茬口及栽培環(huán)境對(duì)香椿黃酮含量和清除DPPH能力的影響

王趙改+王曉敏+楊慧+張樂+史冠瑩+王繼紅+梁萬平

摘 ? ?要：以國(guó)內(nèi)主栽品種紅油香椿為研究對(duì)象，在提取方法及溶劑選擇的基礎(chǔ)上，研究不同茬口及栽培環(huán)境對(duì)香椿不同部位黃酮含量和DPPH自由基清除活性的影響。結(jié)果表明：以70%乙醇為提取溶劑，采用微波法提取黃酮效果較好。頭茬香椿不同部位的黃酮含量及DPPH自由基清除活性均高于二茬香椿，露地栽培香椿不同部位的黃酮含量及DPPH自由基清除活性均高于大棚栽培。香椿嫩芽及嫩莖等幼嫩組織均不及香椿老葉及老莖部分。

關(guān)鍵詞：香椿;茬口;栽培環(huán)境;黃酮;DPPH清除能力

中圖分類號(hào)：S644.4 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.11.011

Effects of Different Crops and Cultivation Environment on Flavonoids Contents and DPPH-Scavenging Capacities of Toona sinensis

WANG Zhao-gai1， WANG Xiao-min1， YANG Hui1， ZHANG Le1， ?SHI Guan-ying1， WANG Ji-hong1， LIANG Wan-ping2

（1. Institute of Agricultural Products Processing， Henan Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， Henan 450008，China; 2. Institute of Resources and Environment， Zhumadian City of Agricultural Sciences， Zhumadian， Henan 463000，China）

Abstract： "Hongyou" Chinese toon （Toona sinensis）， the major cultivar in China， was used to investigate the effects of different crops and cultivation environment on flavonoid content and DPPH-scavenging capacities of Toona sinensis in different parts on the basis of selected extraction method and solvent. The results showed that with 70% ethanol as the extraction solvent， the microwave extraction had some slightly advantages of higher extraction yields and DPPH-scavenging capacities. The contents of flavonoids and DPPH-scavenging capacities in different parts of Toona sinensis in the first crop were higher than those in the second crop， and which cultivated outside were higher than those cultivated in greenhouse. Furthermore， the contents of flavonoids and DPPH-scavenging capacities in tender buds and stems were lower than those in old leaves and stems.

Key words： Toona sinensis; crops; cultivation environment; flavonoids; DPPH-scavenging capacity

香椿（Toona sinensis（A. Juss.）Roem），為楝科香椿屬的多年生落葉喬木[1-2]，是我國(guó)特有的集材、菜、藥為一體的珍貴樹種，分布于全國(guó)各地，尤以河南、山東、河北和安徽等地栽培居多。香椿富含人體所必須的氨基酸、脂肪酸、維生素、微量元素等多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及黃酮、多酚、皂苷、生物堿等活性成分[3-5]，具有很高的營(yíng)養(yǎng)保健價(jià)值，且在生長(zhǎng)過程中能夠分泌驅(qū)蟲物質(zhì)，無需噴施農(nóng)藥，是名副其實(shí)的綠色蔬菜[6]。在食品安全與健康問題成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外日益關(guān)注焦點(diǎn)的背景下，香椿的綠色、營(yíng)養(yǎng)、保健等優(yōu)點(diǎn)迎合了現(xiàn)代人追求健康飲食時(shí)尚的新潮流，深受國(guó)人的喜愛，并成為美國(guó)、德國(guó)、日本及東南亞等國(guó)家的新寵，具有很大的國(guó)際市場(chǎng)開發(fā)潛力[7]，同時(shí)，依靠傳統(tǒng)的天然采集方式已不能滿足香椿消費(fèi)需求，集約化栽培和保護(hù)地栽培正逐漸興起。

目前，對(duì)香椿的研究多集中在品種選育、栽培技術(shù)、貯藏保鮮及加工技術(shù)等方面[8]，而關(guān)于香椿中黃酮類活性物質(zhì)仍缺乏系統(tǒng)的研究，由于香椿具有明顯的生長(zhǎng)季節(jié)性和環(huán)境差異性，不同茬口和不同栽培環(huán)境下香椿所含的黃酮類活性物質(zhì)的含量及抗氧化性能也會(huì)有一定差異。同時(shí)，香椿目前的消費(fèi)多以嫩芽為主，而大量的老葉及木質(zhì)化枝條等老化組織常被廢棄，造成大量的資源浪費(fèi)及嚴(yán)重的環(huán)境污染。為此，本試驗(yàn)以紅油香椿為研究對(duì)象，對(duì)不同茬口及不同栽培環(huán)境的香椿嫩芽、老葉、嫩莖及老莖的黃酮含量和DPPH自由基清除活性進(jìn)行系統(tǒng)地分析比較，以明確香椿中黃酮類物質(zhì)在不同生長(zhǎng)條件下的空間積累分布情況和活性特征，以期為香椿的綜合加工利用及功能成分的深入研究提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

香椿品種為大棚栽培及露地栽培紅油香椿，分別于2015年1月5日、20日及4月20日、5月5日采收于河南省鄭州市中牟縣田莊村河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院香椿示范基地，分別記為頭茬和二茬。每茬香椿又分為嫩芽、老葉及嫩莖和老莖，其感官特征分別為：香椿嫩芽與嫩莖長(zhǎng)度均選取10 cm、無木質(zhì)化可鮮食;老葉、老莖為完全木質(zhì)化不可鮮食。新采摘的香椿于室溫陰涼處晾干，粉碎，過孔徑為0.40 mm篩，備用。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，Beijing Solarbio Science & Technology Limited Company;DPPH（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl），東京化成工業(yè)株式會(huì)社;硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、無水乙醇等，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司;Vc標(biāo)準(zhǔn)品，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-250A型高速多功能粉碎機(jī)，浙江省永康市松青五金廠;ME204E型電子天平，梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司;G70F20CN3L-C2（B0）型微波爐，廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司;SB-5200DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;NUⅡ-10T型實(shí)驗(yàn)室（超）純水機(jī)，南京優(yōu)普環(huán)保設(shè)備有限公司;SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司;HHS型電熱恒溫水浴鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;QL-901型Vortex，海門市其林貝爾儀器制造有限公司;玻璃儀器氣流烘干器，鄭州杜甫儀器廠;GENESYS 10S UV-VIS，Thermo Scientific。

1.3 方 ?法

1.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9] 稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.010 0 g，用70%的乙醇在超聲波下使其溶解，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中定容，搖勻即得質(zhì)量濃度為0.1 mg·mL-1的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，用移液管精密移取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL于10 mL比色管中，用70%乙醇補(bǔ)充各管體積至5 mL，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL，靜止5 min，然后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 5%的NaNO2溶液0.3 mL，靜止5 min，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%的 NaOH溶液3 mL，最后用70%乙醇定容至10 mL，搖勻，靜止15 min，以空白溶液作為對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)其吸光度（A），以吸光值為縱坐標(biāo)Y，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 黃酮提取 超聲輔助提取：稱取5.000 g香椿樣品粉末于圓底燒瓶中，超聲輔助溶劑提取后抽濾除渣，濾液定容至500 mL容量瓶中，得黃酮提取液，待測(cè)。

微波預(yù)處理提?。悍Q取5.000 g香椿樣品粉末放入培養(yǎng)皿中，先經(jīng)微波輻射預(yù)處理一段時(shí)間，再置于燒杯中恒溫水浴提取60 min（料液比1∶40，溫度60 ℃），抽濾除渣，得黃酮提取液，待測(cè)。

1.3.3 黃酮含量測(cè)定 采用1.3.1的方法測(cè)定黃酮提取液在510 nm的吸光度，然后按照下式計(jì)算香椿黃酮含量。

黃酮含量=（C×a×V）/w×100%

式中，C為提取液中黃酮濃度，mg·mL-1;a為稀釋倍數(shù)，10;V為提取液體積，500 mL;w為樣品粉末質(zhì)量，5 g。

1.3.4 DPPH清除能力的測(cè)定[10] 取10 mL比色管，各加入2.0 mL不同濃度樣品溶液，然后分別加入濃度為2×10-4 moI·L-1的DPPH溶液2.0 mL，混合搖勻，反應(yīng)30 min后在517 nm處測(cè)定其吸光度A1。以2.0 mL無水乙醇代替DPPH的吸光度為A2，以2.0 mL的蒸餾水代替樣品溶液的吸光度為A0，以無水乙醇作空白調(diào)零，同時(shí)以相同質(zhì)量濃度的Vc作為陽性對(duì)照，平行測(cè)定3次。清除率計(jì)算公式如下：

清除率=（1-（A1-A2）/A0 ）×100%

式中，A0為對(duì)照組吸光值;A1為樣液組吸光值;A2為空白組吸光值。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 所有試驗(yàn)均設(shè)計(jì)3次重復(fù)，記錄結(jié)果為平均值，采用OriginPro 8對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖1所示，以吸光值為縱坐標(biāo)Y，蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)X，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：Y=9.63X+0.013 3，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 0，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液在0.01～0.05 mg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2 不同提取方法比較

如圖2和3所示，采用微波輻射預(yù)處理法和超聲輔助提取法對(duì)紅油香椿不同部位的黃酮類化合物進(jìn)行提取，2種提取方法的香椿不同部位黃酮得率及DPPH自由基清除活性均相差不大，微波提取法略高于超聲波提取法，且老葉>嫩芽，老莖>嫩莖。這主要是由于超聲波法是通過空化作用產(chǎn)生剪切力破碎細(xì)胞，加速了香椿樣品中有效成分溶出[11];而微波法是利用微波輻射產(chǎn)生高頻電磁波，樣品材料內(nèi)分子互相碰撞擠壓，使得細(xì)胞內(nèi)有效成分從細(xì)胞壁周圍自由流出。兩者均是通過破壞細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)，來提高細(xì)胞通透性，加速胞內(nèi)物質(zhì)的溶出速度， 從而增加有效成分的提取率[12]。因此，在后續(xù)試驗(yàn)中，選擇微波法來提取香椿中黃酮類化合物。

2.3 不同萃取溶劑比較

由圖4和5可以看出，紅油香椿黃酮類化合物在80%甲醇、70%乙醇、80%丙酮中的提取效果較好，得率與DPPH自由基清除率均較高，在80%丙酮中提取效果最好，其次是80%甲醇、70%乙醇。由于溶劑極性大小為：甲醇>乙醇>丙酮>乙酸乙酯>氯仿>石油醚，而黃酮類化合物具有一定的極性，但極性并不是很大。因此，香椿黃酮類化合物在80%丙酮中溶解度要高于其它提取溶劑。從香椿不同部位黃酮得率和清除DPPH自由基能力來看，老葉>嫩芽，老莖>嫩莖。綜合考慮成本、安全性和同時(shí)高產(chǎn)率提取黃酮，故選擇乙醇為最佳提取溶劑。

2.4 不同茬口比較

采用微波輔助乙醇提取法對(duì)不同茬口紅油香椿黃酮類化合物進(jìn)行提取，并測(cè)定黃酮含量及DPPH自由基清除率。由圖6和7可以看出，頭茬香椿的黃酮含量高于二茬香椿，且不同部位表現(xiàn)出如下趨勢(shì)：老葉>嫩芽，老莖>嫩莖。由于黃酮為植物次生代謝產(chǎn)物，在香椿生長(zhǎng)發(fā)育的特定階段形成，其合成酶系因受到外界氣候環(huán)境變化影響，最終會(huì)造成黃酮含量不同采收時(shí)間的變化[13]。DPPH自由基清除活性與黃酮含量結(jié)果大體保持一致，但有略微差異，這可能是由于不同部位的黃酮提取液含有其他較多雜質(zhì)，彼此協(xié)同作用表現(xiàn)出區(qū)別于得率趨勢(shì)的抗氧化活性。

2.5 不同栽培環(huán)境比較

如圖8所示，不同栽培環(huán)境下頭茬香椿不同部位黃酮含量差別很大，棚栽香椿黃酮含量顯著低于露地栽培香椿的黃酮含量，這與羅旭璐等[14]對(duì)紫椿嫩葉的研究結(jié)果一致，露地栽培的黃酮含量大于大棚栽培的含量。這可能是黃酮類物質(zhì)合成受到不同栽培環(huán)境下光照、溫度、空氣濕度、土壤等條件的影響，因而表現(xiàn)出比較明顯的含量差異[15]。不同部位黃酮含量仍表現(xiàn)出如下趨勢(shì)：老葉>嫩芽，老莖>嫩莖。同時(shí)，清除DPPH自由基能力與黃酮含量結(jié)果保持一致，兩者呈正相關(guān)關(guān)系，如圖9所示，這是因?yàn)辄S酮類化合物含量與抗氧化活性密切相關(guān)，是重要的抗氧化活性成分。

3 結(jié)論與討論

（1）采用微波輻射預(yù)處理法和超聲輔助提取法對(duì)紅油香椿不同部位的黃酮類化合物進(jìn)行提取，比較分析黃酮得率及DPPH自由基清除率，表明微波法提取效果略優(yōu)于超聲波法。溶劑萃取方面，丙酮的提取效果最好，其次為甲醇、乙醇，但出于成本和安全性考慮，選擇乙醇為最佳提取溶劑。

（2）以70%乙醇為提取溶劑，采用微波法對(duì)不同茬口與栽培環(huán)境下香椿不同部位的黃酮含量及DPPH自由基清除活性進(jìn)行研究，表明頭茬香椿優(yōu)于二茬香椿，露地栽培優(yōu)于大棚栽培。

（3）黃酮類物質(zhì)是具有保健功能的天然產(chǎn)物，具有抗氧化、調(diào)節(jié)血糖、降血壓、軟化血管等多種生理活性。從香椿不同部位黃酮含量及DPPH自由基清除率方面來看，香椿嫩芽及嫩莖等幼嫩組織均不及香椿老葉及老莖部分，但香椿幼嫩組織營(yíng)養(yǎng)豐富[16-17]，多用于鮮食。而香椿老葉及老莖等老化廢棄組織由于木質(zhì)化程度高，不可鮮食，為香椿產(chǎn)業(yè)主要副產(chǎn)物，但由于其富含黃酮類化合物，為以后研究開發(fā)利用黃酮類天然活性物質(zhì)提供了良好的植物資源，同時(shí)為進(jìn)一步研制開發(fā)香椿抗氧化功能性食品奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

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