煙草白粉病菌的生物學(xué)特性研究

邢荷荷,梁晨,于靜,張成省,孔凡玉，王鳳龍

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 青島市城陽區(qū)長(zhǎng)城路700號(hào)，266109；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院煙草研究所，青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào)266101

煙草白粉病菌的生物學(xué)特性研究

邢荷荷1,梁晨1,于靜1,張成省2,孔凡玉，王鳳龍2

1青島農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院 青島市城陽區(qū)長(zhǎng)城路700號(hào)，266109；2中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院煙草研究所，青島市嶗山區(qū)科苑經(jīng)四路11號(hào)266101

采用水瓊脂玻片法測(cè)定不同的環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)因子對(duì)煙草白粉病菌Golovinomyces orontii (Castagne) V. P. Heluta分生孢子萌發(fā)的影響。研究表明：分生孢子萌發(fā)的最適溫度為25 ℃，致死溫度為42 ℃ 10min；適宜相對(duì)濕度范圍為93%-100%；對(duì)光照要求不嚴(yán)格；在pH5-pH8范圍分生孢子萌發(fā)率無顯著差異；在碳氮源利用方面，該菌對(duì)供試碳源均能利用，其中果糖的效果最好；但供試氮源對(duì)分生孢子均有不同程度的抑制作用。

白粉?。环稚咦用劝l(fā)；水瓊脂玻片法；環(huán)境因子；營(yíng)養(yǎng)因子

煙草白粉病俗稱“上灰”、“下霜”、“上硝”，該病多為害成熟老葉，由下向上發(fā)展。受害煙葉烘烤后葉色深褐，缺乏彈性和香味，且易破碎，輕則損失15%-20%，重則損失40%以上，造成嚴(yán)重減產(chǎn)及品質(zhì)降低[1]。煙草白粉病是一種世界性病害，在北美洲、大洋州、歐洲、非洲和亞洲均有發(fā)生，嚴(yán)重發(fā)生時(shí)造成較大損失[2]。自1919年澤田兼吉在臺(tái)灣發(fā)現(xiàn)煙草白粉病，隨后在貴州、云南、山西、四川和廣西等地也發(fā)現(xiàn)了煙草白粉病[3]。煙草白粉病在我國(guó)華南、西南各省發(fā)生較為普遍，時(shí)有爆發(fā)流行。自2011年研究人員在青島地區(qū)發(fā)現(xiàn)煙草白粉病，在隨后的多年調(diào)查中發(fā)現(xiàn)煙草白粉病的危害越來越重。經(jīng)鑒定青島地區(qū)煙草白粉病的病原為Golovinomyces orontii[4]，關(guān)于該病原菌的生物學(xué)特性國(guó)內(nèi)外未見報(bào)道。為了明確該病害發(fā)生發(fā)展的條件，對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，以期為煙草白粉病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

將在青島采到的煙草白粉病新鮮病樣，采用單分生孢子梗接種，進(jìn)行分離純化、擴(kuò)繁，獲得菌株HMQAU12078并保藏于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)真菌學(xué)研究室。

1.2 生物學(xué)特性的研究

采用水瓊脂玻片法[5]進(jìn)行煙草白粉病菌的生物學(xué)特性研究，每一塊粘附有白粉病菌分生孢子水瓊脂玻片（下面簡(jiǎn)稱水瓊脂玻片）為一個(gè)單位，用于溫度、相對(duì)濕度、光照、pH及碳、氮源等影響因子的各個(gè)處理，每個(gè)處理3次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)統(tǒng)計(jì)分生孢子數(shù)大于 200個(gè)。以25℃，100%相對(duì)濕度，全黑暗的2%水瓊脂為對(duì)照。試驗(yàn)中除變量外，其他培養(yǎng)條件均為最適條件（25℃，相對(duì)濕度100%，全黑暗）。孢子萌發(fā)率全部通過反正弦轉(zhuǎn)換,采用DPS7.05軟件中的Duncan新復(fù)極差法比較不同處理的孢子萌發(fā)率( P = 0. 01) ,并進(jìn)行方差分析。

1.2.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

將上述水瓊脂玻片放在培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)皿蓋和底均鋪有濕潤(rùn)濾紙，在培養(yǎng)過程中滴加無菌蒸餾水保持濾紙濕潤(rùn)，以保證培養(yǎng)皿中的相對(duì)濕度為100%，分別置于 5 ℃、10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，并在培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h后觀察分生孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

此外，用0.5 %吐溫洗下煙草白粉病菌的新鮮分生孢子制成孢子懸浮液，適量移入1.5 mL離心管中，分別置于 40 ℃、41 ℃、42 ℃、43 ℃、44 ℃、45 ℃恒溫水浴10min，后將分生孢子懸浮液涂布在水瓊脂玻片上，25 ℃恒溫保濕培養(yǎng)，24 h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.2 相對(duì)濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

將水瓊脂玻片分別置于相對(duì)濕度為31%、43%、51%、71%、81%、93%、100%的組培瓶?jī)?nèi)，用25℃下不同鹽的飽和溶液來控制濕度[3],25℃恒溫培養(yǎng)，24h后觀察統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.3 光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

設(shè)全光照(30000lux）、全黑暗和12h光暗交替3個(gè)處理，分別培養(yǎng)0、6、12、24h后觀察孢子萌發(fā)情況，統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.4 pH值對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

用無菌1mol/L的NaOH和HCl分別配置pH為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的2%水瓊脂，對(duì)照為蒸餾水配制的2%水瓊脂，將裝有水瓊脂玻片的培養(yǎng)皿，分別在最適條件下培養(yǎng)0h、6h、12h、24h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

1.2.5 碳氮源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

配制含不同碳源的水瓊脂培養(yǎng)基，方法如下：以每100mL 2%的水瓊脂中加入2g葡萄糖中的含碳量為標(biāo)準(zhǔn)，折算其它碳源（葡萄糖、果糖、D-木糖、甘露醇、麥芽糖、蔗糖、淀粉、纖維素）的量，以制作相應(yīng)碳源的水瓊脂玻片，以不含上述碳源的水瓊脂片為對(duì)照，在最適條件下培養(yǎng)0h、6h、12h、24h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

配制含不同氮源的水瓊脂培養(yǎng)基，方法如下：以每100mL 2%的水瓊脂中加入2g尿素中的含氮量為標(biāo)準(zhǔn)，折算其它的氮源（谷氨酸、甘氨酸、 L-賴氨酸、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鉀、尿素、牛肉膏）的量，以制作相應(yīng)氮源的水瓊脂玻片，以不含上述氮源的水瓊脂片為對(duì)照，在最適條件下培養(yǎng)0h、6h、12h、24h后統(tǒng)計(jì)萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

溫度對(duì)煙草白粉病菌分生孢子萌發(fā)的影響有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。分生孢子在5 ℃和35 ℃時(shí)萌發(fā)率較低，但在5℃時(shí)分生孢子一直保持著活性，分生孢子在10℃-30℃均能萌發(fā)，萌發(fā)適宜溫度范圍是20℃-25℃，萌發(fā)的最適溫度是25℃，萌發(fā)快且萌發(fā)率高（表1）。

煙草白粉病菌分生孢子在41℃水浴10min后的萌發(fā)率為1.67%，而42℃和43℃10min后的萌發(fā)率均為0，故其致死溫度為42℃。

表1 溫度對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.1 Effect of temperature on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

2.2 相對(duì)濕度對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

煙草白粉病菌分生孢子在相對(duì)濕度為31%～100%均能萌發(fā)（表2），隨著相對(duì)濕度的增大，萌發(fā)率增加。通過對(duì)培養(yǎng)24h后的孢子萌發(fā)率進(jìn)行差異顯著性分析發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度為93%與100%之間差異沒有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，適宜的萌發(fā)濕度為93%～100%。試驗(yàn)中觀察到，分生孢子在水滴中不萌發(fā)。

表2 濕度對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.2 Effect of humidity on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

2.3 光照對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

差異顯著性分析表明不同光照處理對(duì)分生孢子萌發(fā)影響沒有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明煙草白粉病菌分生孢子的萌發(fā)對(duì)光照要求不嚴(yán)格（表3）。

表3 光照對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.3 Effect of sunlight on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

2.4 pH對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

分生孢子在pH為3-12之間均能萌發(fā)；pH為5-8時(shí)，萌發(fā)率均較好，通過差異顯著性分析表明，培養(yǎng)24h后對(duì)照和pH為5、6、7、8之間的萌發(fā)率差異沒有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；但pH為6時(shí)萌發(fā)最快，6h的萌發(fā)率達(dá)到74%，對(duì)照pH為6.2時(shí)萌發(fā)率最高85.7%。表明煙草白粉病菌分生孢子對(duì)酸堿環(huán)境的適應(yīng)性較廣，但相對(duì)來說較喜弱酸環(huán)境（表4）。

表4 pH對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.4 Effect of pH value on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

2.5 碳氮源對(duì)分生孢子萌發(fā)的影響

碳源利用試驗(yàn)結(jié)果表明，煙草白粉病菌能利用8種不同碳源，優(yōu)先利用的順序?yàn)閱翁牵倦p糖＞多糖，單糖中果糖的利用效果最好且能較快利用，雙糖中蔗糖對(duì)于早期萌發(fā)率有促進(jìn)作用，多糖較難利用。差異顯著性分析表明培養(yǎng)24h后，煙草白粉病菌對(duì)單糖和雙糖的利用沒有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，多糖利用較慢；除纖維素外，其它碳源的分生孢子萌發(fā)率都大于或等于80%，以果糖的效果最佳；與對(duì)照比較，果糖在萌發(fā)過程中有促進(jìn)作用，而纖維素在萌發(fā)過程中有抑制作用（表5）。

表5 碳源對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.5 Effect of carbon source on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

氮源利用試驗(yàn)結(jié)果表明，在供試的氮源中，除甘氨酸在萌發(fā)初期（6h）有促進(jìn)作用之外，所有氮源對(duì)分生孢子的萌發(fā)均有不同程度的抑制作用。其中谷氨酸抑制效果最強(qiáng)，其次為牛肉膏，硫酸銨、硝酸鉀及硝酸銨的抑制作用中等，L-賴氨酸和尿素的抑制作用較弱，甘氨酸抑制作用最弱（表6）。

表6 氮源對(duì)煙草白粉病病原菌分生孢子萌發(fā)的影響Tab.6 Effect of nitrogen source on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen

3 結(jié)論與討論

關(guān)于煙草白粉病的國(guó)內(nèi)外報(bào)道和記載較多，但大多集中于病原鑒定和病害報(bào)道[3,6]，國(guó)內(nèi)對(duì)煙草白粉病的報(bào)道多為藥劑防治效果和病害田間流行的因素等等[7-11]。由于煙草白粉病的病原是專性寄生菌，不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)，因此關(guān)于其生物學(xué)特性研究較少。最近幾年青島地區(qū)煙草白粉病發(fā)生嚴(yán)重，本研究在明確了青島地區(qū)煙草白粉病菌為Golovinomyces orontii的基礎(chǔ)上，對(duì)該病原的生物學(xué)特性進(jìn)行了探討。試驗(yàn)結(jié)果表明：煙草白粉病菌在5℃-35℃和相對(duì)濕度31%-100%范圍內(nèi)均能萌發(fā)，分生孢子的致死溫度為42℃ 10min，因此煙草白粉病菌的分生孢子具有較廣的溫濕度適應(yīng)范圍，且不耐高溫。實(shí)際上青島的全年月平均溫度溫度都低于40℃，且只有1～3月和12月月平均溫度低于5℃；青島的年平均相對(duì)濕度為73%，7月份最高，為89%；12月份最低，為68%，因此煙草白粉病菌在青島地區(qū)較易存活下來，對(duì)當(dāng)?shù)責(zé)煵萆a(chǎn)存在潛在危害。煙草白粉病菌對(duì)光照要求不嚴(yán)格。在pH為5-8時(shí)分生孢子的萌發(fā)并無顯著差異，因此在實(shí)際生產(chǎn)中不能通過酸堿度來控制煙草白粉病。在碳氮源利用方面，對(duì)碳源的要求不十分嚴(yán)格；對(duì)氮源要求嚴(yán)格，供試氮源對(duì)孢子萌發(fā)均有不同程度的抑制作用，據(jù)此在煙草的實(shí)際種植中可通過氮肥來控制煙草白粉病。

青島位于山東半島南端，東、南瀕臨黃海，屬于北溫帶季風(fēng)區(qū)域，具有海洋性氣候特征——空氣濕潤(rùn)，溫度適中，四季分明，日溫差小，利于煙草白粉病的發(fā)生。根據(jù)青島地區(qū)煙草白粉病菌的生物學(xué)特性和當(dāng)?shù)氐臍夂驐l件，本研究建議在青島地區(qū)煙草生產(chǎn)上應(yīng)合理密植，勤收煙葉，創(chuàng)造利于通風(fēng)透光的條件；同時(shí)可結(jié)合葉面噴施氮肥來減少病害的發(fā)生和危害。

[1]劉桂玲. 煙草白粉病流行因素及防治對(duì)策[J]. 貴州農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1998, 26(5): 38-40.

[2]朱賢朝, 王彥亭, 王智發(fā). 中國(guó)煙草病害[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2002: 85-88.

[3]戴芳瀾. 中國(guó)真菌總匯[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1979:1-1527.

[4]邢荷荷，梁晨，于靜, 等. 青島地區(qū)煙草白粉病病原[J].菌物學(xué)報(bào)，2015, 34（1）：159-163.

[5]于靜, 梁晨, 邢荷荷. 茄白粉病菌的生物學(xué)特性[J]. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（4）：473-477.

[6]Braun U. The powdery mildews (Erysiphales) of Europe [J].Jena：Gustav Fischer Verlag，1995: 1-337.

[7]郭齊湯, 陳巧紅, 陳文樂, 等. 幾種藥劑對(duì)煙草白粉病田間防效初探[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2009, 21(12): 120- 121.

[8]楊興, 秦鐵偉, 楊峰剛, 等. 煙草白粉病的發(fā)生原因及防治技術(shù)研究[J]. 山西農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, (4): 27-29.

[9]程寶玉, 蘇富強(qiáng), 陳衛(wèi)華. 豫西煙草白粉病發(fā)生規(guī)律及損失估計(jì)研究[J]. 煙草科技, 1995, 110(1): 40-41.

[10]汪漢成, 楊雙劍, 許冬青, 等. 苯并噻二唑?qū)ζ∮鐭煵莅追鄄〉恼T導(dǎo)抗性及其對(duì)煙苗安全性研究[J]. 植物保護(hù), 2012, 38(6): 123-126.

[11]牟建英, 錢玉梅, 任民, 等. 煙草白粉病抗性基因的QTL定位[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)， 2013，19（4）：105-108.

Biological characteristics of tobacco powdery mildew pathogen

XING Hehe1, LIANG Chen1, YU Jing1, ZHANG Chengsheng2, KONG Fanyu2, WANG Fenglong2
1 College of Agronomy and Plant Protection, Qingdao Agricultural University, Qingdao 266109, China；2 Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China

Water agar slide method was used for measuring the effect of different environmental and nutritional factors on conidia germination of tobacco powdery mildew pathogen Golovinomyces orontii (Castagne) V. P. Heluta. Results indicated that optimum temperature for germination was 25℃ , lethal temperature for conidia was 42℃ 10min and optimal relative humidity was 93%-100%. It was also found that conidia germination had no strict requirement for illumination. There is no signi fi cant difference in conidia germination rates within pH range of 5 to 8. The pathogen could utilize all tested carbon sources, among which fructose was the best. Tested nitrogen sources had different inhibition effect on conidia germination.

powdery mildew; conidia germination; water agar slide method; environmental factor; nutritional factor

:XING Hehe, LIANG Chen, YU Jing, et al. Biological characteristics of tobacco powdery mildew pathogen [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2015, 21(2)

邢荷荷,梁晨,于靜,等. 煙草白粉病菌的生物學(xué)特性研究[J]. 中國(guó)煙草學(xué)報(bào)，2015,21（2）

中國(guó)煙草總公司科技項(xiàng)目( 11020090065)；煙草病蟲害監(jiān)測(cè)與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室開放課題資助（BC 201007）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30870010)

邢荷荷（1988—），研究生，主要研究白粉菌分類與茄科白粉病生物防治,Tel:0532-86080007，Email:xinghehe53@163.com

梁晨（1971—）博士，教授，主要研究白粉菌分類及其生物防治,Email:syliangchen@163.com

2014-02-15