鏈霉素廢水對斑馬魚POD 活性和GSH 含量的影響

李 敏，趙 月，曹志會，王 冰，周可心，沈洪艷

（1.河北科技大學環(huán)境科學與工程學院，河北 石家莊 050080；2.河北省藥用分子化學實驗室，河北 石家莊 050080）

鏈霉素廢水COD 濃度高，成分復雜，碳氮比偏低，含有較多的甲醛、草酸等生化抑制物質(zhì)，可生化性差［1-2］。目前處理抗生素廢水的技術主要有物化處理技術、好氧生物處理技術、厭氧生物處理技術和厭氧-好氧組合處理技術。如潘碌亭等［3］采用水解酸化-改良SBR（MSBR）-強化絮凝組合工藝處理某制藥工業(yè)區(qū)廢水，結(jié)果表明該處理工藝對廢水中COD、BOD5和氨氮的去除率分別為80%、90%和82%；Chen等［4］采用UASB 處理高濃度6-APA 和青霉素混合廢水，結(jié)果表明UASB反應器對廢水中COD、6-APA 和青霉素的去除率分別為52.2%、26.3%和21.6%。目前，制藥企業(yè)污水處理廠和城市污水處理廠的污水處理工藝對制藥廢水中的污染物質(zhì)去除仍不夠徹底［5-7］。沈洪艷等［8］采用暴露試驗法研究了青霉素、土霉素混合廢水的出水不同暴露濃度對斑馬魚肌肉組織中超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）的影響，結(jié)果表明該廢水對斑馬魚機體造成了一定的氧化損傷；此外，她還研究了鏈霉素廢水對錦鯉魚抗氧化酶和MDA 含量的影響，結(jié)果表明錦鯉魚長期暴露于鏈霉素廢水中會對其抗氧化防御系統(tǒng)及抗氧化能力產(chǎn)生影響［9］。因此，研究鏈霉素廢水對斑馬魚是否具有生物毒性以及毒性水平具有重要的實際意義，并且可以為制藥廢水處理技術的效果評估提供毒理學依據(jù)。

斑馬魚（Danio rerio）屬于鯉科鮐屬淡水魚，已成為國際標準化組織推薦的模式生物，在基因胚胎［10-12］等領域得到了廣泛的應用。本文選用斑馬魚為模式生物，通過對其抗氧化指標的測試，研究鏈霉素廢水對斑馬魚的毒性作用及毒性效應，旨在為環(huán)境中鏈霉素廢水污染監(jiān)測指標提供理論依據(jù)。

過氧化物酶（POD）存在于真核生物細胞的過氧化物酶體中，以鐵卟啉為輔基，能催化過氧化氫氧化酚類，產(chǎn)物為醌類化合物，并且能夠調(diào)節(jié)氧含量，使細胞免受高濃度氧毒害［13］。還原型谷胱甘肽（GSH）是一種低分子清除劑，也是動物體內(nèi)重要的水溶性抗氧化劑，它在組織細胞代謝過程中有多種生理功能，概括起來主要有兩個方面：一是解毒及細胞保護功能；二是抗自由基和抗氧化應激功能。GSH 是保護機體組織細胞使其避免氧化機制及自由基攻擊的一種極其重要的氧自由基清除劑。有研究表明，細胞內(nèi)自由基的水平及其代謝狀況決定著細胞的生死存亡［14］。POD 和GSH 作為清除自由基的兩種重要的抗氧化物質(zhì)，其受應激后的變化可以間接反映這種危害的強弱。已有研究表明，機體抗氧化酶活性的變化（升高或降低）表示機體內(nèi)活性氧的大量增加，并已擾亂機體抗氧化防御系統(tǒng)的正常功能［15］。

為了解鏈霉素廢水在處理前對水生生物的毒性效應，本文采用某鏈霉素生產(chǎn)企業(yè)的廢水進行斑馬魚暴露試驗，測定斑馬魚的抗氧化指標，從而確定鏈霉素廢水對斑馬魚是否具有毒性效應及其效應影響程度。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器和試劑

試驗儀器：UV-2550 型紫外可見分光光度計（島津公司）；DK-S26型恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設備有限公司）；TG16-WS 臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；JPBJ-608型便攜式溶解氧測定儀（上海精密科學與儀器有限公司）；EL204型電子分析天平（梅特勒-上海托利多有限公司）；FE20 型pH 計（梅特勒-上海托利多有限 公司）；XK96-B型快速混勻器；SYZ-A 型石英亞沸高純水蒸餾器；微量移液器若干；玻璃組織勻漿器若干；微型溫度計和水硬度計（WAD-TH）等。

試驗試劑：POD、GSH 和考馬斯亮蘭試劑盒，均購于南京建成生物工程研究所。蛋白含量采用考馬斯亮蘭蛋白試劑盒測試；GSH 含量和POD 活性均采用GSH、PCD 試劑盒測試。通常將在37 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1μg底物的酶量定義為一個過氧化物酶活力單位。

1.2 受試生物

選用斑馬魚（Danio rerio）為受試生物，由石家莊水產(chǎn)養(yǎng)殖基地提供，體長為（34.05±0.43）mm，體質(zhì)量為（0.24±0.03）g，魚苗經(jīng)5%食鹽水消毒后進入實驗室。試驗用水為曝氣充氧除氯24h以上的自來水，水溫維持在（27±1）℃，pH 值為6.5～7.5，溶解氧（DO）為5.0mg／L 以上，水質(zhì)符合漁業(yè)水質(zhì)標準，馴養(yǎng)期間斑馬魚死亡率小于4%。為防止餌料的影響，試驗前24h停止喂食，并在整個亞急性毒性試驗期間不喂食。

1.3 亞急性毒性試驗方法

試驗設定亞急性毒性試驗濃度分別為10%、30%、50%和70%，研究不同暴露濃度的鏈霉素生產(chǎn)廢水進水對斑馬魚的氧化損傷情況。試驗分別設置1個空白組和4個試驗組，每個試驗組設置3個平行組，試驗時間為15d。試驗方法為：在5L魚缸中分別放入4L的試驗液，充分混合曝氣后，將馴養(yǎng)的斑馬魚隨機放入各試驗組中，每組投放20尾魚，并進行連續(xù)曝氣；每天至少測定1 次試驗液中的DO、pH 值、硬度和水溫；采用靜態(tài)置換法，每天換水，分別于第3、6、9、12和15天測定斑馬魚肌肉組織中POD 活性和GSH 含量。

1.4 樣品處理

每次從相應的試驗組中取5尾試驗魚，解剖，取其肌肉組織，在冰冷的0.86%生理鹽水中漂洗，濾紙拭干，準確稱取組織重量后，放入玻璃勻漿管中；用移液器按1∶9重量體積比（w／v）量取預冷的0.86%生理鹽水，加入到勻漿管中進行勻漿，勻漿過程在冰水浴中進行，充分研磨約8min，制得10%組織勻漿；將制備好的勻漿液用普通離心機在3 000r／min下離心10min，取其上清液保存于4℃冰箱中。

1.5 試驗條件

試驗中所用廢水來自鏈霉素生產(chǎn)過程中的提煉工段。試驗用水pH 值約為7.5，總硬度約為100 mg／L，溫度為22～24℃，DO 不低于5mg／L。試驗期間用曝氣裝置連續(xù)曝氣，為了保證魚缸內(nèi)鏈霉素廢水進水濃度不變，每隔24h換試驗液1次，每天至少測定1次試驗液的水溫、硬度、pH 值和DO 含量。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗結(jié)果用平均值±標準差表示。采用Excel軟件T 檢驗法進行空白組和試驗組的顯著性分析，即：p＞0.05時，差異不顯著；0.01＜p＜0.05時，差異顯著；p＜0.01時，差異極顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 亞急性毒性試驗結(jié)果

2.1.1 鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中POD活性的影響

不同濃度鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中POD 活性的影響試驗結(jié)果見圖1。

由圖1可見，不同體積百分比的鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中POD 活性的影響不同：10%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中POD 活性在第3天時被抑制（p＜0.01），第6～12天時POD活性一直處于顯著誘導階段（0.01＜p＜0.05），但是誘導效應逐漸降低，在第15天時POD 活性受到顯著的抑制作用（0.01＜p＜0.05）；30%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中POD 活性在初期（第3～9天）始終處于輕度抑制階段，無顯著性，到了第12天時POD 活性表現(xiàn)出極顯著性誘導（p＜0.01），此時斑馬魚體內(nèi)POD 活性達到最大值（3.999 6 U／mgprot），且POD 活性的合成達到了最大值，對鏈霉素廢水所引起的氧化損傷的清除能力達到最大，第15天時POD 活性大小又恢復至對照組水平；50%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中POD活性在第3天時呈現(xiàn)出顯著性的抑制作用（0.01＜p＜0.05），第6 天時POD 活性受到顯著誘導（0.01＜p＜0.05），第9天時POD 活性被顯著抑制（0.01＜p＜0.05），第12 天時POD 活性出現(xiàn)上升趨勢，到了第15 天POD 活性再一次被顯著抑制（0.01＜p＜0.05）；70%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中POD 活性第3天被誘導升高，與對照組相比，其增幅為38.87%，第6 天時POD 活性誘導效應 達到極大值（3.900 0 U／mgprot）（p ＜0.01），在第9天時POD 活性開始被抑制，表現(xiàn)出極顯著性抑制效應（p＜0.01），在試驗的中后期（9～15天），斑馬魚肌肉組織中POD 活性持續(xù)被抑制，在第15天時POD 活性達到了所有濃度組的最小值（0.800 0U／mgprot）。

2.1.2 鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中GSH含量的影響

不同濃度鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中GSH 含量的影響試驗結(jié)果見圖2。

由圖2可見，10%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中GSH 含量在暴露的初期（第3～6 天）被抑制（p ＜0.01），第9 天 時GSH 含量升 高（0.01＜p＜0.05），但在暴露的后期（第12～15天）GSH 含量由誘導轉(zhuǎn)變?yōu)轱@著性抑制效應（0.01＜p＜0.05），與第9天相比，斑馬魚肌肉組織中GSH含量下降，其降幅分別為52.67%和50.24%；30%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中GSH 含量在第3天時顯著性被抑制（0.01＜p＜0.05），第6天時出現(xiàn)極顯著性抑制作用（p＜0.01），到第9 天時GSH 含量急劇升高，出現(xiàn)極顯著誘導（p＜0.01），第12天時GSH 含量急劇下降，呈現(xiàn)顯著抑制效應（0.01＜p＜0.05），與第9天相比，斑馬魚肌肉GSH含量下降，其降幅為64.43%，第15天時GSH 含量再一次升高，被極顯著性誘導（p＜0.01），此時斑馬魚肌肉組織中GSH 含量達到最大值13.009 5 mgGSH／gprot，與 第 12 天相比，其升幅 為220.50%；50%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中GSH 含量在第3天時與空白組相比表現(xiàn)出極顯著誘導效應（p＜0.01），第6天時GSH 含量開始降低，直至第9 天期間GSH 含量均處于極顯著性抑制階段（p＜0.01），暴露后期（第12～15天）GSH含量呈現(xiàn)出極顯著的誘導效應（p＜0.01）；70%體積百分比試驗組的斑馬魚肌肉組織中GSH 含量在第3天時受到顯著誘導作用（0.01＜p＜0.05），第6天時開始直至暴露試驗結(jié)束（第6～15天）GSH 含量一直被抑制，呈現(xiàn)出極顯著抑制作用（p＜0.01）。

2.2 亞急性毒性試驗結(jié)果分析與討論

2.2.1 鏈霉素廢水對斑馬魚肌肉組織中POD 活性的影響分析

當生物體受到外源性污染物進攻時會產(chǎn)生大量活性氧自由基，活性氧自由基若不及時被清除，就會引起DNA 斷裂、脂質(zhì)過氧化、酶失活等損傷，對生物機體造成氧化脅迫［16］。斑馬魚暴露在鏈霉素廢水中，低濃度組（10%體積百分比）廢水中斑馬魚肌肉組織中POD 活性出現(xiàn)抑制—誘導—抑制的變化趨勢。分析其原因認為是：當斑馬魚受到鏈霉素廢水脅迫，體內(nèi)的抗氧化防御平衡系統(tǒng)被打破，POD活性受抑制，隨著魚體內(nèi)超氧陰離子自由基濃度的增加，POD 活性被激活，并通過活性升高來清除H2O2，使機體免受氧化損傷和毒害；隨著暴露時間的增加，POD 不斷被消耗，到后期（第15天）時POD活性會下降，這與宋志慧等［17］關于Cu2+、Cd2+、Cr6+脅迫對斑馬魚POD 活性影響的研究結(jié)果一致。中濃度組（30%和50%體積百分比）廢水中斑馬魚肌肉組織中POD 活性基本維持在對照組水平，說明中濃度組鏈霉素廢水對斑馬魚肌肉組織造成的氧化性損傷能夠通過自身調(diào)節(jié)使其達到氧化—抗氧化平衡。高濃度組（70%體積百分比）廢水對斑馬魚的毒害作用比較明顯，表現(xiàn)出顯著誘導—抑制的趨勢，且對POD 活性的抑制效應更為明顯，POD 活性初期被誘導，說明斑馬魚受到脅迫后產(chǎn)生應激效應，POD 活性上升抵制外界不利干擾，從第9天開始直至試驗結(jié)束（第15天）斑馬魚肌肉組織中POD 活性一直處于被抑制階段，說明鏈霉素廢水中污染物質(zhì)的濃度高，其侵擾對魚體抗氧化系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重干擾，POD 活性不足以消除污染物質(zhì)的干擾，其產(chǎn)生和消除平衡被打破，魚體內(nèi)活性氧自由基濃度超過了POD 的消除能力，此時斑馬魚消除活性氧自由基機制嚴重失衡，POD 活性急劇下降，斑馬魚遭到了氧化損傷?？梢姡?0%體積百分比的鏈霉素廢水可使斑馬魚POD 失活。

2.2.2 鏈霉素廢水對斑馬魚肌肉組織中GSH 含量的影響分析

斑馬魚暴露于10%體積百分比的鏈霉素廢水中，斑馬魚肌肉組織中GSH 含量出現(xiàn)抑制—誘導—抑制的趨勢。暴露初期GSH 含量下降，說明鏈霉素廢水對斑馬魚肝臟具有一定的毒害作用；在第9 天時斑馬魚體內(nèi)的GSH 含量表現(xiàn)出誘導作用，原因可能是廢水的毒害作用未達到肝臟可承受的極限，GSH 通過含量升高來消除活性氧自由基，保持體內(nèi)自由基的平衡，這與馬曉燕等［18］關于三丁基錫（TBT）對羅非魚GSH 的影響研究結(jié)果一致；隨著暴露時間的增加，斑馬魚體內(nèi)活性氧自由基數(shù)量的增多，對斑馬魚造成了氧化性損傷，使GSH 含量表現(xiàn)為抑制狀態(tài)。斑馬魚暴露于30%體積百分比的鏈霉素廢水中，斑馬魚肌肉組織中GSH 含量變化表現(xiàn)出抑制—誘導—抑制—誘導趨勢。剛開始表現(xiàn)為抑制作用，與10%濃度組的結(jié)果一致，說明斑馬魚GSH 應激性較緩慢；隨著暴露時間的增加，鏈霉素廢水中污染物進入魚體的數(shù)量增加，誘導GSH 的合成來為自身解毒；在第12天時GSH 含量又表現(xiàn)出抑制作用，說明GSH 含量已不足以消除過多的陰離子氧自由基；但是試驗后期（第15 天）GSH 含量又表現(xiàn)為誘導作用，說明機體抗氧化防御系統(tǒng)還在發(fā)揮清除自由基的作用，這表明暴露于30%體積百分比的鏈霉素廢水中斑馬魚的抗氧化防御系統(tǒng)仍然具有清除抗氧自由基的能力，可以通過GSH 含量的變化應對體內(nèi)活性氧自由基的增多，抵御外界污染脅迫。吳志剛等［19］在青土霉素廢水出水對錦鯉肝臟抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響研究、楊森等［20］在四環(huán)素類藥物抗氧自由基作用的研究也出現(xiàn)類似的現(xiàn)象。暴露在50%體積百分比的鏈霉素廢水中，斑馬魚肌肉組織中GSH 含量呈現(xiàn)誘導—抑制—誘導的變化趨勢。在后期（第12～15天）GSH 含量仍然是誘導趨勢，表明此時的污染脅迫水平尚未達到斑馬魚抗氧化系統(tǒng)的閾值，其氧化性損傷是可修復的。但70%體積百分比的鏈霉素廢水則對斑馬魚的毒害作用較明顯，暴露期間斑馬魚肌肉組織中GSH 含量呈現(xiàn)出誘導—抑制的趨勢，在第15 天時GSH 含量被抑制的趨勢沒有改變。高濃度組（70%體積百分比）的鏈霉素廢水使斑馬魚快速進入應激階段，GSH 含量快速升高以消除魚體內(nèi)活性氧自由基對肝臟的毒害，但是隨著暴露時間的增加，鏈霉素廢水對斑馬魚的毒害超過了斑馬魚可承受的范圍，GSH 含量消耗過多且急劇下降，表明高濃度鏈霉素廢水對斑馬魚的傷害較大。斑馬魚肌肉組織中GSH 含量在試驗中后期（第6～15天）均沒有出現(xiàn)上升的趨勢，說明70%體積百分比以上的鏈霉素廢水對斑馬魚可造成嚴重的氧化損傷，使GSH 失活。

3 結(jié)論

選用斑馬魚（Danio rerio）為受試生物，通過亞急性毒性試驗，考察不同體積百分比的鏈霉素生產(chǎn)廢水對斑馬魚肌肉組織中POD 活性和GSH 含量的影響，得到如下結(jié)論：

（1）斑馬魚暴露在10%體積百分比的鏈霉素廢水中15d，其肌肉組織中POD 活性和GSH 含量變化呈現(xiàn)出抑制—誘導—抑制的變化趨勢，說明斑馬魚已受到污染脅迫并有了應激反應。

（2）斑馬魚暴露在70%體積百分比的鏈霉素廢水中15d，在試驗后期（第9～15天）斑馬魚肌肉組織中POD 活性和GSH 含量都處于抑制狀態(tài)，說明70%體積百分比的鏈霉素廢水對斑馬魚的污染侵害超過了斑馬魚抗氧化防御體系可承受的范圍，其氧化-抗氧化平衡狀態(tài)被破壞，魚體已受到較大的氧化損傷。

（3）比較斑馬魚兩個生化指標POD 活性和GSH 含量發(fā)現(xiàn)，暴露期間兩個指標變化趨勢具有協(xié)同性，均可以表明斑馬魚已受到污染脅迫并產(chǎn)生應激反應。但斑馬魚暴露在10%～70%體積百分比的鏈霉素生產(chǎn)廢水中15d，其肌肉組織中POD 活性不如GSH 含量敏感。

［1］劉春，李敏源，趙瑞英，等.UASB反應器處理鏈霉素廢水啟動及運行性能［J］.環(huán)境工程學報，2014，8（3）：851-856.

［2］李方志，李平，吳錦華，等.UASB反應器處理高含量核苷酸類廢水啟動特性研究［J］.水處理技術，2011，37（3）：112-115.

［3］潘碌亭，王文蕾，吳錦峰.水解酸化／SBR／強化絮凝處理抗生素廢水［J］.中國給水排水，2011，27（4）：78-85.

［4］Chen Z Q，Wang H C，Chen Z B.Performance and model of a fullscale up-flow anaerobic sludge blanket（UASB）to treat the pharmaceutical wastewater containing 6-APA and amoxicillin［J］.Journal of Hazardous Materials，2011，185（2／3）：905-915.

［5］Li B，Zhang T.Mass flows and removal of antibiotics in two municipal wastewater treatment plants［J］.Chemosphere，2011，83（9）：1284-1289.

［6］Golet E M，Alder A C，Giger W.Environmental exposure and risk assessment of fluoroquinolone antibacterial agents in wastewater and river water of the Glatt Valley watershed，Switzerland［J］.Environmental Science &Technology，2002，36（17）：3645-3651.

［7］Metcalfe C D，Miao X S，Hua W，et al.Pharmaceuticals in the Canadian environment［M］.New York：Springer，2004：67-90.

［8］沈洪艷，吳志剛，高吉喜，等.青土霉素廢水出水對斑馬魚抗氧化指標的影響［J］.河南科技大學學報，2013，34（3）：78-82.

［9］沈洪艷，武晨虹，王麗新，等.鏈霉素廢水對錦鯉魚抗氧化酶及MDA 含量的影響［J］.安全與環(huán)境工程，2013，20（6）：65-68.

［10］端正花，朱琳，馮鳴鳳，等.斑馬魚基因芯片技術在雙酚A 毒性機制研究中的應用［J］.環(huán)境科學，2010，31（3）：808-814.

［11］陳粉麗，張松林，李運彩，等.斑馬魚胚胎毒理學研究進展［J］.湖北農(nóng)業(yè)科學，2010，49（6）：1484-1487.

［12］劉在平，張松林，李運彩，等.斑馬魚胚胎在生態(tài)毒理學研究中的應用［J］.科學技術與工程，2010，10（14）：3452-3454.

［13］焦傳珍.鈰對鎘染毒泥鰍肝胰臟中超氧化物歧化酶和過氧化物酶活性的影響［J］.水產(chǎn)科學，2009，28（2）：786-788.

［14］Xu J X.The role of electron leakage of mitochondrialres piratorychain in cell apoptosis［J］.Prog.Biochem.Biophys.，2003，30（4）：655-657.

［15］陳家長，孟順龍，胡庚東，等.低濃度阿特拉津?qū)a魚過氧化氫酶活性的影響［J］.農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2008，27（3）：1151-156.

［16］Winston G W.Oxidants and antioxidants in aquatic animals［J］.Comp.Biochem.Phys.C：Comparative Pharmacology，1991，100（12）：173-176.

［17］宋志慧，王慶偉，等.Cu2+、Cd2+、Cr6+脅迫對斑馬魚抗氧化酶活性的影響［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39（8）：4739-4741.

［18］馬曉燕，范立民，甘居利，等.三丁基錫（TBT）對羅非魚兩組織SOD和GSH 的影響［J］.安全與環(huán)境學報，2007，7（4）：9-11.

［19］吳志剛，沈洪艷，高吉喜，等.青土霉素廢水出水對錦鯉肝臟抗氧化酶活性和丙二醛含量的影響［J］.江西農(nóng)業(yè)大學學報，2013，35（3）：587-592.

［20］楊森，馮藝戎，張學軍，等.四環(huán)素類藥物抗氧自由基作用的研究［J］.中國藥理學通報，1999，15（5）：472-473.