兩種方式注射白消安對SD大鼠生精功能的影響*

李學(xué)銀，張衛(wèi)星，張?zhí)鞓?biāo)，李 銳，王朝亮，王 瑞#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科 鄭州450052 2)河南省高等學(xué)校臨床醫(yī)學(xué)重點(diǎn)學(xué)科開放實(shí)驗(yàn)室;鄭州大學(xué)腫瘤分子外科研究所鄭州450052

白消安又稱馬利蘭，為氮芥類烷化劑，臨床上常用于慢性粒細(xì)胞性白血病的化療。既往文獻(xiàn)［1-2］報(bào)道中有以腹腔注射40 mg/kg 白消安建立大小鼠唯支持細(xì)胞綜合征模型的先例，但是作者在前期實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此劑量引起實(shí)驗(yàn)組34只SD 大鼠全部死亡，死亡時(shí)間為注射后7～12 d。雖然Ogawa 等［3］曾指出大鼠對白消安毒害作用更為敏感，白消安也更多地用于制備小鼠生精功能障礙模型和唯支持細(xì)胞綜合征模型，但大鼠用于此類動(dòng)物模型制作具有許多不可替代的優(yōu)勢如:大鼠生命力強(qiáng)，能耐受多種有創(chuàng)操作;大鼠睪丸較大，方便行病理學(xué)檢查，且為后續(xù)研究中注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)提供方便;大鼠的精子發(fā)生過程與人類更接近［4］;既往文獻(xiàn)對大鼠BMSCs 的研究更成熟、深入，因此該實(shí)驗(yàn)選擇SD 大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象。在結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)［5-6］的基礎(chǔ)上，作者觀察了分別經(jīng)腹腔分次注射及睪丸內(nèi)注射不同劑量白消安對SD 大鼠生精功能的影響，探討以其建立SD 大鼠生精功能障礙模型的可行性，為最終建立穩(wěn)定可靠的SD 大鼠唯支持細(xì)胞綜合征模型打下基礎(chǔ)，報(bào)道如下。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑 140只6～8 周雄性SD大鼠［許可證號(hào):SCXK(魯)2013-0001］，體重250～280 g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，飼料及墊料由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，于河南省醫(yī)藥科學(xué)研究院動(dòng)物中心飼養(yǎng)并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。白消安(大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度＞98．5%)，二甲基亞砜(DMSO，鄭州萊寶生物科技有限公司，純度＞99．9%)，水合氯醛(普通市售，配制質(zhì)量濃度為100 g/L)。腹腔注射組白消安溶液的制備:每8 mg 白消安溶于1 mL DMSO 中，加入1 mL 雙蒸水，混勻;睪丸內(nèi)注射組白消安溶液的制備:以移液管分別取DMSO 和雙蒸水各0．025 mL 置于EP 管中，將白消安先溶于DMSO 再溶于雙蒸水，最終白消安質(zhì)量濃度為0．50～2．24 g/L?，F(xiàn)用現(xiàn)配，注射時(shí)將混合液置于37℃水浴箱中以防白消安析出。

1．2 經(jīng)腹腔分次注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，每組10只。A1、B1、C1、D1組(實(shí)驗(yàn)組)分別注射劑量為40、30、20 和15 mg/kg 的白消安溶液，每只注射0．9～2．8 mL，E1組(溶劑對照組)注射DMSO 溶液2 mL，F(xiàn)1組(陰性對照組)注射雙蒸水2 mL，G1組(空白對照組)不處理。注射方法:以上劑量分為5次隔天注射入大鼠腹腔。

1．3 睪丸內(nèi)注射白消安溶液 70只SD 大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為7組，每組10只，均注射左睪丸，A2、B2、C2、D2組注射劑量分別為0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg 的白消安溶液，E2組注射DMSO 溶液(溶劑對照組)，F(xiàn)2組注射雙蒸水(陰性對照組)，G2組(空白對照組)不處理。將大鼠仰臥位固定于大鼠固定板，以3 mL/kg 劑量水合氯醛腹腔注射麻醉后以吉爾碘消毒左側(cè)睪丸局部皮膚，以1 mL 注射器抽取溶液并注射至大鼠左側(cè)睪丸(由于睪丸體積較小，故統(tǒng)一注射0．05 mL)，進(jìn)針約達(dá)睪丸橫徑1/3 時(shí)開始推液，邊注射邊進(jìn)針，約至睪丸橫徑2/3 時(shí)推完溶液。

1．4 血常規(guī)檢測 將大鼠麻醉后以心臟采血法取血1～2 mL，采用日立7150 全自動(dòng)血液分析儀自動(dòng)檢測各組紅細(xì)胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、血小板(PLT)。由于腹腔注射組不斷有大鼠死亡，所以在觀察到大鼠有明顯瀕死表現(xiàn)時(shí)即麻醉并取血和雙側(cè)睪丸;睪丸內(nèi)注射組觀察30 d 后取血和雙側(cè)睪丸。

1．5 睪丸病理檢查 所取大鼠睪丸標(biāo)本均以40 g/L 甲醛溶液固定、包埋、切片，并行HE 染色，使用德國Leica 顯微鏡觀察攝片。采用Salman 等［7］提出的改良Johnson 評分法評分。

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17．0 處理數(shù)據(jù)，各組間RBC、HGB 及睪丸病理評分的比較采用單因素方差分析和LSD-t 檢驗(yàn)，不符合方差齊性的數(shù)據(jù)(PLT)采用Wilcoxon 秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0．05。

2 結(jié)果

2．1 生存狀況 腹腔注射實(shí)驗(yàn)中各實(shí)驗(yàn)組大鼠全部死亡，A1組死亡時(shí)間為完全注射白消安后0～2 d，B1組為4～6 d，C1組為12～21 d，D1組為9～16 d，死亡前均表現(xiàn)為虹膜變?yōu)榛野咨⒀鄄€結(jié)痂、活動(dòng)遲緩等，另有部分表現(xiàn)有鼻周、肛周血跡，尾部皮膚破損等，各對照組均生長良好，無類似表現(xiàn)。睪丸內(nèi)注射組均生長良好。

2．2 血常規(guī)檢查 由于部分大鼠突然死亡或取血時(shí)發(fā)生血凝，腹腔注射實(shí)驗(yàn)中4 實(shí)驗(yàn)組只獲得15 份血常規(guī)結(jié)果，分別為A1組3 份，B1組3 份，C1組5份，D1組4 份。腹腔注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠血常規(guī)值見表1。睪丸內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠血常規(guī)結(jié)果見表2。2．3 睪丸病理 HE 染色結(jié)果見圖1，2 實(shí)驗(yàn)各組大鼠睪丸組織Johnsen 評分結(jié)果見表3、4。

表1 腹腔注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

表2 睪丸內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠血常規(guī)檢測結(jié)果

圖1 腹腔注射實(shí)驗(yàn)和睪丸內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)中各組大鼠睪丸病理表現(xiàn)(HE，×400)

表3 腹腔注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠睪丸病理評分

表4 睪丸內(nèi)注射實(shí)驗(yàn)各組大鼠睪丸病理評分

3 討論

近年來，重度少弱精癥及無精癥患者呈增加的趨勢?？蒲猩舷虿G丸移植BMSCs［8-9］已成為研究熱點(diǎn)，并且已有證據(jù)［10-11］證明鼠類BMSCs 能分化為睪丸生精細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞或者說是生精細(xì)胞樣和間質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞。白消安成分明確，對于大鼠的毒性主要為抑制骨髓造血干細(xì)胞。既往報(bào)道［2-3］用白消安制作大鼠生精功能障礙模型的劑量與致死率高低不一，40 mg/kg 劑量單次腹腔注射致死率在12．5%～100．0%。結(jié)合周雪原等［5］的經(jīng)驗(yàn)，考慮到連續(xù)10次腹腔注射對大鼠損傷較大、操作復(fù)雜，該研究腹腔注射白消安中實(shí)驗(yàn)組采用隔天、連續(xù)5次注射15～40 mg/kg 的白消安溶液，結(jié)果0～21 d 內(nèi)各實(shí)驗(yàn)組大鼠仍全部死亡，血RBC、HGB 和PLT 較空白對照組降低;此外，可能由于死亡時(shí)間較早，各劑量組睪丸病理評分較空白對照組無明顯改變。

為探尋建立一種更為簡便、穩(wěn)定的生精功能障礙實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的方法，作者亦嘗試了睪丸內(nèi)注射白消安溶液?？紤]到大鼠睪丸與體重比值約為1∶100，且睪丸內(nèi)注射使得藥物直接浸潤作用于睪丸，故劑量設(shè)定為0．1、0．2、0．3 和0．4 mg/kg，結(jié)果顯示給藥組大鼠均生長良好，無一死亡，血RBC、HGB 和PLT 值較空白對照組無明顯變化，睪丸病理評分較空白對照組降低，但各組精原細(xì)胞及精母細(xì)胞均存在，說明4種劑量的白消安均可造成大鼠睪丸生精功能障礙，但尚不足以制作BMSCs 移植所需的唯支持細(xì)胞綜合征模型。結(jié)合王?。?］的經(jīng)驗(yàn):6 mg/kg 劑量可以建立小鼠唯支持細(xì)胞綜合征模型，可以推測存在合適的較大的劑量制備大鼠唯支持細(xì)胞綜合征模型。由于睪丸內(nèi)注射吸收面積遠(yuǎn)較腹腔注射小，并且即使加大劑量，白消安進(jìn)入血液的量也遠(yuǎn)較腹腔注射吸收少，因此并不會(huì)明顯增加對大鼠的毒害，可以在一個(gè)較大的劑量區(qū)域找出合適的劑量制備大鼠唯支持細(xì)胞綜合征模型。

綜上所述，經(jīng)腹腔注射白消安對大鼠毒害性很大，分5次隔天注射15～40 mg/kg 劑量白消安仍會(huì)導(dǎo)致大鼠30 d 內(nèi)死亡;0．1～0．4 mg/kg 劑量白消安睪丸內(nèi)注射均能引起大鼠生精功能障礙，是一種新的、值得深入研究的方法。

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