尾吊大鼠恢復(fù)負荷后肌萎縮和骨丟失的差異響應(yīng)

楊 揚

西安市疾病預(yù)防控制中心（西安 710054）

失負荷引起的肌萎縮和骨丟失是衰老、長期臥床或微重力等條件下的適應(yīng)性病理變化［1－2］，采用合理的鍛煉方案恢復(fù)肌肉負荷是糾正失負荷引起的肌萎縮和骨丟失的有效方法。但是在恢復(fù)負荷過程中，下肢不同部位的肌萎縮與骨丟失的恢復(fù)有何特征還缺乏相關(guān)研究。本研究選擇大鼠尾吊模型，尾吊3周后恢復(fù)負荷1周，檢測大鼠比目魚肌、腓腸肌、脛骨前肌和趾長伸肌的肌萎縮及改善情況，同時分離大鼠股骨和脛骨，檢測骨密度與力學(xué)性能，為研究恢復(fù)負荷過程中骨骼肌和骨的生理／病理特征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

30只6 周齡雄性SD大鼠（購自上海斯萊克實驗動物中心），體質(zhì)量210～250g，隨機分為對照組、尾吊組和恢復(fù)組，每組10只。飼養(yǎng)于SPF級動物中心，12h／12h明暗環(huán)境。

1.2 動物模型制備及處理

對照組不進行尾吊；尾吊組從7周齡開始尾吊，尾吊3周；恢復(fù)組從6周齡開始尾吊，尾吊3周后，解除尾吊，恢復(fù)1周。對照組從6周齡開始計算體質(zhì)量。尾吊組和恢復(fù)組大鼠經(jīng)苯巴比妥鈉麻醉后，使用無菌的金屬骨針于第2、3尾椎骨間穿過，將金屬骨針彎成圓環(huán)，使用碘酒進行消毒處理后，用醫(yī)用紗布包裹傷口。通過金屬骨針的圓環(huán)將大鼠尾巴懸吊在尾吊鼠籠上方，使其后肢離地，前肢可與鼠籠底部接觸，且身體與鼠籠底部呈30°夾角。大鼠在籠內(nèi)能夠自由走動、進食和飲水。每天檢查尾部的傷口以防止感染，檢查并調(diào)整大鼠身體與鼠籠底部夾角，保證整個實驗中大鼠后肢不能接觸鼠籠底部或側(cè)壁。每周稱量1次體質(zhì)量，同時記錄其攝食量。

1.3 取材

經(jīng)苯巴比妥鈉麻醉的大鼠，脫臼處死后，快速取出心臟，兩側(cè)后肢的腓腸肌、比目魚肌、脛骨前肌和趾長伸肌，并稱重。然后立即取出其整條右后肢及左股骨，使用剪刀仔細剪去骨表面的結(jié)締組織和殘余肌肉，用經(jīng)生理鹽水濕潤的紗布將腿骨打磨干凈，然后再用生理鹽水濕潤的紗布將其包裹，于－20°C保存，用于后期骨密度及力學(xué)性能的測量。

1.4 骨密度及力學(xué)性能測定

股骨和脛骨的骨密度測定采用雙能量X線吸收法；力學(xué)性能采用三點彎曲法測定，包括屈服力，最大應(yīng)力，剛度，彈性模量，最大應(yīng)變及能量吸收。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 體質(zhì)量及攝食量

尾吊顯著抑制大鼠體質(zhì)量增加，但不影響其攝食。從尾吊的第2周開始，大鼠體質(zhì)量增長便受到顯著抑制。尾吊組在3周內(nèi)（7周齡至10周齡）的體質(zhì)量增量僅為對照組的50%左右（P＜0.01），而恢復(fù)組在4周內(nèi)（6周齡至10周齡）的體質(zhì)量增量為對照組的70%左右（P＜0.01），提示恢復(fù)負荷過程能部分改善尾吊對大鼠體質(zhì)量的影響。（表1和表2）

2.2 心臟及后肢骨骼肌質(zhì)量

各組大鼠的心臟質(zhì)量基本相等。在4種骨骼肌中，比目魚肌萎縮最嚴重，其次是腓腸肌，而脛骨前肌萎縮較輕，趾長伸肌沒有萎縮。為期7d的短期恢復(fù)負荷在肌萎縮方面僅有部分改善效果。其中，比目魚肌有輕微改善，但肌肉質(zhì)量及肌肉質(zhì)量／體質(zhì)量值都遠低于對照組（P＜0.05）。（表3）

表1 各組大鼠在尾吊及恢復(fù)過程中的體質(zhì)量值（n＝10，g，±s）

表1 各組大鼠在尾吊及恢復(fù)過程中的體質(zhì)量值（n＝10，g，±s）

注：相同時間點，與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 0周 1周 2周 3周 4周對照組 223.12±12.04 284.04±10.24 337.41±10.32 376.23±9.32 403.24±10.21尾吊組 225.22±12.31 281.23±8.41 298.14±6.22＊＊ 324.03±10.14＊＊ 340.33±12.20＊＊恢復(fù)組 224.20±8.41 257.04±8.24＊ 287.13±8.31＊ 320.24±10.22＊＊ 350.30±9.34＊＊

表2 各組大鼠體質(zhì)量的增量及總攝食量（n＝10，g，±s）

表2 各組大鼠體質(zhì)量的增量及總攝食量（n＝10，g，±s）

注：相同時間點，與對照組相比，＊P＜0.01

組別 體質(zhì)量增量3周 4周總攝食量3周 4周對照組 119.20±6.32 180.12±9.21 570.04±10.12 795.2 788.01±15.21 1±17.13尾吊組 59.11±5.21＊ － 601.13±17.10 －恢復(fù)組 － 126.20±5.24＊ －

表3 各組大鼠心臟和骨骼肌質(zhì)量及肌肉質(zhì)量／體質(zhì)量的比較（g，%，n＝10，±s）

表3 各組大鼠心臟和骨骼肌質(zhì)量及肌肉質(zhì)量／體質(zhì)量的比較（g，%，n＝10，±s）

注：＊ 與對照組比較，P＜0.05

組別體質(zhì)量對照 組 0.26±0.04 0.26±0.04 5.00±0.18 12.83±0.18 2.12±0.11 5.63±0.29 0.38±0.02 0.98±0.04 1.11±比目魚肌肌肉質(zhì)量 肌肉／體質(zhì)量腓腸肌肌肉質(zhì)量 肌肉／體質(zhì)量脛骨前肌肌肉質(zhì)量 肌肉／體質(zhì)量趾長伸肌肌肉質(zhì)量 肌肉／體質(zhì)量心臟肌肉質(zhì)量 肌肉／0.04 3.07±0.04尾吊組 0.13±0.02＊ 0.43±0.01＊ 3.57±0.15＊ 10.96±0.26＊ 1.69±0.09＊ 4.99±0.17＊ 0.30±0.01＊ 0.91±0.03＊ 1.07±0.04 3.28±0.07恢復(fù)組 0.18±0.03＊ 0.52±0.01＊ 3.43±0.13 10.59±0.24 1.63±0.07 4.91±0.17 0.29±0.01 0.89±0.03 1.13±0.03 3.26±0.05

2.3 后肢股骨、脛骨骨密度及股骨力學(xué)性能

尾吊引起股骨和脛骨的骨密度顯著降低（P＜0.05），而短期的恢復(fù)負荷不能改善骨密度降低，而且在7d的恢復(fù)負荷后，脛骨骨密度進一步下降（圖1）。同時，尾吊引起后肢股骨的力學(xué)性能改變，表現(xiàn)為屈服力，最大應(yīng)力，剛度，彈性模量，最大應(yīng)變及能量吸收均顯著降低（P＜0.05），短時間恢復(fù)負荷對股骨力學(xué)性能的改變沒有顯著改善作用，僅彈性模量、最大應(yīng)變及能量吸收明顯升高（P＜0.05）（表4）。

圖1 股骨及脛骨骨密度

表4 各組大鼠股骨力學(xué)性能的比較（n＝10，g，±s）

表4 各組大鼠股骨力學(xué)性能的比較（n＝10，g，±s）

注：與對照組比較，＊P＜0.05；與尾吊組比較，＃P＜0.05

屈服力／N 最大應(yīng)力／N 剛度／（N／mm）彈性模量／GPa 最大應(yīng)變／MPa 能量吸收／（N·mm）對照組 53.01±7.10 105.13±2.51 224.02±9.43 2.15±0.06 93.70±4.11 24.93±3.33尾吊組 24.42±3.71＊ 73.04±3.43＊ 175.03±12.84＊ 1.96±0.03＊ 73.43±2.22＊ 11.01±1.21＊恢復(fù)組 32.10±3.81 76.44±4.11 163.01±13.72 2.23±0.12＃ 92.34±3.12＃ 16.23±2.31＃

3 討論

長期臥床等廢用性病理條件下，會出現(xiàn)嚴重的骨丟失及肌萎縮。尾吊模型是模擬廢用條件下肌萎縮及骨丟失效應(yīng)的有效模型?；謴?fù)負荷可以有效糾正失負荷引起的骨丟失及肌萎縮。但是，各種不同類型的肌肉和骨在恢復(fù)負荷過程中可能存在不同的修復(fù)特征。本研究采用尾吊大鼠模型和恢復(fù)負荷模型，對這一現(xiàn)象進行了探索。

通過研究發(fā)現(xiàn)，尾吊主要引起骨骼肌萎縮，而對心肌影響較小。比目魚肌作為一種慢肌，是在后肢失負荷模型中最早被確認的萎縮肌肉［3］。除比目魚肌外，其它對失負荷敏感的肌肉依次為快肌中的腓腸肌和脛骨前肌，而趾長伸肌能夠耐受失負荷。同樣的，恢復(fù)負荷后，首先響應(yīng)的是比目魚肌，其它肌肉的恢復(fù)慢于比目魚肌，從而需要較長的恢復(fù)負荷時間。在Oishi等［4］的報道中，2周失負荷引起的比目魚肌萎縮在1周后基本恢復(fù)，可能的原因是其所用的大鼠周齡較小，處于生長期，恢復(fù)負荷后，肌肉生長能夠較快彌補失負荷的影響。而Flück等［5］也發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)負荷5d后比目魚肌的肌萎縮癥狀顯著改善。肌萎縮的恢復(fù)主要是蛋白合成升高引起，而非蛋白降解的下降［6］。同時，我們發(fā)現(xiàn)其他3種肌肉在恢復(fù)負荷后沒有顯著改善，因此不同肌肉在恢復(fù)負荷后恢復(fù)程度的差異需要進一步研究。

相對于肌萎縮的恢復(fù)，我們發(fā)現(xiàn)在恢復(fù)負荷過程中，骨丟失的恢復(fù)顯著落后于肌肉的恢復(fù)。在Allen等［7］的研究中也發(fā)現(xiàn)，恢復(fù)負荷在短期內(nèi)不能恢復(fù)脛骨骨密度。特別是在恢復(fù)負荷的早期（如本實驗中恢復(fù)負荷1周），骨丟失不僅未能顯著恢復(fù)，而且脛骨骨丟失在恢復(fù)負荷過程中進一步惡化，提示在臨床對癥治療中失負荷引起的骨丟失需要較長時間的恢復(fù)期，而且需要特別關(guān)注脛骨的骨密度改善情況。

此外，對于廢用性肌萎縮和骨丟失的恢復(fù)，除了恢復(fù)負荷外，同時補充鈣、磷、維生素D以及能夠改善肌肉功能的線粒體營養(yǎng)素［8］，可能有助于加快恢復(fù)過程。這些復(fù)合方案在肌肉廢用性患者或航天飛行人員的肌萎縮和骨丟失防治中可能具有應(yīng)用前景。

［1］陳善廣，李瑩輝.太空活動與生物節(jié)律——空間時間生物學(xué)，載人航天催生的新興學(xué)科［J］.Science ＆Technology Review，2007，25（10）：44－49.

［2］闞廣捍，吳斌，劉躍，等.模擬飛船應(yīng)急返回高過載對恒河猴心臟的 病 理 學(xué) 影 響 ［J］.中 國 比 較 醫(yī) 學(xué) 雜 志，2006，16（9）：532－532.

［3］Thomason DB，Booth FW.Atrophy of the soleus muscle by hindlimb unweighting［J］.Journal of Applied Physiology，1990，68（1）：1－12.

［4］Oishi Y，Ogata T，Yamamoto K，etal.Cellular adaptations in soleus muscle during recovery after hindlimb unloading［J］.Acta Physiologica，2008，192（3）：381－395.

［5］Flück M，Schmutz S，Wittwer M，etal.Transcriptional reprogramming during reloading of atrophied rat soleus muscle［J］.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2005，289（1）：4－14.

［6］Taillandier D，Aurousseau E，Combaret L，etal.Regulation of proteolysis during reloading of the unweighted soleus muscle［J］.The International Journal of Biochemistry ＆ Cell Biology，2003，35（5）：665－675.

［7］Allen MR，Hogan HA，Bloomfield SA.Differential bone and muscle recovery following hindlimb unloading in skeletally mature male rats［J］.Journal of Musculoskeletal and Neuronal Interactions，2006，6（3）：217.

［8］Liu J.The effects and mechanisms of mitochondrial nutrient alpha－lipoic acid on improving age－associated mitochondrial and cognitive dysfunction：an overview ［J］.Neurochemical Research，2008，33（1）：194－203.