基于炎癥反應的阿爾茨海默癥功能模塊構建

孔 薇，張 娜，楊 旸，牟曉陽

（1.上海海事大學 信息工程學院，上海 201306；2.美國羅文大學 醫(yī)藥研究中心，新澤西 08028）

阿爾茨海默（Alzheimer disease，簡稱AD）是以進行性認知障礙和記憶力損害為主的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變，病人逐漸喪失生活自理能力，給家庭和社會帶來沉重的負擔.AD起病隱匿且發(fā)病機制復雜，基因信號傳導通路及調(diào)控關系難以構建［1］.大量的臨床病理報告顯示，Aβ沉積所形成的神經(jīng)炎斑塊是AD病理主要特征之一.AD老年斑病變中可觀察到幾十種與炎癥有關的蛋白質(zhì)；T淋巴細胞、小膠質(zhì)細胞和星狀細胞發(fā)揮著類炎癥免疫細胞和巨噬細胞的作用.因此，炎癥反應在AD發(fā)病機制中起著重要作用，基于炎癥反應的功能模塊及信號傳導通路構建將為AD致病機制的研究提供有益的途徑.

目前基因調(diào)控網(wǎng)絡的構建主要基于基因表達數(shù)據(jù)，但基因表達數(shù)據(jù)具有基因數(shù)目多、樣本過少、高噪聲且信息變量隱藏很難分析的特點，這種不平衡造成大多數(shù)經(jīng)典模式識別和機器學習方法不能被直接應用，直接導致構建基因調(diào)控網(wǎng)絡的精度不夠［2］.近年來，很多學者在不同程度上提出了整合基因表達數(shù)據(jù)集以及融合其他數(shù)據(jù)源的方法.如整合不同平臺下基因表達數(shù)據(jù)、結合Chip－chip數(shù)據(jù)、基因敲除數(shù)據(jù)、蛋白質(zhì)相互作用等，用于構建基因調(diào)控網(wǎng)絡、基因生物標志物的探尋等［3－6］.其中，PPI數(shù)據(jù)所表示的網(wǎng)絡結構可代表不同的生物過程或信號通路，能為基因功能和網(wǎng)絡的研究提供豐富的相互作用信息，尤其是對應于序列相似性比較大的基因.因此，結合PPI數(shù)據(jù)可以彌補基因表達數(shù)據(jù)的不足，提高網(wǎng)絡的精度.作者利用PPI數(shù)據(jù)所提供的生物網(wǎng)絡及功能的模塊性，與AD基因表達數(shù)據(jù)相結合構建基于炎癥反應的AD功能模塊網(wǎng)絡.

同時，除了人腦海馬（hippocampus，簡稱HIP）區(qū)組織樣本以外，內(nèi)嗅皮質(zhì)（entorhinal cortex，簡稱EC）區(qū)、顳中回（media temporal gyrus，簡稱 MTG）區(qū)、后扣帶回皮質(zhì)（posterior cingulate，簡稱PC）區(qū)、額上回（superior frontal gyrus，簡稱SFG）區(qū)及視覺皮層（primary visual cortex，簡稱VCX）區(qū)均與記憶和空間定位等密切相關，并在AD中均有病理改變，因此，文中作者利用AD患者6個腦區(qū)域基因表達數(shù)據(jù)采用Heinz算法與PPI數(shù)據(jù)結合，提取顯著子網(wǎng)絡；提出模擬退火算法預測和優(yōu)化網(wǎng)絡中的相互作用；最后通過基因功能分析對特征基因進行分類，并結合PPI網(wǎng)絡構建基于炎癥反應的功能模塊，并構建鈣離子作用機制的網(wǎng)絡模塊，為深入了解AD內(nèi)部發(fā)病機制提供重要線索.

1 算法介紹

1.1 得分函數(shù)原理

作者在總的PPI網(wǎng)絡中提取出擾動性更大的節(jié)點基因且節(jié)點之間的相互作用都比較強的子網(wǎng)絡，并且在加權網(wǎng)絡中采用最大權重的方法提取子網(wǎng).網(wǎng)絡的加權包括邊權和點權，即網(wǎng)絡得分函數(shù)的邊得分和點得分.邊得分代表兩個節(jié)點基因的相關性［7］；點得分代表該基因差異表達程度［8］.

根據(jù)觀測的基因數(shù)據(jù)計算的原始p值可以認為有信號和噪聲混合組成［9］.在零假設條件下，p值的信號成分服從B（a，1）分布，a為擬合參數(shù).其概率密度函數(shù)為

噪聲服從B（1，1）分布，β為形狀參數(shù)，當α和β都為1時，即B（1，1）＝U（0，1），即可以看作噪聲服從均勻分布.對于得分函數(shù)分母則為1，公式如下

很顯然，a→1表示信號成分的密度是收斂于背景模型.因此，每個基因的得分將收斂于0，尤其是較低的p值將會給定一個零得分.

再者，對于擬合參數(shù)a和參數(shù)x有，證明了該得分函數(shù)結合了參數(shù)a和x.類似于一個經(jīng)典假設檢驗，定義一個特定的顯著性水平即一個能把信號和噪聲分開的閾值.混合模型允許估計錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，簡稱FDR）值的大小，估計出的閾值大小可以控制正得分的節(jié)點個數(shù).然后，可以推導出一個調(diào)整的似然比得分，點得分函數(shù)為

其中：x是基因表達數(shù)據(jù)的統(tǒng)計p值；a是均勻混合模型的形狀參數(shù)的最大似然估計值；τ是閾值，它控制著正得分節(jié)點的個數(shù)，繼而決定著提取出的子網(wǎng)絡的大小.根據(jù)觀測數(shù)據(jù)求取的p值是信號和噪聲的混合.信號服從均勻分布，噪聲服從正態(tài)分布，p值分布可以表示為

因此，p值通過β－均勻混合（beta－uniform mixture model，簡稱BUM）模型可以很好地分離噪聲［1］.

PPI網(wǎng)絡中相互作用的強度是不同的，并且兩個節(jié)點之間的相互作用有促進和抑制之分.皮爾森相關系數(shù)符合相互作用的特點，皮爾森相關系數(shù)值代表強度大小，正負代表作用的方向.節(jié)點的標準差可以反映兩節(jié)點之間的差異性.文中邊得分的大小代表相互作用強度值，正負代表促進或抑制作用.定義邊得分函數(shù)為

其中：X、Y表示兩個節(jié)點基因；e代表網(wǎng)絡中的相互作用；cov（x，y）是變量X、Y的協(xié)方差；corr（X，Y）是基因X、Y表達值的皮爾森相關系數(shù)；std（X）、std（Y）是基因表達值的標準差，體現(xiàn)基因的差異性.網(wǎng)絡G的得分定義為

此時T會受到網(wǎng)絡中邊的數(shù)據(jù)的影響.在子網(wǎng)絡對研究條件無響應的前提下，網(wǎng)絡中的相互作用對之間是隨機相關的［7］.可以認為網(wǎng)絡的標準得分不會受到節(jié)點之間的連接結構的影響.因此，定義網(wǎng)絡的邊得分函數(shù)為

其中：avgk是網(wǎng)絡中邊得分的平均值；stdk是邊得分的標準差.

1.2 子網(wǎng)絡識別算法

基于點得分的網(wǎng)絡識別算法（Heinz）的理論模型屬于斯坦納樹問題（Steiner－tree），主要是根據(jù)prize－collecting Steiner樹問題和數(shù)學規(guī)劃法求解［1］，該文是在一個有正負得分的網(wǎng)絡中尋找得分最大的相關子網(wǎng)絡.

存在一個無向加權網(wǎng)絡G＝（V，E，c，q），其中q表示頂點利潤，q：V→R≥0；c表示邊消費，c：E→R≥0.作者在網(wǎng)絡G中尋找最大加權子網(wǎng)T，即T＝（VT，ET）∈G（VT?V，ET?E），并且網(wǎng)絡的總得分最大，即滿足公式，在網(wǎng)絡G中，w表示網(wǎng)絡的點權重，w′表示所有頂點中最小的權重值，并且令網(wǎng)絡中所有的邊權重都為w′.因此q（v）＝W（v）－w′，c（e）＝－w′.網(wǎng)絡T得分q（T）可以表示為

因為T是一棵樹，所以網(wǎng)絡T得分為

算法詳細敘述參見R－BioNet程序包［10］.

模擬退火算法是一種應用非常廣泛的智能優(yōu)化算法［11］.生物網(wǎng)絡的功能模塊化分析本質(zhì)上是一個大規(guī)模組合優(yōu)化問題，而模擬退火是解決大規(guī)模組合優(yōu)化問題的有效近似算法，并且具有跳出局部優(yōu)化的優(yōu)點.Guo等［7］通過把該算法運用到人類前列腺癌數(shù)據(jù)集和酵母菌細胞循環(huán)數(shù)據(jù)集，證明了它能夠有效地捕捉到網(wǎng)絡中的相互作用.因此可以采用該算法優(yōu)化網(wǎng)絡.

2 實驗仿真和討論

2.1 實驗數(shù)據(jù)介紹

選用Gene Expression Omnibus（GEO）數(shù)據(jù)庫的GSE5281數(shù)據(jù)集［12］，其包含6個腦區(qū)共有161個樣本，分為對照樣本（CD）和患病樣本（AD）.內(nèi)嗅皮層（EC）區(qū)有13個CD和10個AD；海馬 （HIP）區(qū)有13個CD和10個AD；中間顳回 （MTG）區(qū)有12個CD和16個AD；后扣帶回皮質(zhì) （PC）區(qū)有13個CD和9個AD；主要視覺皮層 （VCX）區(qū)有12個CD和19個AD；額上回（SFG）區(qū)有11個CD和23個AD.Human Protein Reference Database（HPRD）數(shù)據(jù)庫的人類PPI數(shù)據(jù)［13］包含36 504個相互作用及9 386個節(jié)點基因.

2.2 數(shù)據(jù)預處理

根據(jù)觀測基因表達值求取的p值包含信號和噪聲.運用貝葉斯方法和BUM模型對觀測p值進行線性擬合分離信號和噪聲［14］，提高差異分析和節(jié)點得分的準確性.緊接著對基因表達數(shù)據(jù)進行基因注釋和方差分析.以上操作為該文的數(shù)據(jù)預處理.

每個腦區(qū)進行預處理后提取的基因分別與PPI網(wǎng)絡依據(jù)基因ID號進行匹配，提取最大網(wǎng)絡并去除基因的自相互作用.經(jīng)預處理后每個腦區(qū)初步選出6 100～6 400個基因.圖1為SFG腦區(qū)BUM模型效果圖.

圖1a中，直方圖顯示了觀察p值在擬合模型（曲線）下與預期密度具良好的一致性，圖中橫線代表觀測數(shù)據(jù)的p值的噪聲在擬合模型下為均勻模型.圖1b中，在模型下觀測p值的分布與實際p值能夠良好地擬合.

3 實驗結果及分析

實驗證明FDR越大，正得分基因的數(shù)目越多.基于高錯誤發(fā)現(xiàn)率的廣泛擾動使識別核心擾動非常困難.為了得到6個腦區(qū)的正得分基因數(shù)目較小便于分析核心擾動，作者決定在不同大腦區(qū)域采用不同的FDR臨界值.經(jīng)過多次實踐，作者針對每個腦區(qū)最后選擇MTG、EC、HIP、PC、SFG、VCX分別對應的FDR值為0.000 7、0.004、0.008、0.01、0.06、0.09，計算網(wǎng)絡中的節(jié)點得分和邊得分.運用 Heinz算法提取出每個腦區(qū)的點權最大得分子網(wǎng).使用模擬退火算法優(yōu)化網(wǎng)絡，設定閾值為0.8.實現(xiàn)向子網(wǎng)中添加強度超過設定閾值、去除強度小于閾值的相互作用，獲取最終的顯著擾動子網(wǎng).

通過分析節(jié)點的p值和邊得分，每個腦區(qū)的顯著擾動子網(wǎng)中節(jié)點的差異性很大，基因之間的相互作用很強.并且每個腦區(qū)的擾動子網(wǎng)之間存在著明顯的重疊.網(wǎng)絡中節(jié)點基因連通度的大小反映了該基因在網(wǎng)絡中的重要程度，選取前50個基因作為特征基因，共提取出206個特征基因.

為了證實提取的特征基因與AD的相關性，作者利用目前應用較為廣泛的DAVID［15］在線工具對提取的206個顯著基因賦予Gene Ontology注釋，并進行功能分析和分類.其中，APP和GAPDH是已知與AD相關的基因；16個基因參與NF－κB信號通路；23個基因與線粒體功能障礙有關，其中4個基因參與KEGG的AD信號通路；81個基因與神經(jīng)組織有關；35個基因參與鈣離子作用過程；33個基因參與炎癥免疫反應；90個基因參與乙?；^程.其中，線粒體功能紊亂會導致ATP合成降低，造成ATP損耗障礙，可誘發(fā)興奮性氨基酸增加，如谷氨酸、門冬氨酸等，它們對神經(jīng)元具有強烈的興奮和神經(jīng)毒性作用，最終導致神經(jīng)元死亡.

為進一步驗證特征基因與AD的相關性，作者通過對特征基因進行KEGG傳導通路分析，總共有57個基因參與了與AD相關的重要信號通路，主要包括MAPK信號通路、Wnt信號通路、胰島素信號通路等.

TGF－β信號通路對mRNA－106b有直接調(diào)控作用.mRNA－106b表達降低可以使TGF－β表達升高.Dab2通過調(diào)節(jié)TGF－β1／SMADs信號通路，可以減少淀粉樣β蛋白沉積、減輕炎癥反應和海馬神經(jīng)元的缺失，發(fā)揮了對阿爾茨海默病海馬神經(jīng)元的保護作用.所以Dab2基因有可能作為藥物研究的靶點.

Wnt信號通路則可以直接作用于Fz受體，激活DVL和JUN激酶等.Fz受體會與三聚體G蛋白相互作用增加細胞內(nèi)的Ca2＋濃度.因此Wnt信號通路與下文的鈣離子作用機制有密切的聯(lián)系.同時，Wnt通路還可以通過DVL與NIC的直接作用拮抗Notch通路.Notch通路與NF－κB通路有密切的關系.Notch信號通路中的Notch受體能夠調(diào)節(jié)細胞的分化，并且已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)Notch1可以在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中誘導神經(jīng)膠質(zhì)細胞產(chǎn)生.

胰島素信號通路異常則與大腦氧化應激反應有關，大腦長時間處于缺氧狀態(tài)也會造成神經(jīng)元死亡.經(jīng)過分析以上幾種通路都參與了AD的發(fā)生和發(fā)展過程，與AD的發(fā)病都有密切關系.這也進一步證實，文中提取的特征基因與AD都有著密切的關系，可為生物學研究提供更有價值的信息.

3.1 炎癥模塊網(wǎng)絡的構建及分析

AD的特征性病理主要為細胞外間隙的Aβ蛋白和細胞內(nèi)多聚tau蛋白的沉積.β淀粉樣蛋白的細胞外沉積與強烈的炎癥反應密切相關，分子生物學研究也普遍認為神經(jīng)炎癥是AD發(fā)病的罪魁禍首［16］.作者提取了大量與免疫和炎癥反應密切相關的過表達基因，證實了AD的產(chǎn)生和發(fā)展與炎癥反應密切相關.為進一步在網(wǎng)絡中分析所提取的特征基因，結合39個已知的AD相關基因，進行功能分類進而構建炎癥模塊子網(wǎng).圖2所示為該文算法提取的炎癥反應相關基因構建的炎癥功能模塊網(wǎng)絡.

圖2中，菱形節(jié)點為已知與AD相關的基因，圓節(jié)點為提取的特征基因.基因之間的相互作用非常清晰，已知基因與特征基因之間共同調(diào)控著細胞的炎癥反應.特征基因自身的模塊性較好.圖2中可看出APP、MAPK1／3等基因在網(wǎng)絡中占據(jù)著重要的作用.CASP3／6／8以及APOE等基因都與APP存在直接相互作用.IKBKB基因與TNFRSF1A基因和CASP8基因存在直接相互作用關系，同時IKBKB還參與NF－κB傳導通路作用，CASP8和NF－κB與炎癥反應密切相關.APP基因的突變可使Aβ蛋白沉積增加，繼而引起繼發(fā)性的炎癥反應.Aβ蛋白沉積的增加能增加炎癥因子NF－κB蛋白的失常表達造成神經(jīng)細胞死亡.MAPK能被白細胞介素3（IL－3）等多種炎性因子激活，對炎癥的發(fā)生、發(fā)展起重要調(diào)控作用［17］.MAPK激酶在AD體內(nèi)參與誘導tau蛋白的過度磷酸化，繼而導致AD發(fā)生.網(wǎng)絡中CASP3／8，MAPK1／3等基因與BCL－2有直接作用關系.

3.2 鈣離子機制模塊網(wǎng)絡的構建及分析

近年來，鈣平衡失調(diào)作為AD重要致病因素的觀點已被許多學者認同.鈣離子濃度的變化會促進老年斑和神經(jīng)元纖維纏結的生成.作者提取大量與鈣離子代謝密切相關的顯著基因及傳導通路.利用這些提取的與鈣離子有關的基因構建的鈣離子作用機制的模塊網(wǎng)絡如圖3所示.

由圖3可看出PRKCA、BCL－2等基因在網(wǎng)絡中占有重要的作用.文中所提取的鈣結合蛋白基因有S100A1、S100B、CALB1、鈣調(diào)蛋白基因CALM3、蛋白質(zhì)磷酸酶基因PPP3CA.S100B是腦內(nèi)特異蛋白［18］，通過ATP2AZ基因與BCL－2基因相互作用.大腦受到損傷后，星型膠質(zhì)細胞增殖和異?；罨?，并且釋放大量的炎癥因子，促使大腦炎癥發(fā)生，同時導致大量的S100B蛋白的生成，高濃度的S100B蛋白對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有毒性作用，促使神經(jīng)細胞死亡，促進炎癥的發(fā)生，因此鈣平衡失調(diào)與炎癥反應存在密切的關系.

有研究表明，鈣離子機制也可通過其他途徑造成AD.早老素基因突變、線粒體功能紊亂等引發(fā)細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的紊亂，導致Ca2＋濃度增加［17］.Ca2＋濃度上升會與鈣結合蛋白尤其是鈣調(diào)蛋白結合，激活CaMK2D編碼的CaMKII以及PRKCA編碼的PKC等蛋白激酶，造成蛋白激酶活性失衡.CaMKII表達增加會損傷突觸和神經(jīng)元，釋放出的CaMKII發(fā)生集聚并沉積，誘導或加速Aβ的形成，Aβ可誘發(fā)廣泛大腦炎癥反應并且促使炎癥因子過表達.PKC可以催化tau蛋白發(fā)生磷酸化，致使tau蛋白過度磷酸化.Ca2＋通過鈣調(diào)蛋白等下游信號使過度磷酸化的tau蛋白形成雙螺旋纖維絲，進而形成NFT.再者，Aβ可以改變神經(jīng)細胞和線粒體的離子通透性，造成神經(jīng)細胞內(nèi)Ca2＋平衡的失調(diào)，繼而形成惡性循環(huán)，最終造成AD.

4 結束語

同一問題的多源數(shù)據(jù)的分析是對基因的生物學信息的整合，較好地彌補了基因表達數(shù)據(jù)自身的不足.作者通過運用Heinz算法結合AD 6個腦區(qū)基因數(shù)據(jù)和PPI數(shù)據(jù)，提高了基因調(diào)控網(wǎng)絡預測和構建的精度和準確性.運用邊權算法預測基因之間的強相互作用具有顯著效果，不僅能提取出已知與AD相關的基因APP和GAPDH，同時，通過炎癥模塊子網(wǎng)和鈣離子模塊子網(wǎng)的構建給出了AD顯著基因之間的相互作用關系，深入探索和分析了炎癥及鈣離子反應等在AD發(fā)病機制中所起的重要作用，為AD致病機制的分子生物學實驗和深入研究提供了有益的途徑和方向.

［1］Dittrich M T，Klau G W，Rosenwald A.Identifying functional modules in protein－protein interaction networks：an integrated exact approach［J］.Bioinformatics，2008，24（13）：223－231.

［2］Wei K，Cui D B，Mou X Y.Using network component analysis to dissect dynamic expression of gene and network structure in Alzheimer’s disease［J］.ICBEB，2013，32（4）：418－425.

［3］Cheng C，Shen K，Song C，et al.Ratio adjustment and calibration scheme for gene－wise normalization to enhance microarray inter－study prediction［J］.Bioinformatics，2009，25（13）：1655－1661.

［4］江麗華，李亦學，劉琪.綜合Chip－chip數(shù)據(jù)、基因敲除數(shù)據(jù)和表達譜數(shù)據(jù)構建基因調(diào)控網(wǎng)絡［J］.生物化學與生物物理進展，2010，37（9）：996－1005.

［5］謝建明.基于表達數(shù)據(jù)和基因組信息分析基因調(diào)控的方法學研究［D］.東南大學生物醫(yī)學工程學院，2009.

［6］Wang Y C，Chen B S.A network－based biomarker approach for molecular investigation and diagnosis of lung cancer［J］.BMC Medical Genomics，2011，4（2）：2－15.

［7］Guo Z，Li Y J.Edge－based scoring and searching method for identifying condition responsive protein－protein interaction sub－network［J］.Bioinformatics，2009，25（12）：2121－2128.

［8］Liang D，Han G，F(xiàn)eng X.Concerted perturbation observed in a Hub network in Alzheimer’s disease［J］.PLoS ONE，2012，7（7）：e40498.

［9］Pounds S，Morris S W.Estimating the occurrence of false positives and falsenegatives in microarray studies by approximating and partitioning the empirical distribution ofp－values［J］.Bioinformatics，2003，19（10）：1236－1242.

［10］Beisser D，Klau G W，Dandekar T.BioNet：an R－Package for the functional analysis of biological networks［J］.Bioinformatics，2010，26（8）：1129－1130.

［11］Ding D W，Wu P，Yang X H.Application of simulated annealing algorithm to biological network research［J］.Computers and Applied Chemistry，2011，28（10）：1032－1034.

［12］Keshava Prasad T S，Goel R，Kandasamy K.Human protein reference database—2009［J］.Nucleic Acids Res，2009，37（Database issue）：767－772.

［13］Gao X，Tang X C.The early sign of neurodegenerative disease：mitochondrial dysfunction［J］.Chinese Bulletin of Life Sciences，2006，18（2）：138－144.

［14］Smyth G K.Linear models and empirical bayes methods for assessing differential expression in microarray experiments［J］.Statistical Applications in Genetics and Molecular Biology，2004，3（1）：Article3.

［15］Huang D W，Sherman B T，Lempicki R A.Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources［J］.Nature Protocols，2009，4（1）：44－57.

［16］李麗喜，章素芳，張鑫.阿爾茨海默病小鼠大腦和脊髓自噬變化的研究［J］.上海交通大學學報，2012，32（5）：536－542.

［17］Mann D M，Pickering－Brown S M，Takeuchi A，et al.Amyloid angiopathy and variability in amyloid beta deposition is etermined by mutation position in presenilin－1－linked Alzheimer’s disease［J］.Am J Pathol，2001，158（6）：2165－2175.

［18］Loquai C，Müller－Brenne T，Grabbe S.Serum S100Blevels correlate with clinical benefit in a metastatic melanoma patient treated by CTLA－4blockade：a case report［J］.Onkologie，2013，36 （10）：578－581.