惡性腫瘤患者胸腔積液結(jié)核桿菌DNA檢測的臨床意義

楊亞利，彭小東，韓文群

成都市第二人民醫(yī)院 腫瘤科（成都 610017）

近年來，惡性腫瘤的發(fā)病率急劇增高，肺結(jié)核在全球的發(fā)病率呈增加趨勢。大多數(shù)惡性腫瘤患者年齡較大，免疫力低下，因此合并肺結(jié)核的概率大大增加［1］。對于惡性腫瘤患者，胸腔積液的性質(zhì)可能是結(jié)核性，也可能是癌性，也可能二者兼之。目前結(jié)核性胸膜炎的檢測方法有胸膜活檢、結(jié)核桿菌培養(yǎng)和涂片查結(jié)核桿菌等，但陽性率都較低。聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)自1985年以來因其快速、特異和敏感等優(yōu)點已廣泛應用于多個領(lǐng)域，取得了許多突破性進展［2］。本研究應用PCR技術(shù)檢測惡性腫瘤患者胸水中結(jié)核桿菌DNA，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2013年1月至2014年12月成都市第二人民醫(yī)院住院的惡性腫瘤（病理確診）伴胸腔積液患者121例，其中，男67例，女54例，年齡40～80歲。排除肝硬化、風濕免疫系統(tǒng)疾病、高血壓、糖尿病以及慢性支氣管炎等疾病。

1.2 材料

結(jié)核桿菌培養(yǎng)基為羅氏培養(yǎng)基，由上海科興生物科技有限公司提供。胸水標本來自于上述住院病人惡性腫瘤患者。結(jié)核桿菌引物及結(jié)核菌PCR診斷試劑盒，購自上海復華科技開發(fā)總公司生物技術(shù)開發(fā)中心。擴增儀購自華美生物工程公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 胸水涂片 離心（離心半徑3cm，轉(zhuǎn)速3 000r／min）取沉淀按常規(guī)方法涂片作抗酸染色鏡檢，結(jié)核桿菌培養(yǎng)鑒定按照中國防癆協(xié)會結(jié)核病細菌學檢查方法進行。

1.3.2 PCR檢測結(jié)核桿菌DNA 應用結(jié)核菌PCR診斷試劑盒，提取結(jié)核菌DNA，擴增過程中，92℃21min，92℃45s，55℃45s，72℃90s，循環(huán)35次，72℃5min延伸，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳分析，紫外檢測儀300nm下觀察，見123bp擴增帶為結(jié)核菌DNA陽性，同時設(shè)人型結(jié)核菌DNA擴增結(jié)果作為陽性對照，并另設(shè)陰性對照。

1.4 統(tǒng)計學方法

以患者結(jié)核桿菌DNA陽性（編碼1）和結(jié)核桿菌DNA陰性（編碼0）為因變量Y，設(shè)咳嗽、咯血、胸痛、發(fā)熱、盜汗、消瘦、貧血、性別、血性胸水、PPD試驗、胸水ADA、LDH、CEA和GLU等為自變量危險因素，進行l(wèi)ogistic回歸分析，P＜0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同惡性腫瘤類型結(jié)核桿菌檢測結(jié)果分析

121 例合并胸腔積液的惡性腫瘤患者，胸水涂片陽性率4.96%，胸水培養(yǎng)陽性率12.40%，而結(jié)核桿菌DNA陽性率15.70%，明顯高于前兩種檢測方法。其中在各種類型惡性腫瘤中，肺癌結(jié)核桿菌DNA陽性率最高，達20.00%，食管癌發(fā)生率最低（表1）。

2.2 惡性腫瘤結(jié)核性胸水的多因素分析

對惡性腫瘤結(jié)核性胸水進行多因素分析，研究發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤結(jié)核性胸水的危險因素為盜汗和胸水ADA水平高于正常，而與咳嗽、咯血、胸痛、發(fā)熱、消瘦、貧血、性別、年齡、血性胸水、PPD試驗、胸水LDH、CEA和GLU水平無關(guān)（表2）。

表1 不同惡性腫瘤類型結(jié)核桿菌檢測結(jié)果分析［n（%）］

表2 惡性腫瘤患者發(fā)生結(jié)核性胸水的多因素分析

3 討論

胸腔積液是胸膜腔內(nèi)液體的異常積聚，其病因以結(jié)核和惡性腫瘤多見。結(jié)核性胸膜炎的確診依據(jù)之一是在胸水中找到結(jié)核桿菌。一百多年來結(jié)核病的病原學診斷通常依賴于分支桿菌的抗酸染色和結(jié)核菌的培養(yǎng)，前者特異性和敏感性均低，后者敏感性低，且費時較長（通常4～8周），故兩者在臨床中的應用都受到了明顯限制。另一種方法是胸膜活檢，但胸膜活檢取材不易，且陽性率偏低［3］。聚合酶鏈反應（PCR）技術(shù)在傳統(tǒng)檢測方法檢查結(jié)果為陰性的標本包括胸水中，也能檢測結(jié)核菌DNA的存在，從而大大提高了結(jié)核病的診斷效率。整個過程僅需1～2d，尤其適合于結(jié)核性胸腔積液的早期診斷［4－5］。

本研究采用惡性腫瘤胸水PCR擴增的方法檢測結(jié)核桿菌DNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)121例合并胸腔積液的惡性腫瘤患者，胸水涂片陽性率4.96%，胸水培養(yǎng)陽性率12.40%，而結(jié)核桿菌 DNA 陽性率15.70%，遠遠高于胸水涂片和培養(yǎng)兩種檢測方法。對惡性腫瘤結(jié)核性胸水進行多因素分析發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤結(jié)核性胸水的危險因素為盜汗和胸水高ADA水平，而與咳嗽、咯血、胸痛、發(fā)熱、消瘦、貧血、性別、年齡、血性胸水、PPD試驗、胸水LDH、CEA 和GLU水平無關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)在各種類型惡性腫瘤中，肺癌結(jié)核桿菌DNA陽性率最高，達20.00%。很多學者注意到某些結(jié)核桿菌與病毒一樣可引起惡性腫瘤。迄今為此，已在宮頸癌、乳腺癌、胃癌和肺癌等多種腫瘤組織中分離出結(jié)核桿菌［6－7］。關(guān)于惡性腫瘤與結(jié)核感染的聯(lián)系，一般有兩種假設(shè)：一是結(jié)核桿菌感染發(fā)生在癌變之后，即過路感染；二是結(jié)核桿菌感染發(fā)生在癌變之前，并在瘤的形成中起一定作用［8］。研究［9］表明，細菌持續(xù)感染引起的慢性炎癥是惡性腫瘤發(fā)生的重要危險因素，可能通過炎癥介質(zhì)（如NO等）誘導癌變。

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種慢性傳染病，其病理變化過程中有大量的T淋巴細胞浸潤、活化，并伴有單核細胞浸潤、活化和轉(zhuǎn)變成巨噬細胞。腺苷脫氨酶（ADA）是活動性肺結(jié)核輔助性T淋巴細胞CD4＋的一種標志物，結(jié)核病是T淋巴細胞介導的細胞免疫［10］。本研究也發(fā)現(xiàn)ADA水平增高是惡性腫瘤結(jié)核性胸膜炎的危險因素，與上述研究結(jié)果一致。

總之，對合并胸腔積液的惡性腫瘤患者應常規(guī)行胸水結(jié)核桿菌DNA檢測，可降低結(jié)核病的漏診率，尤其應該注意合并盜汗和胸水高ADA水平的腫瘤患者。

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