固定化混合微生物對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)

許 燕，陳曉明，王 超，劉小玲，阮 晨，宋 收

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 綿陽(yáng) 621010；2.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，四川 綿陽(yáng) 621010）

鉻是工業(yè)上最廣泛應(yīng)用的金屬之一［1］。鉻的毒性主要來(lái)自于六價(jià)鉻［Cr（Ⅵ）］，其被列為對(duì)人體危害最大的8種化合物之一，是國(guó)際公認(rèn)的3種致癌金屬之一，同時(shí)也是美國(guó)EPA 公認(rèn)的129種重點(diǎn)污染物之一［2-3］。含Cr（Ⅵ）的廢水主要來(lái)源于印染、劣質(zhì)化妝品原料、制革、顏料、電鍍、冶金等行業(yè)［4-5］。由于鉻很容易穿透細(xì)胞膜引發(fā)各種急性和慢性疾病，因此含Cr（Ⅵ）廢水的處理厄待解決［6-8］。

傳統(tǒng)含Cr（Ⅵ）廢水的處理方法在不同程度上存在著各種缺陷［9-10］，對(duì)此許多學(xué)者、研究人員已將注意力從傳統(tǒng)方法上轉(zhuǎn)移到新型方法——生物法上［11-12］。本文將高效菌株以一定比例混合，經(jīng)過(guò)海藻酸鈉（SA）固定后處理含Cr（Ⅵ）廢水，探討混合后的微生物和固定化混合微生物技術(shù)對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)［13］，以為處理含Cr（Ⅵ）廢水尋找高效菌株提供新的途徑，也為從混合菌株方面提高固定化微生物技術(shù)處理Cr（Ⅵ）的效率提供有效措施。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 主要試劑和儀器

試劑：DPC（二苯基碳酰二肼，分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）；重鉻酸鉀（分析純，成都市科龍化工試劑廠）；LB培養(yǎng)基。

儀器：GH 型隔水培養(yǎng)箱（天津泰斯特儀器有限公司）；SW-CJ-1F 超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；THZ-98AB型恒溫振蕩器（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SPECORD 200PLUS型紫外可見分光光度計(jì)（德國(guó)耶拿分析儀器股份公司）。

1.1.2 供試菌株

Ua菌株：萎縮芽孢桿菌（Bacillus atrophaeus），從若爾蓋鈾礦堆分離而得的優(yōu)勢(shì)菌株。

XJ-Ⅱ菌株：枯草芽胞桿菌（Bacillus subtilis），從新疆鹽堿地分離而得的優(yōu)勢(shì)菌株。

HB 菌株：枯草芽孢桿菌黑色變種（Bacillus subtilis var.），從中國(guó)微生物菌種保藏中心購(gòu)買。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 Cr（Ⅵ）溶液濃度測(cè)定方法

采用二苯碳酰二肼分光光度法（GB 7466—87）［14］測(cè)定Cr（Ⅵ）溶液的濃度。

1.2.2 單一菌株的性能研究

將HB菌、Ua菌和XJ-Ⅱ菌分別接種于不同濃度的Cr（Ⅵ）溶液中，探討其對(duì)Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效應(yīng)。取斜面培養(yǎng)得OD600=0.8 的種子液，以10%的接種量接種于含不同濃度Cr（Ⅵ）的液體培養(yǎng)基中；60h 內(nèi)每隔一段時(shí)間取出一定量液體，測(cè)量菌液的OD600值，每次3個(gè)重復(fù)（下同），以培養(yǎng)基為對(duì)照；離心取上清液，測(cè)量溶液中殘留的Cr（Ⅵ）濃度，以純水為對(duì)照。

1.2.3 混合菌株的性能研究

將3種菌株的種子液以1∶1∶1的比例混合及兩兩之間以1∶1的比例混合，分別以10%的接種量接種于含不同濃度Cr（Ⅵ）的液體培養(yǎng)基中；120 h內(nèi)每隔一段時(shí)間取出一定量液體，測(cè)量菌液的OD600值，以培養(yǎng)基為對(duì)照；離心取上清液，測(cè)量溶液中殘留的Cr（Ⅵ）濃度，以純水為對(duì)照。

1.2.4 混合菌株的固定化研究

由于游離菌株處理廢水后仍然分散于廢水中，其分離難度大，后期處理不易，而固定化技術(shù)恰好可以解決這一問題，因此本試驗(yàn)對(duì)其進(jìn)行了固定化研究。由早期研究得知，40%LB培養(yǎng)基足以提供菌體生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)，因此繼續(xù)采用40%LB 培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)研究。

取100mL培養(yǎng)36hOD600=3.5的混合菌株離心后的沉淀，溶入10mL 終濃度為1.5%的SA 溶液中，攪拌均勻后滴入1%CaCl2溶液中，固定化1h后取出，生理鹽水洗凈，備用。

在40mg／L的Cr（Ⅵ）溶液中添加40% LB 培養(yǎng)基，用固定化混合微生物顆粒處理100 mL 上述溶液；96h 內(nèi)每隔一段時(shí)間測(cè)量溶液中殘留的Cr（Ⅵ）濃度，以固定化顆粒為對(duì)照。

2 結(jié)果與討論

2.1 單一菌株的性能研究

分別以10%的接種量接種HB菌、Ua菌和XJ-Ⅱ菌到含不同濃度Cr（Ⅵ）的液體培養(yǎng)基中，考察其對(duì)Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效應(yīng)，其試驗(yàn)結(jié)果見圖1和圖2。

由圖1可知：在40mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液中，接種HB菌的溶液OD600值在48h時(shí)達(dá)到最大，為4.6左右；接種Ua菌和XJ-Ⅱ菌在加入Cr（Ⅵ）溶液后，OD600值降低，說(shuō)明有Cr（Ⅵ）存在時(shí)，這兩種菌體生長(zhǎng)受到抑制，耐受性變差，生長(zhǎng)速率變慢；而HB 菌在40mg／L的Cr（Ⅵ）溶液中穩(wěn)定期的OD600值大于對(duì)照組的OD600值，可能是由于HB 菌對(duì)低濃度Cr（Ⅵ）有較強(qiáng)的耐受性，因此在低濃度Cr（Ⅵ）的刺激作用下，OD600值上升；之后HB 菌在60mg／L 的Cr（Ⅵ）濃度下，可能由于Cr（Ⅵ）濃度增大對(duì)其產(chǎn)生抑制作用，HB菌的耐受性降低，導(dǎo)致OD600值降低?？傊?，不同菌對(duì)Cr（Ⅵ）的耐受性能不同，3種菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的耐受性依次為HB菌＞Ua菌＞XJ-Ⅱ菌。

由圖2可知：3種菌株均在48h時(shí)趨于Cr（Ⅵ）的最大去除率，其中Ua菌和XJ-Ⅱ菌對(duì)40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率僅為60%左右，而HB菌對(duì)40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率達(dá)到98%左右，對(duì)60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率也能達(dá)到81%以上，說(shuō)明不同的菌株對(duì)Cr（Ⅵ）有不同的去除效果，3種菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的去除能力依次為HB菌＞Ua菌＞XJ-Ⅱ菌。

張 慧［15］用曲霉（Aspergillus sp.）處 理20 mg／L的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率達(dá)到97.9%；金科等［16］用黃孢原毛平革菌吸附40 mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率為60%左右；相比之下，本文采用的3種菌株處理40mg／L 和60mg／L 的Cr（Ⅵ）溶液，Cr（Ⅵ）的去除率是相當(dāng)可觀的。

2.2 混合菌株的性能研究

不同菌株之間存在協(xié)同或拮抗作用，協(xié)同作用可提高對(duì)Cr（Ⅵ）的吸附效率。為了得到具有協(xié)同作用的混合菌株，將3種菌株的種子液以1∶1∶1的比例混合及兩兩之間以1∶1的比例混合后，分別以10%的接種量接種于60mg／L Cr（Ⅵ）的液體培養(yǎng)基中，考察其對(duì)Cr（Ⅵ）的耐受性和去除效應(yīng)，其試驗(yàn)結(jié)果見圖3至圖4。

由圖3可知：HB菌與XJ-Ⅱ菌組合和HB菌與Ua菌組合OD600最大值均為4.7左右，而Ua菌與XJ-Ⅱ菌組合OD600最大值只有0.8左右；同圖1相比，HB菌與XJ-Ⅱ菌組合和HB 菌與Ua菌組合的混合菌株OD600值大于單一菌株OD600值，而Ua菌與XJ-Ⅱ菌組合的混合菌株OD600值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于單一菌株OD600值，說(shuō)明前兩種組合可能存在協(xié)同作用，后一種組合可能由于拮抗作用，菌體幾乎不生長(zhǎng)，導(dǎo)致OD600值大大降低；而3 種菌株混合的組合可能由于同時(shí)存在協(xié)同和拮抗作用，因此其OD600值在單一菌株OD600值之間。

由圖4可知：HB菌與XJ-Ⅱ菌組合和HB菌與Ua菌組合對(duì)60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的最大去除率均達(dá)到92%左右，而Ua菌與XJ-Ⅱ菌組合對(duì)60mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的最大去除率僅31%左右；同圖2比較，HB 菌與XJ-Ⅱ菌組合、HB菌與Ua菌組合對(duì)60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率比單一菌株Ua 菌、XJ-Ⅱ菌對(duì)40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）和HB菌對(duì)60mg／LCr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）的去除率均大，說(shuō)明這兩個(gè)組合可能存在協(xié)同作用，使其去除率增大；而Ua菌與XJ-Ⅱ菌組合對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率比其單一菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率降低較多，說(shuō)明這一組合之間不僅沒有協(xié)同作用，還可能存在拮抗作用，導(dǎo)致其去除率降低。由于HB 菌與XJ-Ⅱ菌組合和HB 菌與Ua菌組合均具有較強(qiáng)的協(xié)同作用，因此將其用于進(jìn)一步的固定化研究。

何麗媛等［17］將從污染土壤中分離篩選到的4株石油組分降解菌用于組建降解原油的混合菌體系來(lái)處理原油，得到處理原油的最佳組合，其總?cè)コ蔬_(dá)69.20%，比單菌提高了近30%；陳麗華等［18］用混合菌劑對(duì)石油污染土壤進(jìn)行降解，結(jié)果表明加入高效降解混合菌的石油降解率提高了20%以上。本研究中采用混合微生物技術(shù)處理含Cr（Ⅵ）廢水，混合微生物對(duì)60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率比單一菌株Cr（Ⅵ）的最大去除率還要提高10%以上。

2.3 混合菌株的固定化研究

由于固定化技術(shù)可以解決游離微生物的一些關(guān)鍵缺陷，因此本研究將利用混合微生物進(jìn)行固定化處理含Cr（Ⅵ）廢水。

將100mL OD600=3.5的混合菌株離心后的沉淀進(jìn)行固定化，再用其處理100mL含40%LB培養(yǎng)基的Cr（Ⅵ）濃度為40mg／L 或60mg／L 的溶液，考察混合菌株對(duì)Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)，其試驗(yàn)結(jié)果見圖5至圖6。

由圖5 可知：兩個(gè)試驗(yàn)組的組合對(duì)40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）均有較好的去除效果，在60 h時(shí)其去除率分別達(dá)到88%和98%左右；同圖2相比，HB菌與XJ-Ⅱ菌組合對(duì)40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率略小于HB 菌單獨(dú)對(duì)40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于XJ-Ⅱ菌單獨(dú)對(duì)40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，這可能是固定化后對(duì)菌體的活力有損害，加上混合菌之間的協(xié)同作用共同作用的結(jié)果；HB菌與Ua菌組合大于單一菌株對(duì)40 mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，這可能是由于HB 菌與Ua菌組合的協(xié)同作用稍大于HB 菌與XJ-Ⅱ菌組合，去除固定化后菌體的活力損傷，但仍可得到較高的Cr（Ⅵ）的去除率。說(shuō)明固定化后對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率不僅與混合菌之間的協(xié)同作用有關(guān)，還可能與菌體固定化后活力損失有關(guān)。經(jīng)固定化后活力損失較小且具有較高協(xié)同作用的混合菌體，對(duì)低濃度Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率不僅不會(huì)降低，還可解決游離微生物處理Cr（Ⅵ）的缺陷，即耐毒害能力較弱、菌種流失較多、不具有可重復(fù)操作性、后期處理不易等缺陷。

由圖6 可知：兩個(gè)試驗(yàn)組的組合對(duì)60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中的Cr（Ⅵ）在60h時(shí)的去除率差異不顯著，分別為75%和70%左右；同圖2相比，兩個(gè)組合對(duì)60mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率高于單一菌株Ua菌和XJ-Ⅱ菌對(duì)40mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，略低于HB 菌對(duì)60 mg／L Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率，這可能是固定化后菌體的活力有損害、混合菌之間的協(xié)同作用以及40 mg／L Cr（Ⅵ）溶液對(duì)HB菌有促進(jìn)作用而60mg／L Cr（Ⅵ）溶液對(duì)HB 菌有抑制作用共同作用的結(jié)果。此外，相同條件下還進(jìn)行了固定化混合微生物技術(shù)對(duì)80mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除效應(yīng)研究，結(jié)果表明兩個(gè)組合對(duì)80 mg／LCr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率趨勢(shì)同圖6相似，說(shuō)明具有協(xié)同作用的菌體固定化后，對(duì)較高濃度Cr（Ⅵ）溶液中Cr（Ⅵ）的去除率略微降低，但仍可達(dá)到較好的去除效果。

綜上可知，混合菌株經(jīng)固定化處理后對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率與游離菌對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率相同或略微降低，但仍可以達(dá)到較高的去除率，最高可達(dá)98%以上。由于固定化技術(shù)解決了游離菌不易分離、后期處理不易等缺陷，并且在其他行業(yè)已有實(shí)施案例，因此固定化混合微生物對(duì)Cr（Ⅵ）的去除在實(shí)際生產(chǎn)中是可行的。

3 結(jié)論

本文從混合微生物種類和固定化技術(shù)等方面對(duì)Cr（Ⅵ）的微生物去除效應(yīng)進(jìn)行了研究，得到如下結(jié)論：

（1）HB菌的耐受性和對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率在3種菌株中是最好的，在40 mg／LCr（Ⅵ）溶液中OD600值可達(dá)4.6，對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率可達(dá)98%左右，其次是Ua菌，最后是XJ-Ⅱ菌。

（2）混合菌株組合中，HB 菌與Ua菌組合和HB菌與XJ-Ⅱ菌組合均表現(xiàn)出協(xié)同作用。其中HB菌與Ua菌組合的OD600值和對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率更高，在60 mg／LCr（Ⅵ）溶液中分別為4.7 和92%。

（3）混合菌株經(jīng)固定化處理后，HB菌與Ua菌組合對(duì)Cr（Ⅵ）的去除率較高，在40mg／LCr（Ⅵ）溶液中其去除率可達(dá)到98%以上。

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