高效液相色譜儀的應(yīng)用分析*

宋學(xué)英 楊 華 趙逸松 唐靜成

高效液相色譜儀的應(yīng)用分析*

宋學(xué)英①楊 華①趙逸松①唐靜成②*

目的：分析和解決高效液相色譜在使用過程中出現(xiàn)的多種技術(shù)問題。方法：總結(jié)高效液相色譜技術(shù)在使用過程常發(fā)生的柱壓力不穩(wěn)、基線噪音增大、色譜柱柱效下降以及化合物保留時間漂移等問題，提出了簡單有效的解決方法。結(jié)果：通過分析判斷，解決了高效液相色譜的技術(shù)問題，有效提高了儀器完好率和使用率，保證科學(xué)研究和教學(xué)工作的正常進行。結(jié)論：高效液相色譜儀的正確使用、保養(yǎng)和維護可以延長儀器的使用壽命，發(fā)揮儀器設(shè)備的最大效益。

高效液相色譜；故障分析；解決方法

[First-author’s address] Medical experiments and testing center, Capital Medical University, Beijing 100069, China.

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)儀具有高分離效率、高選擇性和高靈敏度特點，目前已成為化學(xué)、生物化學(xué)、醫(yī)藥衛(wèi)生、石油化工和環(huán)境保護等領(lǐng)域中不可缺少的檢測工具。然而，HPLC儀在使用過程中常會出現(xiàn)一些故障，如不能及時處理則會嚴重影響儀器的正常使用，從而阻礙實驗進展。本研究在介紹HPLC儀工作原理的基礎(chǔ)上，重點分析HPLC技術(shù)中常見故障的發(fā)生原因，并提出相應(yīng)的解決方案。

1 HPLC儀的工作原理

HPLC儀是由輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。流動相通過高壓泵注入色譜柱，由于樣品中不同組份在色譜柱中分配系數(shù)的不同，使得各組份在色譜柱中差速分離，被分離的每一單一組分逐一通過檢測器檢測，所得信號經(jīng)過數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄并加以存儲和計算，從而完成整個分析過程(如圖1所示)。

圖1 高效液相色譜儀工作原理示圖

2 HPLC儀應(yīng)用中的問題分析及其解決方法

2.1 色譜柱壓力不穩(wěn)

HPLC儀使用過程中最常出現(xiàn)的問題之一為色譜柱壓力不穩(wěn)，其原因為：①溶劑過濾頭被污染，由于水相非常容易生長霉菌，若溶劑過濾頭長時間浸泡在水相中則會被污染。解決方法是將溶劑過濾頭拔下，分別用水、甲醇溶劑及超聲清洗，如果過濾頭為玻璃材質(zhì)則不能超聲清洗，應(yīng)采用30%的硝酸浸泡，然后用去離子水清洗至中性；②單向閥被污染，單向閥的基本工作原理是流動相只能從閥的一端流入，另一端流出，即液體呈單向流動。單向閥的主要部件為寶石球和寶石球座，在使用含緩沖鹽的流動相后，若單向閥球座上有無機鹽細小固體顆粒的析出，會導(dǎo)致寶石球與球座密封性不好、流動相發(fā)生回流現(xiàn)象以及色譜柱壓力不穩(wěn)。解決方法是將單向閥小心拆卸下來，放入一盛有純凈水的小燒杯中，超聲15 min；將水換為甲醇，再超聲15 min，按指示方向裝入儀器即可[1-5]。

2.2 基線噪音增大

實驗過程中基線噪音增大的原因為：①紫外檢測器中氘燈的燈能量過低，解決方法是查看230 nm處的燈能量值，如能量值過低更換氘燈即可；②檢測器中的流通池被污染，判斷流通池是否被污染，可觀察參比池與樣品池?zé)裟芰康谋戎担魴z測器中的流通池被污染，樣品池的燈能量會遠遠低于參比池的燈能量，解決方法是將色譜柱卸下用一個兩通將系統(tǒng)連接起來，然后分別用去離子水、甲醇或乙腈和異丙醇沖洗流通池，流速為1 ml/min。觀察樣品池和參比池的燈能量，當(dāng)樣品池?zé)裟芰窟_到參比池?zé)裟芰康?0%～80%時提示檢測器的流通池沖洗干凈，基線噪音可恢復(fù)到正常水平；③如方法②不能使流通池沖洗干凈，可使用35%磷酸溶液和30%的硝酸溶液沖洗流通池，然后用純凈水將流通池和溶劑過濾頭沖洗至中性，最后用100%甲醇沖洗流通池和系統(tǒng)，此法可將檢測器中的流通池清洗干凈[2-6]。

2.3 色譜柱柱效下降

新的色譜柱使用時應(yīng)先用甲醇沖洗30 min，然后用標準樣品在HPLC儀上測試其性能，并記錄色譜柱的柱效。色譜柱使用一段時間后可根據(jù)污染物不同分別處理(見表1)。

表1 反相色譜柱被不同污染物污染的處理方法

圖2 色譜柱再生前、再生后及固定相修補后苯的色譜圖

實驗中出現(xiàn)肩峰、拖尾峰甚至是分叉峰，提示色譜柱分離效能會降低。此時再用最初使用的同一標準樣品測試其性能，柱效下降，表明色譜柱或是色譜預(yù)柱被污染。拆下色譜預(yù)柱運行樣品此現(xiàn)象消失，表明是色譜預(yù)柱被污染，直接更換預(yù)柱即可；如果此現(xiàn)象任然存在，則可能是色譜柱被污染(如圖2a所示)，經(jīng)再生后的效果如圖2b所示。如果用上述方法仍不能解決問題，可能是色譜柱進樣口端的填料被污染，此時只能通過去掉進口端的部分填料，填入新的同品牌、相同顆粒的固定相，將色譜柱擰緊，用甲醇或乙腈反復(fù)沖洗，讓固定相填充緊實、均勻，通過修補色譜柱提高柱效(如圖2c所示)[7-14]。

2.4 保留時間漂移

高效液相色譜數(shù)據(jù)采集過程中，同一化合物保留時間的改變是很多液相色譜使用者常碰到的問題，化合物保留時間增大和減小的現(xiàn)象均有發(fā)生，原因有多種：①系統(tǒng)未平衡，應(yīng)使用充足時間和流動相體積來平衡色譜柱，每次開機使用時平衡時間至少為0.5～1 h，在改變流動相時也需要0.5 h重新平衡色譜柱；②溫度變化，使用柱溫箱，每次實驗設(shè)定一個恒定的溫度，可保證所有實驗的溫度一致；③流動相的問題，使用的流動相預(yù)混合則要注意每次配液的準確性，即流動相中試劑比例要一致，尤其是需要調(diào)節(jié)流動相的pH值時，保證酸度計完好且精確，這樣每次配制的流動相才一致[15]。

3 結(jié)語

在HPLC技術(shù)中，上述故障的發(fā)生非常普遍，而針對這些故障發(fā)生的原因，結(jié)合HPLC儀管理經(jīng)驗，提出行之有效的解決辦法。貴重儀器常見故障的及時排除，可提高大中型儀器完好率，從而提高儀器的使用率，保證科學(xué)研究和教學(xué)工作的正常進行。高度重視對HPLC儀的保養(yǎng)和維護，可延長儀器的使用壽命，能夠有效發(fā)揮儀器的最大效益，更好地為科研和教學(xué)服務(wù)[16-17]。

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Application analyses of high performance liquid chromatography

SONG Xue-ying, YANG Hua, ZHAO Yi-song, et al// China Medical Equipment,2015,12(1):29-31.

Objective: To solve the difficulties and problems in the process of using high performance liquid chromatography. Methods: Summarizing the problems often occurred in this technology and providing some simple and effective solutions. Results: The instrument intact rate and utilization rate have been improved, which guarantees the scientific research and teaching. Conclusion: Proper maintenance of high performance liquid chromatography can prolong their service lives, and give play to their greatest benefits.

High performance liquid chromatography; Problems; Solutions

宋學(xué)英,女,(1964- ),大專，副主任技師。首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗與測試中心現(xiàn)代藥學(xué)研究測試室，從事高效液相色譜管理工作。

1672-8270(2015)01-0029-03

R197.39

A

10.3969/J.ISSN.1672-8270.2015.01.009

2014-03-18

北京市教委科技計劃(KM201310025006)“冬凌草水溶性組分的整體代謝譜及其結(jié)構(gòu)分析”；北京市屬高等學(xué)校高層次人才引進與培養(yǎng)計劃項目(CIT&TCD201304191)“基于LC-MS/MS指紋圖譜的冬凌草水提取物的代謝物組學(xué)研究”；首都醫(yī)科大學(xué)校長研究基金(14JYY016)“跨學(xué)科立體化的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)化學(xué)綜合性實驗項目的設(shè)計、開發(fā)與實踐”

①首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗與測試中心現(xiàn)代藥學(xué)研究測試室 北京 100069

②首都醫(yī)科大學(xué)化學(xué)生物學(xué)與藥學(xué)院 北京 100069

*通訊作者：jingcht@ccmu.edu.cn