缺氧環(huán)境對成牙骨質(zhì)細(xì)胞成骨功能調(diào)節(jié)的研究

吳 浩，韓紅娟，任小華，梁 琳

1.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院· 四川省人民醫(yī)院 口腔科（成都 610072）；2.四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院 藥學(xué)部（成都 610072）

成骨類細(xì)胞的成骨功能與細(xì)胞的生理功能息息相關(guān)，其功能表現(xiàn)主要為多種成骨相關(guān)蛋白表達(dá)的調(diào)控［1］，牙根表面的牙骨質(zhì)中大約含有45%～50%無機(jī)物（主要為羥基磷灰石）和50%有機(jī)物（主要為膠原及非膠原蛋白）。這些蛋白在正畸矯治引起的牙根吸收與修復(fù)平衡中發(fā)揮著重要作用［2］。成牙骨質(zhì)細(xì)胞在細(xì)胞特征、功能表達(dá)等多方面與成骨細(xì)胞有許多共性，大量的實驗研究［3］表明，缺氧能促進(jìn)成骨細(xì)胞內(nèi)的缺氧敏感基因表達(dá)，如堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteocalcin，OCN）、骨涎蛋白（bonesialoprotein，BSP）等，但卻很少見缺氧調(diào)控成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化功能的相關(guān)報道。本文擬對缺氧環(huán)境下成牙骨質(zhì)細(xì)胞成骨功能的調(diào)節(jié)作初步探討，為正畸牙移動提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗所使用的細(xì)胞為美國華盛頓大學(xué)Somerman教授實驗室提供的成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞株OCCM－30。相關(guān)研究［4］表明，OCCM－30細(xì)胞的主要性能完全符合成牙骨質(zhì)細(xì)胞功能特點，是成熟、穩(wěn)定的成牙骨質(zhì)細(xì)胞株體系，能作為研究成牙骨質(zhì)細(xì)胞相關(guān)調(diào)控功能的模型。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞缺氧模型構(gòu)建 采用德國Binder三氣培養(yǎng)箱，通過控制N2的輸入量，用傳感器來實現(xiàn)對O2濃度的實時精確控制。將細(xì)胞按1×105個／mL接種于中號培養(yǎng)瓶（50mL）內(nèi)，每瓶2mL，鏡下觀察細(xì)胞大部分貼壁后（約12h），將培養(yǎng)瓶轉(zhuǎn)移至三氣缺氧箱內(nèi)，當(dāng)氧氣濃度降至預(yù)設(shè)濃度時（1～2h），開始計時。缺氧組條件設(shè)置：2%O2、5%CO2、93%N2；對照組培養(yǎng)條件：20%O2、5%CO2、75%N2（細(xì)胞正常培養(yǎng)條件）。檢測時間點：0、6、12、24、36、48、72h。缺氧完成后按檢測手段分別收集細(xì)胞。

1.2.2 RT－PCR檢測 引物由寶生物公司代為合成 及 測 試。ALP 正 向 引 物：5＇－CCCCCCGTGG CAACTCTATCTT－3＇，反向引物：5＇－GTAGTTC TGCTCGTGGACGCCG－3＇。OCN 正 向 引 物：5＇－GTGCAGCCTTTGTGTCCAAG－3＇，反向引物：5＇－GTCAGCCAACTCGTCACAGT－3＇。BSP 正 向 引物：5＇－CTGAAGAAAAACGGGGTCTTTAAG－3＇，反向引物：5＇－ATTGGAGACGGCGATAGTTC－3＇。PCR反應(yīng)體系總體積20μL，包括PCR正向、反向引物各0.8μL，SYBR Premix Ex Taq 10μL，ROX Reference Dye（50×）0.4μL，ddH2O6μL，DNA模板2μL。設(shè)置好反應(yīng)條件后，計算機(jī)系統(tǒng)自動控制反應(yīng)并實時檢測，繪制擴(kuò)增曲線并分析，運用△Ct法來評價實驗結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。采用SNK法、單因素方差分析法（one－way analysis of variance，ANOVA）進(jìn)行比較，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OCCM－30細(xì)胞中ALP mRNA的表達(dá)變化

缺氧能顯著誘導(dǎo)ALP mRNA的表達(dá)，缺氧后6h，ALP mRNA的表達(dá)開始上調(diào)，12h達(dá)頂峰，此后開始下降，36、48及72h與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（圖1）。

圖1 OCCM－30細(xì)胞缺氧后ALP mRNA的表達(dá)變化

2.2 OCCM－30細(xì)胞中OCN mRNA的表達(dá)變化

缺氧環(huán)境OCN mRNA表達(dá)的調(diào)控表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，隨著缺氧的開始，OCN mRNA的表達(dá)逐步上調(diào)，在12h達(dá)峰值，然后再逐步下降，24、36h與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），48、72h表達(dá)較對照組低（P＜0.05）（圖2）。

圖2 OCCM－30細(xì)胞缺氧后OCN mRNA的表達(dá)變化

2.3 OCCM－30細(xì)胞中BSP mRNA的表達(dá)變化

總體上來講，缺氧能顯著抑制BSP mRNA的表達(dá)，隨著缺氧的開始，BSP mRNA的表達(dá)逐步下調(diào)，在24、36、48和72h，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。但12h時BSP mRNA表達(dá)較對照組高，可能是因為在缺氧早期，OCCM－30細(xì)胞的數(shù)量在短期內(nèi)繼續(xù)升高，造成BSP mRNA的相對數(shù)量較高。（圖3）

圖3 OCCM－30細(xì)胞缺氧后BSP mRNA的表達(dá)變化

3 討論

ALP能代表細(xì)胞成骨能力和分化成熟程度，是一類促進(jìn)鈣離子和無機(jī)鹽沉積的促礦化蛋白［5］，廣泛存在于細(xì)胞釋放的基質(zhì)小泡及成骨細(xì)胞的表面。在成骨活躍的細(xì)胞體系中，ALP的活性普遍增強(qiáng)［6］，因而被認(rèn)為是成骨活性的代表蛋白之一。成牙骨質(zhì)細(xì)胞與成骨細(xì)胞在功能上相似，成骨類細(xì)胞表達(dá)ALP得到了普遍認(rèn)可，但由于成牙骨質(zhì)細(xì)胞的特殊性，ALP在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)在不同研究中結(jié)果存在差異。Grzesik等［7］培養(yǎng)的成牙骨質(zhì)細(xì)胞不表達(dá)ALP mRNA或僅有極微量的表達(dá)。然而更多的文獻(xiàn)則表明ALP在成牙骨質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)與在成骨細(xì)胞中相似。Mada等［8］1995年報道在外源性前列腺素E2的誘導(dǎo)下，ALP活性顯著提高，證明外源性前列腺素E2上調(diào)ALP的活性及抑制礦化的作用是通過EP4途徑實現(xiàn)的。Bachra［9］則認(rèn)為，ALP能轉(zhuǎn)運磷酸基至細(xì)胞間質(zhì)中并降低抑制礦化因子的作用，是細(xì)胞分化的前期標(biāo)志。本研究支持成牙骨質(zhì)細(xì)胞表達(dá)ALP。缺氧開始后，ALP mRNA的表達(dá)較對照組顯著上調(diào)，在12h達(dá)峰值，但36h與對照組無差別；OCCM－30細(xì)胞缺氧后ALP活性呈現(xiàn)隨時間的起伏變化，在12、36h表達(dá)高于對照組，24、48h低于對照組。ALP mRNA在缺氧后的上升是細(xì)胞成骨能力在基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)，但隨著缺氧時間的延長，細(xì)胞整體活力下降，新陳代謝發(fā)生改變，抑制了從ALP mRNA翻譯為蛋白的機(jī)制，所以整體上ALP活性在蛋白水平變化不大。

作為骨形成、骨轉(zhuǎn)化的特征，OCN是一種由成骨細(xì)胞合成的廣泛存在于骨基質(zhì)（骨、牙骨質(zhì)及牙本質(zhì)）的非膠原蛋白，在成骨細(xì)胞成熟的最后階段（基質(zhì)礦化）表達(dá)。Pearson［10］認(rèn)為，保持骨正常的礦化速率，防止生成非正常磷灰石，控制發(fā)生礦化的起止邊界是OCN的主要功能，并隨著礦化速率的加快其表達(dá)增加。在對成牙骨質(zhì)細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)了類似的規(guī)律，OCN的表達(dá)量與細(xì)胞外礦化程度呈現(xiàn)正相關(guān)。Bodine等［11］在1999年的研究指出，OCN通過誘導(dǎo)、活化破骨細(xì)胞可以起到調(diào)控骨吸收的作用。本研究顯示，OCN mRNA的表達(dá)隨著缺氧時間延長而逐步上調(diào)，在12h達(dá)最高，隨后逐步下調(diào)，在24、36h與對照組相比無明顯差異，48h后明顯低于對照組，而OCN蛋白的表達(dá)量與mRNA的變化情況相似，在36h達(dá)峰值后逐步下降，在時效性上具有延后性。結(jié)果提示，短時間的缺氧能刺激成牙骨質(zhì)細(xì)胞的分化及礦化能力的表達(dá)，但長時間的刺激能抑制成牙骨質(zhì)細(xì)胞的礦化。

BSP是在牙骨質(zhì)剛開始形成時高表達(dá)的非膠原蛋白，其主要作用是控制磷灰石晶核的生成和發(fā)展。Alford等［12］指出，在牙骨質(zhì)發(fā)生礦化的過程中，形成的速度越快，所檢測到的BSP含量就越多，BSP與骨橋蛋白（OPN）一起相互作用，在牙骨質(zhì)的形成中起著不可替代的關(guān)鍵作用，其表達(dá)區(qū)域主要為牙根的表面。Nanci［13］的研究表明，成熟的成骨樣細(xì)胞能分泌高度磷酸化和硫酸化的BSP，同時還能促進(jìn)其他成骨樣細(xì)胞的聚集及黏附，有生理性吸收及修復(fù)現(xiàn)象的牙根在反轉(zhuǎn)線上，BSP的表達(dá)非常強(qiáng)烈，這說明BSP能抑制骨基質(zhì)的吸收并促進(jìn)礦化開始。本研究發(fā)現(xiàn)BSP mRNA的表達(dá)能被缺氧顯著抑制，且呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，這符合缺氧能抑制成骨的結(jié)論，但12h時BSP mRNA表達(dá)增高的原因有待進(jìn)一步研究。

ALP、OCN及BSP是成牙骨質(zhì)細(xì)胞礦化過程中非常重要的因子，綜合上述三個因子的mRNA表達(dá)變化，總體來說，短時間的缺氧能刺激OCCM－30細(xì)胞的成骨能力，隨著缺氧時間的延長，成骨功能被抑制。在正畸臨床中，長時間持續(xù)的加力能造成長時間的缺氧環(huán)境，抑制了牙槽骨內(nèi)的成骨細(xì)胞及牙根表面的成牙骨質(zhì)細(xì)胞的生物活性，甚至造成細(xì)胞、組織的病理性改變，出現(xiàn)牙根過度吸收，牙槽骨透明樣變化。持續(xù)的重力在正畸矯治過程中不僅不能加快牙移動的速率，反而會造成不良的副作用；相反間斷的輕力能在牙周膜中形成輕微的、短時間的缺氧環(huán)境，可以活化成牙骨質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞，既避免了副作用又加快了牙移動的速度。在此觀點上，本研究結(jié)果與臨床實踐較為一致。

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