗牌針灸針（0.25mm×13mm，中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），華佗牌SDZ-Ⅱ型電針儀（中國蘇州醫(yī)療用品廠有限公司），發(fā)光試劑（MILLIPORE公司Immobilon Western100mL Cat.No.WBKLS0100），二抗（中杉公司，ZB-2306兔抗山羊IgG，ZB-2305山羊

抗小鼠IgG，ZB-2301山羊抗兔IgG），核酸蛋白分析儀（BECKMAN DU640），凝膠成象系統(tǒng)（Blo-RAO Gel Doc 2000），電泳儀（Blo-RAO POWER/PAC 1000）。

1.3 針刺方法

電針組造模成功后予以電針治療，每日1次，連續(xù)治療14天。用特制固定器將大鼠固定，用毫針直刺足三里、三陰交5mm，斜刺胃脘下俞5mm，接通SDZ-Ⅱ型電針儀，同側(cè)足三里與三陰交、雙側(cè)胃脘下俞分別連接一組電針。參考有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道［4］統(tǒng)一規(guī)定電針儀的頻率為3～5Hz，強(qiáng)度為3mA（中等強(qiáng)度刺激），疏密波，通電20min?？瞻捉M和模型組僅以相同手法、相同時(shí)間段內(nèi)抓取固定20min，無治療。

1.4 標(biāo)本采集

電針治療結(jié)束后，各組大鼠均禁食12h，次日空腹眼眶靜脈竇采血靜置于清潔塑料離心管中，在低溫離心機(jī)上3000r/min離心10min，收集血清置于-80℃冰箱中保存待測。采血結(jié)束后將大鼠脫頸椎處死，迅速分離左側(cè)股四頭肌放入小玻璃瓶中，標(biāo)號(hào)封存后置于液氮罐中，送至-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 指標(biāo)檢測

大鼠空腹胰島素（FINS）采用放射免疫分析法測FINS含量，空腹血糖（FBG）采用葡萄糖氧化酶法測FBG含量，所有測定步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。參照李光偉［3］的方法計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（Homa-IR），即Homa-IR=ln（FBG×FINS/22.5）。

大鼠骨骼肌中ERK、JNK蛋白表達(dá)采用Western blot技術(shù)檢測：①取股四頭肌約40mg，每組加入配好的緩沖液（蛋白質(zhì)勻漿緩沖液1mL，PMSF50μg/mL，Leupin5μg/mL）0.4mL，充分勻漿；②在–20℃下凍存細(xì)胞20min后，以12000r/min離心20min，上清液移至另一EP管（100μL）中；③于試管中加考馬斯亮藍(lán)染液1mL和蛋白上清液2μL，混勻后測定蛋白濃度（60～100μg/μL較為理想）；④每EP管加等量加樣緩沖液100μL，煮沸6min. 根據(jù)蛋白濃度計(jì)算所需上樣量（以上操作均在冰板上進(jìn)行）；⑤灌制聚丙烯凌膠，10%分離膠，4%濃縮膠；⑥上樣量50μg，每樣至少上二塊平行膠，電泳電壓濃縮膠90V，分離膠160V，電泳液為甘氨酸緩沖液；⑦電泳結(jié)束后取出凝膠，和相同大小的PVDF（先用95%乙醇固定）置于三層濾紙中間，放入轉(zhuǎn)移槽中，加滿轉(zhuǎn)移液，300mA約90min；⑧取出PVDF膜，自然晾干后，置于95%乙醇中固定，自然晾干，0.01MPBST洗5min，放入5%脫脂奶粉中封閉非特異性蛋白，37℃恒溫?fù)u床下約4h；⑨加I抗體（1∶1000用0.01MPBT配制），37℃恒溫?fù)u床下3～4h，0.01MPBST洗15min×3次；⑩加HRP標(biāo)記的二抗（1∶1000用0.01MPBST配制），室溫下1～2h，0.01MPBST洗15min×3次；將PVDF置于NEN化學(xué)發(fā)光試劑中增強(qiáng)反應(yīng)1～3min，在暗室中使X光片爆光，常規(guī)方法顯影，定影，并掃入凝膠成象系統(tǒng)進(jìn)行圖象分析，計(jì)算光密度值（OD值），重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)果以均數(shù)±平均差（±s ）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，兩組數(shù)之間的比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

高脂高糖飲食對(duì)FBG、FINS、Homa-IR的影響見表1。

表1 造模成功后各組大鼠FBG、FINS、Homa-IR比較（±s）

表1 造模成功后各組大鼠FBG、FINS、Homa-IR比較（±s）

注：與空白組比較，*P＜0.05。

組別nFBG（mmol/L）FINS（mU/L）Homa-IR空白組85.28±0.2113.45±1.151.14±0.09模型1組86.70±0.23*22.01±2.24*1.88±0.08*模型2組86.68±0.24*21.15±1.66*1.83±0.10*電針1組86.30±0.27*21.35±1.49*1.80±0.04*電針2組86.45±0.27*21.28±1.24*1.81±0.07*

電針對(duì)大鼠FBG、FINS、Homa-IR的影響見表2。

表2 治療結(jié)束后各組大鼠FBG、FINS、Homa-IR比較（±s）

表2 治療結(jié)束后各組大鼠FBG、FINS、Homa-IR比較（±s）

注：與模型組比較，aP＜0.05；與模型1組比較，bP＜0.05；與電針1組比較，cP＜0.05。

組別nFBG（mmol/L）FINS（mU/L）Homa-IR空白組85.23±0.1412.74±0.911.08±0.07模型1組87.05±0.1823.14±2.151.98±0.11模型2組86.71±0.16b19.63±1.13b1.77±0.07b電針1組86.23±0.13a16.50±0.58a1.51±0.05a電針2組85.29±0.19ac14.15±0.74ac1.20±0.04ac

電針對(duì)大鼠骨骼肌ERK、JNK蛋白表達(dá)的影響見表3。

表3 治療結(jié)束后各組大鼠骨骼肌ERK、JNK蛋白表達(dá)比較 （±s）

表3 治療結(jié)束后各組大鼠骨骼肌ERK、JNK蛋白表達(dá)比較 （±s）

注：與空白組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05。

組別（Groups）nERKJNK空白組（Blank）81.04±0.091.06±0.12模型1組（Model 1）83.14±0.06a2.77±0.08a模型2組（Model 2）82.63±0.12a2.45±0.08a電針1組（EA 1）81.65±0.09b1.47±0.07b電針2組（EA 2）81.19±0.08b1.25±0.06b

3 討 論

結(jié)果顯示，高脂高糖飲食喂養(yǎng)，各模型組及各電針組大鼠的FBG、FINS、Homa-IR均較空白組顯著升高（P＜0.05），存在明顯的胰島素抵抗，提示造模成功。而經(jīng)過電針治療后，各電針組大鼠FBG、FINS、Homa-IR比各模型組顯著降低，表明電針明顯改善大鼠胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)，這同有關(guān)研究報(bào)道結(jié)果一致［5-8］。

JNK和ERK同屬于有絲分裂原家族，在肥胖患者的一些組織中代謝和炎癥應(yīng)激增加JNK和ERK的活性，進(jìn)而誘導(dǎo)IRS1或IRS2 絲氨酸位點(diǎn)磷酸［9，10］，炎性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的ERK通路也介導(dǎo)IRS1表達(dá)的下調(diào)［11］，從而妨礙胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)而促進(jìn)胰島素抵抗。結(jié)果顯示，各模型組大鼠的ERK、JNK蛋白表達(dá)水平均高于空白組，經(jīng)過電針治療的各電針組大鼠的ERK、JNK蛋白表達(dá)水平較各模型組明顯降低，這說明電針干預(yù)使大鼠ERK、JNK蛋白從興奮水平下降到接近正常水平，從而降低ERK、JNK的活性，減少誘導(dǎo)IRS1或IRS2 絲氨酸位點(diǎn)磷酸，從而改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。

研究結(jié)果證明電針治療能夠顯著降低胰島素抵抗模型大鼠FBG和FINS水平，通過降低ERK、JNK蛋白表達(dá)水平達(dá)到改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的目的，證實(shí)電針具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌、提高集體對(duì)胰島素的利用率等作用，表明電

針具有改善胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)的作用。

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Objective：To investigate the influence of electroacupuncture on expression of ERK and JNK protein in the skeletal muscle of insulin resistant rat. Method：The male SD rats were randomly divided into five groups, blank group，model 1 group，model 2 group，EA 1 group and EA 2 group. To establish the insulin resistant rats model by feeding with high fat and high sugar diet. We detect FBG with the glucose oxidase method and FINS with the radioimmunoassay，and then we calculated the Homa-IR. After the successful modeling determined，the EA group were treated with electroacupuncture at Zusanli，Sanyinjiao and Weiwanxiashu. The expression of ERK and JNK protein in the skeletal muscle of rats was detected with the Western blot. Result：After electroacupuncture，the FBG, FINS and Homa-IR of each model group significantly increased more than that of blank l group（P＜0.05）. The expression of ERK and JNK protein of each model group significantly increased more than that of blank l group（P＜0.05）.The FBG, FINS, Homa-IR of each EA group significantly decreased more than that of each model group（P＜0.05）. The expression of ERK and JNK protein of each EA group significantly decreased more than that of each model group（P＜0.05）.Conclusion：The electroacupuncture could improve insulin resistant by regulating the expression level of ERK and JNK protein in the insulin resistant rat.

Insulin resistant；Rat model;electroacupuncture；ERK；JNK

R245.319

B

1004-2814（2015）04-0268-03

2015-01-16

唐成林