NGAL重組蛋白的表達(dá)與純化及其促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的研究＊

劉 樺，楊曉龍，唐 麗，胡開鋒，劉明佳，劉 戟△

1.四川大學(xué)華西基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與法醫(yī)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室（成都 610041）；2.成都醫(yī)學(xué)院 生物醫(yī)學(xué)系（成都 610500）

結(jié)腸癌是我國(guó)高發(fā)癌癥之一，是發(fā)生于結(jié)腸部位常見的消化道惡性腫瘤，目前主要通過手術(shù)和化學(xué)藥物治療，但其預(yù)后欠佳［1］。約50%結(jié)腸癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，因此，尋找結(jié)腸癌早期篩查和評(píng)估預(yù)后的良好腫瘤標(biāo)志物一直是臨床研究的熱點(diǎn)。研究［2］表明，慢性炎癥是結(jié)腸癌的一個(gè)重要特征，炎癥因子通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，因此尋找炎癥標(biāo)志物有利于結(jié)腸癌的診斷。

中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)性脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase－associated lipocalin，NGAL）參與抗微生物、抗氧化應(yīng)激來保護(hù)正常組織。在一些炎癥性疾病中，炎癥因子促進(jìn)NGAL表達(dá)上調(diào)。近年來研究［3］發(fā)現(xiàn)，NGAL在腫瘤中的表達(dá)不均一，依組織類型不同而表現(xiàn)各異。NGAL能夠通過激活誘導(dǎo)表皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變（epithelialmesenchymal transition，EMT）來促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其有望成為一種潛在的結(jié)腸癌診斷標(biāo)志物［4］。本研究通過對(duì)NGAL與結(jié)腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移關(guān)系的研究，以評(píng)價(jià)NGAL對(duì)結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的潛在生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

PCDNA3.1－NGAL質(zhì)粒購(gòu)買于上海艾博思生物有限公司；pet32a－tev、E.coilDH5α菌株、BL21－DE3菌株來自實(shí)驗(yàn)室保存；BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶、T4連接酶、DNA Maker、蛋白質(zhì) Maker購(gòu)于Fermentas公司；DNA膠回收試劑盒購(gòu)于Tiangen公司；異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、基質(zhì)膠購(gòu)于Sigma公司；內(nèi)毒素（LPS）購(gòu)于Sigma公司；NGAL酶聯(lián)免疫試劑盒購(gòu)于武漢新啟迪生物科技有限公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，于－80℃凍存；NGAL抗體購(gòu)于 Cell Signal Technology公司，其余抗體購(gòu)于Santa Cruz公司；細(xì)胞培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)于 Gibco公司；PVDF膜和ECL顯影液購(gòu)于Millipore公司；X光膠片購(gòu)于Kodak公司；其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SW480在含10% 胎牛血清DMEM培養(yǎng)基中（100U／mL青霉素，100μg／mL鏈霉素），于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建 根據(jù)NGAL基因序列設(shè)計(jì)引物。上游引物5＇CGGGATCCATGCCCCTAG GTCTCCTGT 3＇，下劃線部分為BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；下游引物5＇CCCTCGAGTCAGCCGTCGATAC ACTGG 3＇，下劃線部分為XhoⅠ酶切位點(diǎn)。以pcdna 3.1－NGAL質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，按照回收試劑盒說明書純化回收目的片段。將NGAL基因純化產(chǎn)物與載體pet32a－tev分別用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收線性載體與目的基因片段［5］。將NGAL目的基因與pet32a－tev線性載體以2∶1用T4連接酶22℃連接1h后，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α中。挑取單克隆菌提質(zhì)粒，送公司（華大基因）測(cè)序。

1.2.3 NGAL的表達(dá)與純化將 pet32a－tev－NGAL載體轉(zhuǎn)化到BL21－DE3，涂在含100μg／mL氨芐青霉素的LB平板中，挑取單克隆于LB培養(yǎng)基中。加入IPTG（終濃度0.2mmol／L），18℃誘導(dǎo)過夜，離心半徑4cm，8 000r／min，離心15min，收菌。超聲波破碎后離心收集上清，經(jīng)親和層析后，獲得pet32a－tev－NGAL融合蛋白［6］。將融合蛋白經(jīng)tev酶4℃酶切過夜，離心收集上清，將上清過陽(yáng)離子樹脂，得到NGAL蛋白。

1.2.4 內(nèi)毒素檢測(cè) 參考試劑操作說明書，以注射用生理鹽水配制不同濃度內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品：0.25、0.125、0.062 5、0.031 25EU／mL，各取100μL加入檢測(cè)試劑中，取NGAL蛋白溶液100μL加入檢測(cè)試劑中。每個(gè)濃度重復(fù)3管，以生理鹽水為陰性對(duì)照，于37℃培養(yǎng)箱中保溫60min，以形成凝膠且不滑落為陽(yáng)性，反之為陰性。觀察NGAL的內(nèi)毒素含量。

1.2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 將生長(zhǎng)良好的SW480細(xì)胞以6×104個(gè)／孔接種于6孔板中，培養(yǎng)24h后，待密度達(dá)到90%以上時(shí)，用200μL的槍頭在6孔板中劃痕，PBS洗2次，加入50、100、200ng／mL 3個(gè)不同濃度NGAL雙無(wú)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。在48h時(shí)，照相觀察劃痕愈合情況。

1.2.6 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 采用24孔板懸掛式Transwell小室，將經(jīng)不同濃度NGAL處理48h后的細(xì)胞，PBS洗2次，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸。將200μL細(xì)胞懸液（3×105個(gè)／mL）加入上室，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基540μL加入24孔板下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，取出小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞，自然風(fēng)干后［7］，在顯微鏡下照相，低倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表體外遷移能力。

1.2.7 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 將ECM基質(zhì)膠按1∶5用無(wú)血清DMEM稀釋，取50μL均勻涂在Transwell小室底部膜上室面，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，使基質(zhì)膠自然聚合成凝膠。加入經(jīng)不同濃度NGAL處理48h后的細(xì)胞，PBS洗2次，用無(wú)血清培養(yǎng)液重懸。將200μL細(xì)胞懸液（4×105個(gè)／mL）加入上室，將含20%胎牛血清DMEM培養(yǎng)基540μL加入24孔板下室，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48h，取出小室，經(jīng)4%多聚甲醛固定后，結(jié)晶紫染色，用濕棉簽擦去膜上面未穿過膜的細(xì)胞，自然風(fēng)干后，在顯微鏡下照相，低倍鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)。最終以穿膜細(xì)胞的數(shù)目代表體外侵襲能力。

1.2.8 免疫印跡檢測(cè) 收集經(jīng)不同濃度NGAL處理后的細(xì)胞，按1×106個(gè)／mL細(xì)胞濃度加入100μL細(xì)胞裂解液，震蕩，冰上放置1h，4℃，離心半徑4cm，13 000r／min，離心15min，取上清液加上樣緩沖液，85℃加熱變性10min，樣品中蛋白經(jīng)BCA試劑盒定量，以確保蛋白上樣量一致。通過12%SDS－PAGE電泳分離后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上。分別加入一抗（一抗稀釋比例均為1∶1 000），4℃孵育過夜。用TBST洗膜后，辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1∶5 000），37℃孵育1h，TBST洗滌PVDF膜5次，每次10min，加入ECL顯影劑后，通過X光膠片曝光［8］。

1.2.9 ELISA檢測(cè)血清中NGAL的表達(dá)量 參考試劑盒說明書，將正常人血清30例及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌患者每期各30例，共150例的血清進(jìn)行檢測(cè)，以空白孔調(diào)零，酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm波長(zhǎng)下的吸收值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

ELISA實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄為450nm處的光吸收值，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞劃痕處為劃痕愈合程度，遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)中數(shù)據(jù)為穿過基質(zhì)膜的細(xì)胞個(gè)數(shù)。采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用成組設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NGAL與結(jié)腸癌分期成正相關(guān)

為研究NGAL與結(jié)腸癌惡化的關(guān)系，收集了不同腫瘤分期患者的血樣，通過ELISA實(shí)驗(yàn)對(duì)NGAL表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，隨著腫瘤的惡化，NGAL表達(dá)量逐漸增加，二者成正相關(guān)。其中，Ⅳ期血樣標(biāo)本中，NGAL含量高達(dá)（160±10）ng／mL，與Tis血液樣本比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 結(jié)腸癌各期NGAL表達(dá)量（n＝30，±s）

表1 結(jié)腸癌各期NGAL表達(dá)量（n＝30，±s）

注：與Tis比較，＊P＜0.05

Tis ⅠⅡⅢ Ⅳ結(jié)腸癌患者血液中 90±20 110±17 125±21 143±14 160±10＊NGAL含量／（ng／mL）

2.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白質(zhì)純化及內(nèi)毒素檢測(cè)

以pcDNA－NGAL載體為模板，進(jìn)行PCR，1%瓊脂糖凝膠電泳可見570bp左右的DNA片段，與預(yù)期一致。用BamHⅠ和XhoⅠ限制性內(nèi)切酶酶切載體pet32a－tev－NGAL后，1%瓊脂糖凝膠電泳可見570bp左右和6 000bp左右的DNA片段。構(gòu)建的重組質(zhì)粒測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)登陸序列一致（圖1）。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物

用蛋白純化儀過親和層析柱，高濃度咪唑梯度洗脫，在咪唑濃度為100mmol／L ～200mmol／L時(shí)出峰，12%SDS－PAGE電泳驗(yàn)證，可獲得純度較高的融合蛋白，經(jīng)tev酶酶切后，離子交換樹脂純化，在相對(duì)分子質(zhì)量25×103處有明顯的單一目的條帶與NGAL分子量大小相符。純化后的NGAL蛋白，經(jīng)15%SDS－PAGE分析后，進(jìn)行蛋白印跡鑒定，在相對(duì)分子質(zhì)量約為25×103處可見特異性雜交帶，表明為NGAL蛋白（圖2）。

圖2 純化后NGAL蛋白的檢測(cè)

內(nèi)毒素檢測(cè)：通過鱟試劑對(duì)純化獲得的NGAL蛋白進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)，結(jié)果為內(nèi)毒素含量＜0.125 EU／mg。

2.3 NGAL促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞遷移和浸潤(rùn)

為研究NGAL對(duì)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用，使用不同質(zhì)量濃度NGAL處理結(jié)腸癌細(xì)胞SW480 48h。通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)對(duì)其遷移和侵襲能力進(jìn)行檢測(cè)。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，NGAL處理組的細(xì)胞明顯向劃痕處生長(zhǎng)并靠攏，呈濃度依賴性。Transwell、基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)分別檢測(cè)NGAL對(duì)細(xì)胞遷移與浸潤(rùn)能力的影響，通過結(jié)晶紫染色并計(jì)數(shù)，NGAL處理組SW480比對(duì)照組細(xì)胞數(shù)明顯增多，由此可見，NGAL促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480轉(zhuǎn)移（圖3～5）。

圖3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NGAL促進(jìn)SW480轉(zhuǎn)移（×10）

圖4 Transwell檢測(cè)NGAL對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移能力的影響（×10）

圖5 基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NGAL對(duì)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞浸潤(rùn)能力的影響（×10）

2.4 NGAL激活EMT信號(hào)通路

50、100 、200ng／mL NGAL處理 48h后，SW480細(xì)胞中的E－cadherin明顯減少，并增強(qiáng)了N－cadherin和Vimentin的表達(dá)。同時(shí)，也增強(qiáng)了信號(hào)分子β－catenin的表達(dá)。結(jié)果表明，NGAL促進(jìn)SW480的遷移和浸潤(rùn)能力。在癌癥轉(zhuǎn)移過程中，惡性基因MMP－9、MMP－2的表達(dá)有助于細(xì)胞間基質(zhì)的降解［9］。同時(shí)，VEGF基因與結(jié)腸癌腫瘤血管生成、轉(zhuǎn)移和腫瘤生長(zhǎng)密切相關(guān)。本研究中，經(jīng)過NGAL處理后，細(xì)胞胞內(nèi)MMP－9、MMP－2 和VEGF的表達(dá)明顯增強(qiáng)（圖6）。

圖6 Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)標(biāo)志物

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的主要特征之一，是導(dǎo)致患者死亡的首要因素，是癌細(xì)胞與宿主細(xì)胞相互作用的連續(xù)復(fù)雜過程［10］。EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程，是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得遷移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程。N－cadherin、E－cadherin和βcatenin的改變導(dǎo)致了EMT的發(fā)生［11］。通過EMT過程，上皮細(xì)胞失去細(xì)胞極性，失去與基底膜的連接等上皮表型，獲得了較高的遷移與侵襲、抗凋亡和降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力等間質(zhì)表型［12］。因而，闡明調(diào)控惡性腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程的分子機(jī)制，并探索基于EMT關(guān)鍵分子的診斷方法及靶向EMT關(guān)鍵分子的治療手段是腫瘤轉(zhuǎn)移中EMT機(jī)制研究的關(guān)鍵性問題。

隨著對(duì)NGAL在腫瘤領(lǐng)域的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)和惡性腫瘤可誘使NGAL在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，并在腫瘤復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，NGAL參與了許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展，在不同的腫瘤中，NGAL的功能表現(xiàn)與作用機(jī)制不盡相同，且在腫瘤中的表達(dá)是不均一的，依組織類型不同而表現(xiàn)各異，其分子機(jī)制還有待闡明［13］。本研究利用基因工程的方法，構(gòu)建重組表達(dá)載體pet32a－tev－NGAL，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌（BL21－DE3）進(jìn)行表達(dá)，經(jīng)鎳柱親和層析純化，tev酶酶切，再過HIS柱純化，收集穿透峰獲得NGAL蛋白。Western blot結(jié)果表明，NGAL能夠激活腫瘤轉(zhuǎn)移的重要信號(hào)途徑——EMT途徑；ELISA結(jié)果表明，NGAL的表達(dá)量與不同分期腫瘤惡化程度成正相關(guān)。通過對(duì)NGAL激活EMT信號(hào)通路促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞SW480轉(zhuǎn)移的研究，有助于為結(jié)腸癌以及其他腫瘤發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制研究提供幫助，同時(shí)也有助于進(jìn)一步推進(jìn)相關(guān)腫瘤臨床診斷與治療的應(yīng)用基礎(chǔ)研究。

［1］呂強(qiáng)，邢沈陽(yáng)，趙志輝，等.結(jié)腸癌的研究現(xiàn)狀及展望［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2009，13（8）：1134－1137.

［2］Whiteside TL.The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth［J］.Oncogene，2008，27：5904－5912.

［3］蔣奶貴，許麗艷，郭明洲，等.腫瘤相關(guān)蛋白NGAL的生物學(xué)特征［J］.胃腸病學(xué)和肝病學(xué)雜志，2010，19（4）：297－300.

［4］Candido S，Maestro R，Polesel J，etal.Roles of neutroohil gelatinase－associated lipocalin in human cancer ［J］.Oncotarget，2014，5（6）：1576－1594.

［5］彭佳，王國(guó)華，陳坤，等.核心鏈霉親和素基因的克隆及其在大腸埃希菌中的表達(dá)［J］.現(xiàn)代檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，23（4）：1－3.

［6］吳明波，彭曉紅，溫華，等.乳酸桿菌中單寧酶基因的克隆、表達(dá)與純化［J］.四川大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2012，49（2）：479－483.

［7］Barresi V，Luciano R，Vitarelli E，etal.Neutrophil gelatinaseassociated lipocalin immunoexpression in colorectal carcinama：a stage－specific prognostic factor［J］.Oncology Letters，2010，1（6）：1089－1096.

［8］Broussard EK，Kim R，Wiley JC，etal.Identification of putative immunologic targets for colon cancer prevention based on conserved gene upregulation from preinvasive to malignant lesions［J］.Cancer Prevention Research，2013，6（7）：666－675.

［9］張可華，宋建國(guó).EMT與腫瘤［J］.生命的化學(xué)，2008，28（5）：523－526.

［10］Duvillard L，Ortega－Deballon P，Bourredjem A，etal.A case－control study of pre－operative levels of serum neutrophil gelatinase－associated lipocalin and other potential inflammatory markers in colorectal cancer［J］.BMC Cancer，2014，14：912.

［11］李亞玲，門占康，張煦，等.結(jié)直腸癌中NGAL和NGALR的表達(dá)及其臨床意義［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2013，29（3）：269－272.

［12］高鈞，孫燕，趙秀蘭，等.NGAL MMP－9和 E－cadherin在結(jié)腸癌中的表達(dá)及其預(yù)后的關(guān)系［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2011，38（6）：324－327.

［13］李慧，孫保存，劉志勇，等.NGAL基因表達(dá)上調(diào)與大腸腫瘤發(fā)生的關(guān)系研究［J］.中國(guó)腫瘤臨床，2011，38（5）：259－263.