多拷貝基因座DYF399S1在河南漢族群體中的遺傳多態(tài)性分析*

張 晶，王 磊，黃艷梅#，馬亞磊，尚萬兵，張銀珂，郭 棟，黃書琴

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室 新鄉(xiāng)453003 2)鄭州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所 鄭州450000

Y 染色體短串聯(lián)重復(fù)序列(Y chromosome short ta ndem repeat，Y-STR)遺傳標(biāo)記具有分型簡單、易于擴(kuò)增、重復(fù)性好、易于推廣、屬于男性特有、呈父系遺傳等特點(diǎn)［1-2］，能夠有效地反映人群分化、遷徙的信息［3］，目前仍然是法醫(yī)遺傳學(xué)研究的熱點(diǎn)，在法醫(yī)實(shí)踐中成為分析混合斑、微量、降解的生物檢材的個(gè)人識別和父系男性成員間親權(quán)鑒定的重要手段［4］。

DYF399S1 基因座是繼DYS385a/b、DYS389Ⅰ/Ⅱ、DYS459a/b、DYS464a/b/c/d 和DYS527a/b 等之后，在Y 染色體上發(fā)現(xiàn)的又一多拷貝基因座［5-7］，目前對于多拷貝Y-STR 基因座的研究較少，缺乏群體數(shù)據(jù)。作者對DYF399S1 在河南漢族248 名無關(guān)男性個(gè)體中的單體型分布和遺傳多態(tài)性進(jìn)行了分析，為其在法醫(yī)學(xué)和人類學(xué)中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1．1 群體樣本來源及模板DNA 的提取 248 名河南漢族無關(guān)男性個(gè)體均簽署知情同意書，其三代以內(nèi)均在河南生活。采集血標(biāo)本，采用酚-氯仿法提取基因組DNA。

1．2 DYF399S1 基因檢測 DYF399S1 基因座引物正向序列為5'FAM-GGGTTTTCACCAGTTTGCAT-3'，反向序列為5'-CCATGTTTTGGGACATTCCT-3'，由Invitrogen 生物有限公司-上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系25 μL，包含1 ×Taq DNA 聚合酶緩沖液，200 μmol/L dNTPs，0．5 μmol/L 引物，30～50 ng 模板DNA，1 U Taq Plus DNA 聚合酶(Thermo scientific 賽默飛公司)。熱循環(huán)參數(shù):預(yù)變性94℃3 min;94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸35 s，32個(gè)循環(huán);產(chǎn)物于4℃保存。采用60 g/L 中性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物，產(chǎn)物經(jīng)電泳分離后送Invitrogen 生物有限公司-上海英駿生物技術(shù)有限公司測序。運(yùn)用ABI 3130 基因自動分析儀和GeneMapper ID v3．5 軟件分析結(jié)果。

1．3 等位基因分型

1．3．1 標(biāo)準(zhǔn)物的制備 將各等位基因片段在60 g/L 中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳，回收后分別放入500 μL EP 管中，加40 μL 0．5 ×TE 過夜，然后取3．0 μL作模板，按1．2 條件擴(kuò)增。將擴(kuò)增后的產(chǎn)物等比例混勻。

1．3．2 等位基因的命名 DYF399S1 在Y 染色體上有3個(gè)位置［8］，預(yù)期擴(kuò)增后觀察到的片段有1～3個(gè)。參考E-型命名法，結(jié)合觀察到的片段大小和電泳時(shí)各片段的峰高比率進(jìn)行等位基因命名［9］。根據(jù)觀察到的片段，若僅有1個(gè)峰或1 條帶，則讀取3個(gè)相同的等位基因;若有2 條深淺不同的帶或2個(gè)高度不同的峰，則帶深或峰高者讀取2個(gè)相同的等位基因，帶淺或峰低者讀取1個(gè)等位基因;若有3 條帶，則讀取3個(gè)不同的等位基因。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 單體型多樣性(haplotype diversity，HD)=n(1 －∑χ2)/(n－1)，n 表示樣本數(shù)，x 為群體中每一種等位基因(或單體型)的頻率［10］。個(gè)體識別力(the discriminating power，DP)=1－∑Pi2［10］。單體型辨別能力(discrimination capacity，DC)=n/N，N 表示樣本數(shù)，n 表示僅出現(xiàn)1次的單體型的個(gè)數(shù)［8］。

2 結(jié)果

2．1 DYF399S1 基因座序列分析 DYF399S1 基因座是3 拷貝基因座，在Y 染色體上有3個(gè)不同的片段，分型圖譜見圖1，電泳結(jié)果見圖2。

圖1 DYF399S1 基因座分型圖譜

圖2 DYF399S1 基因座PAGE 電泳圖

2．2 DYF399S1 基因座基序分析 根據(jù)測序結(jié)果(圖3)，該基因座在河南漢族群體中基序表現(xiàn)為(GAAA)3N7(GAAA)12-22，其模塊結(jié)構(gòu)包括1個(gè)變異的核心序列模塊和1個(gè)固定的重復(fù)序列，根據(jù)變異模塊結(jié)構(gòu)中核心序列的重復(fù)次數(shù)進(jìn)行等位基因的命名。在河南漢族群體248例無關(guān)男性個(gè)體中，共觀察到11個(gè)不同的等位基因，即核心序列重復(fù)數(shù)目變異在12～22(表1)，共有序列為aggtagaggg aggccaaaagcccaacaggaaaaaataaaa(gaaa)3aagaaaa(gaaa)11-23gaacttttacccttttgacagcatatgagacttctgggttcttttctcctgggtccaat cctaagctgtccagtttaatgtttgggaaattaactcttccaaacttggaggatgca ttgaag。下劃線為引物序列，括號內(nèi)為DYF399S1 基因座的核心序列。

圖3 DYF399S1 基因座重復(fù)序列測序結(jié)果(正向)

表1 DYF399S1 基因座等位基因及基序

2．3 DYF399S1 等位基因及頻率 11個(gè)等位基因的名稱與頻率見表2。單體型分布見表3。由表3可以看出，3個(gè)拷貝組成的單體型有94種，出現(xiàn)最多的單體型是18/18/18，頻率是0．080 6;僅出現(xiàn)1次的單體型有49種，頻率是0．004 0。HD 和DP 分別為0．865 5 和0．862 1，DC 為0．372 5。

表2 DYF399S1 基因座等位基因的分布

表3 DYF399S1 基因座單體型的分布

續(xù)表3

3 討論

DYF399S1 是目前發(fā)現(xiàn)的惟一的3 拷貝Y-STR基因座［11］，相當(dāng)于3個(gè)位點(diǎn)，將基因座命名為DYF399S1a/b/c。作者在河南漢族群體中觀察到其基序?yàn)?GAAA)3N7(GAAA)n，與Henson 等［11］報(bào)道的一致;但是與Henson 等［11］報(bào)道的14～21 及1個(gè)變異等位基因20．1 不同，作者在248 名河南漢族個(gè)體中觀察到的等位基因是12～22，未發(fā)現(xiàn)變異的等位基因。

DYF399S1 基因座和DYS464 基因座都是已知的快速突變基因座，它們對于有關(guān)男性個(gè)體的鑒別有重要意義［12-13］。作者用PCR 法檢測了248 名河南漢族無關(guān)男性個(gè)體，共發(fā)現(xiàn)11個(gè)不同長度的片段，它們具有相同的模塊結(jié)構(gòu)，由于還無法將其各個(gè)拷貝準(zhǔn)確定位，因此推測DYF399S1 或許隱藏著更高的多態(tài)性［14］。

在248 名河南漢族無關(guān)男性個(gè)體中，DYF399S1基因座組成的單體型有94種，DC 為0．372 5，HD和DP 分別為0．865 5 和0．862 1。說明多拷貝YSTR 基因組DYF399S1 具有高度多態(tài)性，在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐和人類進(jìn)化研究中具有很好的應(yīng)用前景。

［1］Shi MS，Bai RF，F(xiàn)u B，et al．Polymorphism of 17Y-STR loci in Shanxi Han population and genetic relationship with 13 populations［J］．Yi Chuan，2011，33(3):228

［2］Weng GW，Liu UH，Liu C，et al．Haplotype frequency and mutation of 17 Y-STR loci in Han population in Guangdong Province［J］．Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao，2013，33(3):412

［3］朱永生，霍正浩，賴江華，等．27個(gè)群體7個(gè)Y-STR 基因座多態(tài)性的聚類分析［J］．現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，9(2):234

［4］Kim SH，Han MS，Kim W，et al．Y chromosome homogeneity in the Korean population［J］．Int J Legal Med，2010，124(6):653

［5］黃艷梅，區(qū)敬華，朱偉鋒，等．漢族人群Y 染色體多拷貝基因座DYS464 遺傳多態(tài)性［J］．中山大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)科學(xué)版，2006，27(1):55

［6］Huang D，Zhu C，Jiang H，et al．Haplotype Distribution of the multi-copy Y-STR loci DYS385，DYS459 and DYS464 in Chinese Han population［J］．J Forensic Sci，2005，50(6):1517

［7］Huang YM，Qi YJ，Xu JQ，et al．Sequence analysis of DYS522 and DYS527 loci and their genetic polymorphism among guangdong Han population［J］．Yi Chuan，2006，28(11):1355

［8］Ballantyne KN，Keerl V，Wollstein A，et al．A new future of forensic Y-chromosome analysis:rapidly mutating YSTRs for differentiating male relatives and paternal lineages［J］．Forensic Sci Int Genet，2012，6(2):208

［9］Schoske R，Vallone PM，Kline MC，et al．High-throughput Y-STR typing of U．S．populations with 27 regions of the Y chromosome using two multiplex PCR assays［J］．Forensic Sci Int，2004，139(2/3):107

［10］楊洪毅，徐朝陽，宋麗君，等．河南漢族14個(gè)Y-STR 基因位點(diǎn)單倍型的遺傳多態(tài)性［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，47(2):223

［11］Henson Gareth LC．DYF399S1:a unique three-copy short tandem repeat on the human Y chromosome［J］．J Genetic Genealogy，2005，1:8

［12］Redd AJ，Agellon AB，Kearney VA，et al．Forensic value of 14 novel STRs on the human Y chromosome［J］．Forensic Sci Int，2002，130(2/3):97

［13］Ballantyne KN，Goedbloed M，F(xiàn)ang R，et al．Mutability of Y-chromosomal microsatellites:rates，characteristics，molecular bases，and implications［J］．Am J Hum Genet，2010，87(3):341

［14］Lee EY，Shin KJ，Rakha A，et al．Analysis of 22 Y chromosomal STR haplotypes and Y haplogroup distribution in Pathans of Pakistan［J］．Forensic Sci Int Genet，2014，11:111