高效佐劑對豬細小病毒和圓環(huán)病毒二聯滅活疫苗的免疫增強效果

張雪花， 張道華， 陸吉虎， 梅 梅， 華 濤， 唐 波， 侯繼波， 唐應華

(1.江蘇省農業(yè)科學院動物免疫工程研究所, 江蘇 南京 210014； 2.江蘇省農業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州 225009； 4.省部共建國家重點實驗室培育基地-江蘇省食品質量安全重點實驗室,江蘇 南京 210014)

豬細小病毒病 (Porcine parvovirus disease)和豬圓環(huán)病毒病(Porcine circovirus disease) 均能引起豬的繁殖障礙，是危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大疫病，分別是由豬細小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和豬圓環(huán)病毒 2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的。這2種疾病廣泛存在于世界各地種豬場，多表現為混合感染或繼發(fā)感染，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失[1]。目前，疫苗接種是有效防控PCV2和PPV的主要措施。國內PCV2和PPV商品疫苗多為全病毒滅活疫苗。但全病毒滅活疫苗主要激發(fā)機體產生體液免疫，抗體產生的時間比較長，需要抗原量較高；另外滅活疫苗誘導細胞免疫反應能力較弱，使用免疫增強佐劑是提高現有疫苗保護效力的有效途徑之一。

免疫增強佐劑可調節(jié)或增強機體的細胞及體液免疫能力，臨床上常與各種疫苗配合使用，可促進機體對抗原的特異性免疫應答，增強免疫效果。免疫增強佐劑的作用機理主要有增強機體單核-巨噬細胞的吞噬功能，促進淋巴細胞增殖及產生細胞因子，提高抗原的免疫原性和穩(wěn)定性等，使動物對病原微生物的抵抗力提高，防止或改善動物受到的免疫抑制，對傳染性疾病、特別是病毒性傳染病的防控有積極作用[2]。常用的免疫增強佐劑有CpG、Poly I: C、脂多糖(Lipolysaccharide，LPS)、咪喹莫特、胞壁酰二肽、左旋咪唑等[3-6]。

本實驗室(江蘇省農業(yè)科學院國家獸用生物制品工程技術研究中心)篩選獲得具有良好免疫增強作用的復方免疫增強佐劑VA5，對禽用和豬用疫苗均具有顯著的免疫促進作用。本研究用復方免疫增強佐劑 VA5與豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒二聯滅活疫苗混合，檢測其對這2種疫苗的增強效果。

1 材料與方法

1.1 材料

豬圓環(huán)病毒PCV2-DBN-SX07 ( GenBank No．: FJ660968 )、豬細小病毒PPV-JS(微生物保藏號是：CGMCC NO.6605)為本實驗室分離并儲存。

1.2 病毒增殖

利用PK-15 細胞增殖PCV2病毒，使病毒含量達到每1 ml 1×107TCID50；用ST細胞增殖豬細小病毒，病毒含量達到每1 ml 1×107.5TCID50，HA效價為1∶512。

1.3 PPV-PCV2二聯疫苗的制備

將PCV2與PPV用甲醛滅活，經滅活檢驗合格后，分別制備成豬細小病毒油乳劑滅活疫苗、豬圓環(huán)病毒油乳劑滅活疫苗，然后將豬細小病毒油乳劑滅活疫苗和豬圓環(huán)病毒油乳劑滅活疫苗1∶1混合，即為PPV-PCV2二聯疫苗。參照文獻[7]方法將VA5免疫增強佐劑配成油乳劑疫苗伴侶，將疫苗伴侶與PPV-PCV2疫苗按體積比1∶9混合，配制成含免疫增強佐劑的豬細小病毒和豬圓環(huán)病毒(二聯)油乳劑滅活疫苗，即PPV-PCV2-VA5。

1.4 動物試驗

1.4.1 BALB/c小鼠試驗 將125只 5 周齡BALB/c小鼠隨機分為5組，每組25只，分別為PPV-PCV2 0.30 ml免疫組、PPV-PCV2 0.15 ml免疫組、PPV-PCV2-VA5 0.30 ml伴侶疫苗免疫組、PPV-PCV2-VA5 0.15 ml伴侶疫苗免疫組和空白對照組。肌肉注射，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每組剖殺3只小鼠，分離淋巴細胞，用于淋巴細胞增值試驗；免疫后14 d、21 d和28 d眼球采血，分離血清，用于PCV2 ELISA抗體和中和抗體檢測；免疫28 d后用PCV2-DBN-SX07株(病毒滴度1 ml 1×106TCID50)攻毒，每只小鼠腹腔注射0.25 ml，每組10只，攻毒后21 d，無菌采集小鼠脾臟，每只小鼠稱取脾臟0.1 g，提取組織DNA，利用熒光定量PCR技術，檢測PCV2病毒載量。

1.4.2 豚鼠試驗 將100只350 g 左右的豚鼠隨機分為5組，每組20只，分別為PPV-PCV2 0.50 ml免疫組、PPV-PCV2 0.25 ml免疫組、PPV-PCV2-VA5 0.50 ml伴侶疫苗免疫組、PPV-PCV2-VA5 0.25 ml伴侶疫苗免疫組和空白對照組。肌肉注射，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每組剖殺3只，分離淋巴細胞，用于淋巴細胞增值試驗；免疫后14 d、21 d和28 d采血分離血清，檢測 PPV HI 抗體和中和效價；免疫后28 d用PPV-JS株攻毒，攻毒劑量為1 ml(病毒滴度1 ml 1×107.0TCID50)，攻毒方式為腹腔注射，每組5只，攻毒后21 d，無菌采集豚鼠脾臟，研磨，每只稱取脾臟0.1 g，提取脾臟組織DNA，利用熒光定量PCR技術，檢測PPV病毒載量。

1.5 抗體檢測

1.5.1 PCV2間接 ELISA抗體檢測 將原核表達的 PCV2 Cap 蛋白用包被液稀釋至5 μg/ml，以1孔100 μl包被酶標板，4 ℃包被過夜，洗滌，拍干后加入300 μl 5%的脫脂奶封閉 1 h，洗滌，然后1孔加入100 μl待檢血清(待檢血清 1∶100 稀釋后 2 倍系列稀釋至第 8 孔)，并設陰性對照和陽性對照，37 ℃反應1 h，洗滌，然后加入 1∶10 000 稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠二抗，1孔100 μl，37 ℃反應1 h，洗滌，拍干后加入底物 TMB，1孔100 μl，37 ℃避光顯色 15 min，最后加 2 mol/L 硫酸終止反應，1孔50 μl，10 min 內在酶標儀上讀取 450 nm 波長的OD值。結果判定：待檢血清OD450值大于 0.3 者判為陽性，以OD450值大于 0.3時的血清最大稀釋倍數作為該血清的 ELISA 抗體效價；稀釋的待檢血清OD450值與同稀釋度下陰性血清OD450的比值(P/N)≥2.1 為陽性，以P/N值不低于 2.1時的血清最大稀釋度作為該血清的 ELISA 抗體效價。

1.5.2 PCV2中和抗體檢測 將分離小鼠血清 56 ℃水浴滅活 30 min，12 000 r/min離心15 min除菌，然后連續(xù)倍比稀釋至1∶1 024，再與200TCID50的PCV-DBN-SX07株病毒液 1∶1混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱反應1 h，每個稀釋度作4個重復。反應完成后加入鋪滿單層PK細胞的96孔細胞板中，每孔加入100 μl混合液，并補加100 μl細胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。同時設陰性血清、陽性血清、病毒和正常細胞對照，4 d后進行間接免疫熒光檢測。

1.5.3 豬細小病毒血凝抑制抗體(HI) 檢測 將分離的100 μl血清 56 ℃水浴滅活 30 min 后，加入300 μl 25%白陶土懸液，混勻，置室溫下反應30 min，以10 000 r/min 離心 10 min，吸取上清，加入 100 μl 20% 的豚鼠紅細胞泥，振蕩混勻后37 ℃反應1 h，以4 000 r/min離心 10 min，收集上清即為1∶4稀釋的待檢豚鼠血清。向96孔微量反應板各孔中加入25 μl磷酸緩沖鹽溶液(PBS)，紅細胞對照孔中加50 μl PBS。第1孔中加入經處理的待檢血清25 μl，混勻，取出25 μl加至第2孔，依次類推，直至第10孔，棄去25 μl，此時待檢血清的稀釋度分別為1∶8、1∶16、……、1∶4 096。除紅細胞對照孔外，每孔中再加入4單位(HI=22)抗原工作液25 μl，此時第11孔即為病毒對照孔，振蕩混勻，置于37 ℃中反應1 h，每孔中加入0.5%豚鼠紅細胞懸液25 μl，振蕩混勻，置室溫下(25 ℃)反應2 h，觀察結果。結果判定：能抑制50%紅細胞凝集的血清最高稀釋倍數為被檢血清HI抗體效價。

1.5.4 豬細小病毒中和抗體檢測 將分離的豚鼠血清56 ℃水浴滅活30 min，12 000 r/min離心15 min除菌，連續(xù)倍比稀釋至1∶1 024后與200TCID50的PPV JS株病毒液1∶1混勻，放入37 ℃培養(yǎng)箱反應60 min，每個稀釋度作4個重復。反應完成后加入鋪滿單層ST細胞的96孔細胞板中，每孔加入100 μl混合液，并補加100 μl細胞培養(yǎng)液，放入37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。同時設陰性血清、陽性血清、病毒和正常細胞作對照，逐日觀察并記錄結果，觀察5～7 d。

1.6 淋巴細胞增殖試驗

在免疫后第 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每組分別取小鼠或豚鼠3只剖殺，無菌分離脾臟淋巴細胞，用1640完全培養(yǎng)基(含10%FBS)將淋巴細胞懸液稀釋為 1 ml 5×106個，然后以每孔100 μl加入96孔細胞板。每只小鼠或豚鼠脾淋巴細胞重復6孔，分2組(每組3孔)，一組每孔加入25 μg/ml的植物血凝素(PHA)刺激，另一組加入1640完全培養(yǎng)基(用作陰性對照)進行刺激。于37 ℃孵育 72 h后，每孔加入20 μl濃度為5 mg/ml的MTT，孵育4 h 后，吸棄上清液，加入100 μl二甲基亞砜(DMSO)，待結晶完全溶解后測定每孔OD570值。計算刺激指數(SI)，SI=A1/A0，式中A1為PCV2或PPV刺激孔的OD570平均值，A0為1640完全培養(yǎng)基處理孔的OD570平均值。刺激指數與免疫效力呈正相關性，即刺激指數值越高表示免疫效力越好。

1.7 Real-time PCR定量檢測PPV和PCV2

稱取相同質量的小鼠脾臟，按照DNA提取試劑盒(TaKaRa公司產品)說明書提取病毒DNA，Real-time PCR相關引物及反應體系參照王永帥等[8]的方法。PCV2上、下游引物序列分別為5′-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3′、5′-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3′；PPV上、下游引物序列分別為5′-CAACTACGCAGCAACTCCAAT-3′、5′-CAAAGCAGGCTCTTATGTCG-3′。Realtime-PCR反應體系：SYBR Premix ExTaqTM (TliRNaseH Plus)10.0 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，PCV2/PPV DNA 1.0 μl，加超純水補足20.0 μl。反應在羅氏熒光定量PCR儀上進行，反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。同時設置超純水陰性對照。用陽性質粒模版(本實驗室保存)進行實時定量PCR并繪制標準曲線，根據標準曲線方程計算樣品中PCV2和PPV核酸拷貝數。

1.8 數據分析

應用SPSS 軟件對數據進行統計分析，采用Duncan’s多重分析比較各組差異。

2 結 果

2.1 小鼠免疫后豬圓環(huán)病毒ELISA抗體水平

PCV2間接 ELISA抗體檢測結果顯示，首免后14 d，免疫組均產生了PCV2 ELISA 抗體，從14 d到28 d抗體水平逐漸增加。含免疫增強劑的PPV-PCV-VA5 0.30 ml、PPV-PCV-VA5 0.15 ml組抗體水平明顯高于不加免疫增強劑的PPV-PCV 0.30 ml、PPV-PCV 0.15 ml組，差異顯著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.15 ml組抗體水平與PPV-PCV 0.30 ml組抗體水平相當(圖1)。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖1 免疫后各試驗組小鼠 PCV2 ELISA 抗體水平Fig.1 PCV2 ELISA antibody level of each group post-immunization in BALB/c mice

2.2 小鼠免疫后豬圓環(huán)病毒中和抗體水平

對采集的小鼠血清進行PCV2中和抗體檢測，結果表明PPV-PCV 0.30 ml、PPV-PCV-VA5 0.15 ml、PPV-PCV-VA5 0.30 ml免疫組在第14 d時均檢測到中和抗體，中和抗體效價較低，PPV-PCV 0.15 ml組未檢測到中和抗體。含免疫增強佐劑的免疫組中和抗體水平明顯高于不含免疫增強佐劑的免疫組，差異顯著；免疫后28 d PPV-PCV-VA5 0.30 ml組中和效價遠遠高于其余免疫組(圖2)。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖2 免疫后各試驗組小鼠PCV2中和抗體水平Fig.2 PCV2 neutralizing antibody level of each group post-immunization in BALB/c mice

2.3 豚鼠免疫后豬細小病毒血凝抑制(HI) 抗體效價

分別在豚鼠免疫后14 d、21 d和28 d采血，分離血清檢測PPV HI 抗體效價。檢測結果(圖3)顯示，免疫后14 d PPV-PCV 0.50 ml組、PPV-PCV-VA5 0.50 ml組、PPV-PCV-VA5 0.25 ml組抗體效價高于1∶64(獸藥申報標準)，PPV-PCV 0.25 ml組在第21 d PPV HI 抗體效價剛剛達到1∶64；含免疫增強劑的PPV-PCV-VA5 0.50 ml組抗體水平遠遠高于PPV-PCV 0.50 ml組，差異顯著(P<0.05)，同樣含免疫增強劑的PPV-PCV-VA5 0.25 ml組抗體水平遠遠高于PPV-PCV 0.25 ml組，差異顯著(P<0.05)，其抗體水平與PPV-PCV 0.5 ml組抗體水平相當。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖3 免疫后各試驗組豚鼠PPV HI抗體水平Fig.3 PPV HI antibody level of each group post-immunization in guinea pig

2.4 豚鼠免疫后豬細小病毒中和抗體效價

免疫后14 d各免疫組均產生中和抗體，含免疫增強佐劑的免疫組中和抗體水平明顯高于不含免疫增強佐劑的免疫組，且差異顯著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml組中和抗體水平稍高于PPV-PCV 0.50 ml組，差異不顯著(P>0.05)；免疫后14 d、21 d和28 d PPV-PCV-VA5 0.50 ml組抗體水平一直最高，均明顯高于其余免疫組(圖4)。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖4 免疫后各試驗組豚鼠PPV 中和抗體水平Fig.4 PPV neutralizing antibody level of each group post-immunization in guinea pig

2.5 免疫增強佐劑對免疫小鼠和豚鼠淋巴細胞轉化活性的影響

在免疫后 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，每組分別取小鼠4只剖殺，無菌分離脾臟淋巴細胞，用PHA和1640完全培養(yǎng)基進行刺激，以計算刺激指數評價各免疫組小鼠脾臟淋巴細胞的增殖能力。免疫后3 d，各免疫組均出現不同程度的淋巴增值反應，隨著時間的增加，刺激指數逐漸升高，且含VA5免疫增強佐劑的疫苗組淋巴細胞轉化活性高于不含VA5免疫增強佐劑的疫苗組，特別是在7 d、9 d增加更加明顯，差異顯著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.15 ml組淋巴細胞轉化活性稍高于PPV-PCV 0.30 ml組，但差異不顯著(P>0.05)(圖5)。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖5 VA5免疫增強佐劑對免疫小鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響Fig.5 Effect of immunopotentiator VA5 on spleen lymphocyte proliferation from mice immunized with vaccine

在免疫豚鼠脾臟細胞增殖試驗中，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，對照組均未測到淋巴細胞增殖反應；免疫組在免疫后3 d、5 d、7 d、9 d均檢測到淋巴細胞增殖反應，含VA5 免疫增強佐劑的疫苗組淋巴細胞轉化活性高于不含VA5 免疫增強佐劑的疫苗組，差異顯著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml組淋巴細胞轉化活性與PPV-PCV 0.50 ml組相當(圖6)。

同一時間不同字母表示差異顯著(P<0.05)。圖6 VA5免疫增強佐劑對免疫豚鼠脾臟淋巴細胞增殖能力的影響Fig.6 Effect of immunopotentiator VA5 on spleen lymphocyte proliferation from guinea pig immunized with vaccine

2.6 VA5佐劑對免疫小鼠和豚鼠的免疫增強作用

攻毒后21 d，采集小鼠脾臟，提取脾臟組織DNA，利用熒光定量PCR技術檢測PCV2病毒載量。結果(圖7)顯示，免疫組PCV2病毒載量明顯低于對照組；相同免疫劑量條件下，含有免疫增強佐劑VA5的免疫組PCV2病毒載量明顯低于不含免疫增強佐劑的免疫組，差異顯著(P<0.05)。

1：PPV-PCV 0.15 ml組；2：PPV-PCV-VA5 0.15 ml組；3：PPV-PCV 0.30 ml組；4：PPV-PCV-VA5 0.30 ml組；5：對照。不同字母表示試驗組之間差異顯著(P<0.05)。圖7 免疫增強佐劑VA5對免疫小鼠攻毒后脾臟PCV2病毒含量的影響Fig.7 Effect of immunopotentiator VA5 on virus content in mice spleen after challenge with PCV2

攻毒后21 d，對照組豚鼠脾臟中 PPV病毒載量均顯著高于免疫組(P<0.05)。相同免疫劑量條件下，含有免疫增強佐劑VA5的免疫組PPV病毒載量明顯低于不含免疫增強佐劑的免疫組，差異顯著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml組與PPV-PCV 0.50 ml組病毒載量相當(圖8)。

1：PPV-PCV 0.25 ml組；2：PPV-PCV-VA5 0.25 ml組；3：PPV-PCV 0.50 ml組；4：PPV-PCV-VA5 0.50 ml組；5：對照。不同字母表示試驗組之間差異顯著(P<0.05)。圖8 免疫增強佐劑VA5對免疫豚鼠攻毒后脾臟PPV病毒含量的影響Fig.8 Effect of immunopotentiator VA5 on virus content in guinea pig spleen after challenge with PPV

3 討 論

VA5高效免疫增強佐劑中的聚肌胞(PolyI:C)、左旋咪唑、咪喹莫特等均為與動物相關模式識別受體結合的配體。PolyI:C是人工合成的多聚次黃嘌呤核苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸配對后的雙鏈產物，是一種高效干擾素誘生劑，能與巨噬細胞、樹突狀細胞表面的TLR3受體結合并激活細胞，增強機體的免疫應答[9]。左旋咪唑具有增強細胞功能，誘導T淋巴細胞成熟，增強外周 T 巨噬細胞和中性粒細胞的活性，還具有增加體液免疫和先天性免疫的作用[10-11]。本實驗室多年研究結果證明VA5免疫復方增強佐劑在禽用疫苗上具有良好的免疫增強作用，能提高禽流感疫苗對雞的免疫效力，有效延長抗體持續(xù)期，提高雞新法二聯苗、新流二聯苗對雞的免疫效力[12-15]。

BALB/c 小鼠和豚鼠是獸藥典中現有疫苗效力檢驗所用動物，豬圓環(huán)病毒效力檢測所用動物為小鼠，豬細小病毒效力檢測所用動物為豚鼠。因此，本研究將VA5佐劑以伴侶形式與豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒疫苗混合制備成含有VA5佐劑的豬細小病毒、豬圓環(huán)病毒疫苗，免疫動物BALB/c小鼠和豚鼠并攻毒。

已有文獻報道，VA5佐劑能提升豬細小-乙腦二聯滅活疫苗抗體效價[16]。本研究結果顯示，VA5佐劑能明顯提高豬圓環(huán)病毒ELISA抗體和中和抗體效價，同樣顯著提高豬細小病毒HI抗體和中和抗體效價?？贵w效果的提高更有利于動物機體對抗病毒的入侵，增加保護效果。淋巴細胞增殖試驗結果表明VA5能提高免疫小鼠和豚鼠的淋巴細胞轉化活性，淋巴細胞轉化率在免疫后第5 d急劇升高，說明VA5不僅提高了細胞免疫水平，而且縮短了細胞免疫產生的時間，使疫苗更快更好地對機體產生保護作用，這與唐應華等[17]在禽流感疫苗中結果一致。免疫攻毒保護試驗結果表明，含有VA5佐劑的免疫組PCV2或PPV病毒載量明顯低于不含VA5的免疫組。病毒載量的降低，更直觀地表明含有VA5免疫增強劑的疫苗可以有效地抑制病毒在機體內增殖、復制，從而達到保護動物機體的作用。在疫苗免疫劑量減少一半的情況下，含有VA5免疫增強佐劑的疫苗抗體效價稍高于或相當于常規(guī)疫苗抗體效價，這樣不僅可以降低疫苗生產成本，更可減少動物機體對疫苗的應激反應，增加動物的生產性能，這一結果與Peipei等[18]的研究結果一致。綜上所述，VA5免疫增強佐劑的添加不僅能夠提高動物機體的體液免疫應答和細胞免疫應答水平，增強對機體的免疫保護作用，而且還可以減少抗原量，降低成本，具有良好的應用前景。

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