煙草葉際細(xì)胞分裂素產(chǎn)生菌Y-P22的篩選、鑒定及其應(yīng)用效果

邵蘭軍,劉凱,李宙文,張忠民,趙文婷,姚良同,杜秉海,丁延芹*

1.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,廣東廣州510000

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

3.濟(jì)寧學(xué)院,山東濟(jì)寧273155

煙草葉際細(xì)胞分裂素產(chǎn)生菌Y-P22的篩選、鑒定及其應(yīng)用效果

邵蘭軍1,劉凱2,李宙文1,張忠民3,趙文婷2,姚良同2,杜秉海2,丁延芹2*

1.廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司,廣東廣州510000

2.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/山東省農(nóng)業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安271018

3.濟(jì)寧學(xué)院,山東濟(jì)寧273155

通過(guò)形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析將Y-P22鑒定為缺陷短波單孢菌（Brevundimonas diminuta）。該菌株是從煙草葉際分離的，具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂素產(chǎn)生能力。田間應(yīng)用效果表明，該菌株能有效促進(jìn)煙葉開(kāi)片，提高煙葉的可利用性；感官評(píng)吸質(zhì)量結(jié)果表明該菌株可以明顯提升煙葉內(nèi)在質(zhì)量。

煙草;葉際;細(xì)胞分裂素;缺陷短波單胞菌

隨著我國(guó)卷煙工業(yè)迅速發(fā)展，作為卷煙工業(yè)最重要原材料的煙葉已成為各大企業(yè)爭(zhēng)先搶奪的戰(zhàn)略物資，如何提高煙葉質(zhì)量和產(chǎn)量更是各大企業(yè)關(guān)注的重點(diǎn)。提高煙葉質(zhì)量的常規(guī)方法通常有兩個(gè)途徑：一是在煙草生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)合理施肥、尤其是葉面鉀肥的使用來(lái)提高煙葉產(chǎn)量和質(zhì)量；二是在煙草加工過(guò)程中，利用物化手段適當(dāng)處理來(lái)降低煙葉中的煙堿含量，從而提高煙葉的可利用性。近年來(lái)，微生物資源在煙草生產(chǎn)的各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用成為眾多科研工作者的研究熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用微生物及其制劑不僅可以降低煙堿含量，還可以增加煙葉的香氣，改善煙葉品質(zhì)[1,2]。較之以前方法具有無(wú)需特殊處理，沒(méi)有殘留，不會(huì)污染環(huán)境的優(yōu)點(diǎn)。目前研究較多的可以用于煙草種植和加工的細(xì)菌種類(lèi)主要有煙草節(jié)桿菌（Arthrobacter nicotianae)、嗜煙堿節(jié)桿菌(A.nicotinovorans)、氧化節(jié)桿菌(A.oxidans)、惡臭假單胞菌(Pseudomonas puida)、芽孢桿菌（Bacillus spp.）等[3-6]。本研究對(duì)從煙草葉際分離的1株能促進(jìn)煙葉開(kāi)片，改善上部煙葉質(zhì)量的菌株Y-P22進(jìn)行鑒定，并對(duì)其應(yīng)用效果進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該菌可以明顯改善煙葉的內(nèi)在質(zhì)量，在生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用潛力和價(jià)值。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)菌株Y-P22為本實(shí)驗(yàn)室從煙草葉際分離，能夠產(chǎn)生細(xì)胞分裂素。

1.1.2煙草品種K326。

1.1.3培養(yǎng)基0.5%煙葉，3%豆芽，1000 mL H2O。

1.2實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)

1.2.1室內(nèi)實(shí)驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物學(xué)系植物根際促生細(xì)菌研究室完成。

1.2.2田間實(shí)驗(yàn)在遵義縣科技示范園完成，土壤類(lèi)型為黃壤，中等肥力。

1.2.3感官質(zhì)量煙葉評(píng)吸由黃果樹(shù)集團(tuán)公司技術(shù)中心原料所完成。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1Y-P22的鑒定形態(tài)特征和生理生化特征測(cè)定方法參閱文獻(xiàn)[7]。

1.3.2DNA提取和16S rDNA序列擴(kuò)增DNA的提取參考文獻(xiàn)[7]。

引物為P1：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3’和P2：

5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3’，由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。

PCR反應(yīng)體系（25 μL）為：Taq 0.5μL,10×Buffer(Mg2+)2.5μL,dNTP(10 mM each)0.5μL,引物1μL,模板1μL,depc水19.5μL。

PCR反應(yīng)條件為:95℃5 min,94℃1 min,56℃1 min,72℃1.5 min 30個(gè)循環(huán),72℃延伸10 min。

用3S柱離心式瓊脂糖DNA小量快速純化試劑盒（3S Spin Agarose Gel DNA purification kit）純化PCR產(chǎn)物。

1.3.316S rDNA序列測(cè)定及分析PCR產(chǎn)物測(cè)序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。測(cè)序結(jié)果用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行相似性分析。

1.3.4菌液制備用液體培養(yǎng)基接種新鮮菌種，搖床振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，充分搖勻，用清水稀釋200倍備用。

1.3.5田間實(shí)驗(yàn)在上部煙葉采摘前1月左右，將上述菌液噴施于煙草中上部葉片（以葉片背面為主）；間隔7 d后，進(jìn)行第二次噴施，共2次。以傍晚噴施為宜，忌雨天噴施。以等量的清水和處理方式做為對(duì)照。處理45 d后，按照中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查方法調(diào)查煙葉的長(zhǎng)勢(shì)，葉片顏色和葉面積。各種栽培管理措施按當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)優(yōu)質(zhì)烤煙栽培技術(shù)精心管理。

1.3.6煙葉感官質(zhì)量評(píng)吸評(píng)吸指標(biāo)主要考核香氣特征的香氣質(zhì)和香氣量，煙氣特征的濃度和勁頭，吃味特征的雜氣、刺激性和余味，以及物理特征的燃燒性和灰色等。具體按照行業(yè)內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行，由黃果樹(shù)集團(tuán)公司技術(shù)中心原料所給出結(jié)論。

2　結(jié)果與分析

2.1Y-P22形態(tài)特征

Y-P22菌落較小，圓形，邊緣整齊，濕潤(rùn)，半透明，呈灰白色（圖1 A）。菌體細(xì)小桿狀，革蘭氏染色陰性，該菌在培養(yǎng)初期和培養(yǎng)后期形態(tài)上有明顯變化。菌體大小為0.25～0.5×0.75～1 μm，不產(chǎn)芽孢，儲(chǔ)存的菌種染色后著色很淺，模糊不清（圖1 B），培養(yǎng)24 h后染色深而清晰，菌體呈短桿狀（圖1 C）。

圖1　P22形態(tài)特征A菌落形態(tài)；B、C菌體的倒置攝像顯微照片（×1000）Fig.1 Shape of bacterial strain Y-P22A Colony;B＆C Photos of cell(×1000)

2.2生理生化特征

該菌不能利用葡萄糖和乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，接觸酶陽(yáng)性，不產(chǎn)生吲哚，不能液化明膠，苯丙氨酸脫氨酶陰性。與Brevundimonas diminuta模式菌株的生理生化特征相符。

2.316S rDNA的特異性擴(kuò)增和序列分析

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖2。

圖2　PCR產(chǎn)物電泳圖M為2 kb ladder；泳道1為PCR產(chǎn)物Fig.2 Electrophoresis map of PCR productsM is 2 kb ladder；Lane 1 is PCR products

以總DNA為模板擴(kuò)增出大約1.5 kb大小的片段（圖2），純化后送公司測(cè)序。結(jié)果表明此片段大小為1338 bp，通過(guò)用BLAST比對(duì)，與Brevundimonas diminuta 2P02AA的16S rDNA序列（EU977662）相似性為99%。序列提交GenBank，收錄號(hào)為EU240971。

通過(guò)其形態(tài)學(xué)特征，生理生化特征和16S rDNA的序列分析初步將Y-P22鑒定為缺陷短波單胞菌（Brevundimonas diminuta）。

2.4田間實(shí)驗(yàn)結(jié)果

田間調(diào)查結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　煙草生長(zhǎng)情況調(diào)查表Table 1 Investigation on the growth of tobacco

從表1可以看出，由菌液處理的煙株其田間長(zhǎng)勢(shì)較好，與對(duì)照處理相比，煙株的葉面積增加，并且處理后的煙株上二棚葉片的葉面積增加較為明顯，達(dá)到58.8%，而煙株頂葉葉面積增加約40%，從試驗(yàn)的結(jié)果來(lái)看，菌液的使用有利于改善上部煙葉開(kāi)張程度、改進(jìn)煙葉品質(zhì)，更有利于提高煙葉的可利用性。

2.5煙葉感官質(zhì)量評(píng)吸

處理煙葉達(dá)到工藝成熟時(shí)進(jìn)行采收，采用三段式烘烤工藝烘烤。送黃果樹(shù)集團(tuán)公司技術(shù)中心原料所評(píng)吸，結(jié)果如表2所示。

表2　煙葉感官質(zhì)量評(píng)吸結(jié)果Table 2 The sensory evaluation on tobacco

結(jié)果表明使用菌液的煙葉內(nèi)在質(zhì)量有較大提升，煙氣協(xié)調(diào)性較好，香氣有提升，甜度增加，口感改善具有一定的作用。同時(shí)，可降低勁頭，減少雜氣、刺激，說(shuō)明菌液的作用效果顯著。

3　討論

本文所討論的菌種Y-P22分離自煙草葉際，以煙草浸出汁為培養(yǎng)基生長(zhǎng)良好，它比其它來(lái)源的微生物菌種更有利于定殖于煙草葉片；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該菌株能同時(shí)提高煙草質(zhì)量和產(chǎn)量。一方面，它可以產(chǎn)生細(xì)胞分裂素，在栽培期間噴施于葉片，可以有效的增加煙葉葉片面積，最高增加58.8%，大大提高了煙葉產(chǎn)量；另一方面，實(shí)驗(yàn)煙葉的感官質(zhì)量評(píng)吸結(jié)果較好，它提升了煙葉的內(nèi)在質(zhì)量，同時(shí)，可降低勁頭，減少雜氣、刺激。菌種Y-P22（Brevunmdimonas diminuta）原屬于假單胞菌屬，1994年Segers將其另立新屬－短波單胞菌屬（Brevunmdimonas）[7]。關(guān)于假單胞菌可產(chǎn)生香味物質(zhì)，降低煙堿含量[8-10]早有報(bào)道，我們的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這一結(jié)論。但是微生物的使用同時(shí)提高煙葉產(chǎn)量，提升煙葉質(zhì)量，屬于首次報(bào)道。利用微生物處理煙葉，可以降低煙堿含量，增加煙葉香氣，改善煙葉品質(zhì)，提高煙葉質(zhì)量等級(jí)，縮短發(fā)酵時(shí)間等優(yōu)勢(shì)[11-14]；還可以減少化肥施用帶來(lái)的土壤板結(jié)和環(huán)境污染問(wèn)題。從自然界篩選高效菌種資源，對(duì)于優(yōu)質(zhì)煙葉的生產(chǎn)具有深遠(yuǎn)的意義，微生物在煙草行業(yè)中的應(yīng)用具有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。

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Screening,Identification and Application of the Strain Y-P22Producing Cytokinins in Phyllosphere of Tobacco

SHAO Lan-jun1,LIU Kai2,LI Zhou-wen1,ZHANG Zhong-min3,ZHAO Wen-ting2, YAO Liang-tong2,DU Bing-hai2,DING Yan-qin2*
1.China Tobacco Guangdong Industry Co.Ltd.,Guangzhou 510000,China
2.CollegeofLifeSciences,ShandongAgriculturalUniversity/ShandongKeyLaboratoryofAgriculturalMicrobiology,Taian271018,China
3.Jining University,Jining 273155,China

The Y-P22 was identified as Brevundimonas diminuta based on morphological characteristics,physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA sequence.The strain was isolated from the tobacco phyllosphere.It can produce cytokinin.The results of field experiment and tobacco sensory evaluation showed that the strain could effectively improve the availability of tobacco and the quality of tobacco.

Tobacco;phyllosphere;cytokinin;Brevundimonas diminuta

TS41+4

A

1000-2324(2015)02-0194-04

2013-05-20

2013-06-02

廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司資助項(xiàng)目(粵煙工15XM-QK[2011]-001)

邵蘭軍(1984-),男,湖北荊州人,碩士,農(nóng)藝師,主要從事煙葉基地單元技術(shù)指導(dǎo)工作.

Author for correspondence.E-mail:dingyq6885@163.com