棉花粉蚧熱休克蛋白基因的鑒定

陳 芳，陸永躍

(華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系，廣州 510642)

棉花粉蚧Phenacoccus solenopsis Tinesly 屬于半翅目Hemiptera 綿粉蚧屬 Phenacoccus(Tinsley，1898;陸永躍等，2008;武三安等，2009)，是近年來我國對大田作物、園林觀賞植物、果樹和蔬菜等經(jīng)濟作物安全生產(chǎn)存在潛在嚴重威脅的一種外來入侵性害蟲(孫峰和陸永躍，2011;唐鍔等，2011)。該蟲具有較強的生物學可塑性，對高溫忍耐能力較強(丁吉同等，2013)，抗寒能力也較強，其過冷卻點低，可能適宜在中國北部更廣泛的區(qū)域生存(關(guān)鑫等，2009;馬駿等，2011)。

熱休克蛋白(heat shock proteins，Hsps)是細胞或生物體在一定時間(幾小時、幾分鐘、甚至幾秒鐘)內(nèi)遭受高于其正常生長溫度8-12℃(一般稱為亞致死溫度sub-lethal temperature)以上溫度時，新合成的或含量增加的一類蛋白質(zhì)，最早由Ritossa(1962)在研究果蠅熱誘導時被發(fā)現(xiàn)。Hsps 在分子進化上高度保守，并廣泛分布于微生物、植物、動物等各種生物體內(nèi)。在正常生理條件下Hsps 不存在或表達量低，但可被熱強烈誘導，具有保護細胞的功能，它們可能在昆蟲的抗逆溫中起到重要的作用(翟會芳等，2010;申建茹等，2011)。同時，Hsp 蛋白還參與生物體的繁殖行為(Michaud et al.，1997)、免疫反應(Pockley，2003)、滯育(Rinehart et al.，2007)以及昆蟲的變態(tài)發(fā)育等(Gu et al.，2012)，是生物體適應環(huán)境的一類重要蛋白。目前，大多數(shù)Hsp 分類法基于分子量，現(xiàn)在應用最多的是森本的劃分方法，將主要的HSP 分為4個家族:Hsp90 家族(分子量約83-100 kDa)、Hsp70 家族(分子量約66-78 kDa)、Hsp60 家族和小分子量smHsp 家族(分子量約12-43 kDa)(Kiang and Tsokos，1998)。真核細胞Hsp90 的分子特征是25 kDa 的N-端具有抗腫瘤抑制劑格爾德霉素和根赤霉素位點和一個靶蛋白的結(jié)合部位(Prodromou et al.，1997;Stebbins et al.，1997)，C-末端具有鈣調(diào)蛋白結(jié)合位點和多種蛋白的結(jié)合位點，C-端最末端4個氨基酸是EEVD(Glu-G1u-Val-Asp)。Hsp70 是生物體中最保守的一類熱休克蛋白家族，其家族成員均含有兩個主要的結(jié)構(gòu)域，N-端高度保守的44 kDa ATPase 功能域(ATP-binding domain)和一個25 kDa 的C-端區(qū)域組成，由于N-端有ATPase 功能域，因此可以結(jié)合ATP，C-端又可以分成保守的 15 kDa 的多肽結(jié)合功能域(polypeptide-binding domain)和不保守的靠近C-端最末端的10 kDa 可變區(qū)和C-端最末端的基序(motif)(陳勁松，2001)，不同類型的Hsp70成員的基序是特異性的，定位于胞質(zhì)中的基序為EEVD，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的為HDEL，線粒體中的為PEAEYEEAKK(Guy et al.，1998)。Hsp60 是分子量約為60 kDa 的一個具有高度保守性的Hsp 家族，其線粒體特征序列為AAVEEGIVPGGG。與其他熱激蛋白家族相比，small Hsp 家族的成員均含有一個約100個氨基酸的C-端保守區(qū)域(Lindguist et al.，1988)，該區(qū)域與α-晶體蛋白有很高的同源性，所以也稱為α-晶體結(jié)構(gòu)域，該保守區(qū)域和低分子量是鑒定該家族成員的重要特征。

棉花粉蚧的分布范圍廣，緯度跨度大，其生存環(huán)境溫度變化范圍大，但是棉花粉蚧能夠適應環(huán)境溫度的變化，成功生存、定殖，其體內(nèi)必然有與適應溫度相關(guān)的分子機制，然而，目前國內(nèi)外關(guān)于棉花粉蚧生物學和生態(tài)學的研究較多，而對該蟲分子生物學研究相對較少，主要有棉花粉蚧某些酶和蛋白在不同發(fā)育階段的表達分析(羅梅等，2012)，以及棉花粉蚧地理種群的遺傳分化研究(趙靜等，2014)。本研究在獲得棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組信息的基礎(chǔ)上，運用生物信息學軟件鑒定出Hsp 基因，為研究該蟲與適應溫度變化相關(guān)的基因奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

棉花粉蚧來源于華南農(nóng)業(yè)大學昆蟲學系昆蟲生態(tài)學實驗室，用新鮮棉葉飼養(yǎng)于人工氣候箱內(nèi)，溫度為26℃±1℃，濕度為70%±5%，光照為(14L∶10D)。棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組由北京諾和致源生物信息科技有限公司測定，轉(zhuǎn)錄組樣本為各齡期混合樣提取的RNA。

1.2 Hsp 基因鑒定

根據(jù)轉(zhuǎn)錄組中的數(shù)據(jù)信息，利用關(guān)鍵詞hsp，heat shock protein 等對轉(zhuǎn)錄組基因注釋的文件進行搜索，提取目標序列，提交到NCBI 用BlastX 等進行比對，確認目標序列為熱激蛋白序列，并將這些序列提交到GenBank，使用Protparam 預測棉花粉蚧Hsp 的相對分子質(zhì)量。

1.3 sHsp 二級結(jié)構(gòu)預測

使用在線蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預測軟件(https://www.predictprotein.org/)分析棉花粉蚧低分子量熱休克蛋白(sHsp)的二級結(jié)構(gòu)，并使用在線Inter ProScan 軟 件(http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html)分析sHsp 的功能結(jié)構(gòu)域，利用在線比對軟件ClustalW2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)進行sHsp 多序列比對分析。

1.4 Hsp 系統(tǒng)進化樹分析

從NCBI 數(shù)據(jù)庫下載模式昆蟲—鱗翅目家蠶Bombyx mori、雙翅目黑腹果蠅Drosophila melanogaster 和鞘翅目赤擬谷盜Tribolium castaneum的Hsp 序列，將鑒定得到的棉花粉蚧Hsp 序列與這三種昆蟲的Hsp 進行多序列比對，利用MEGA 5.0軟件(Tamura et al.，2011)，采用鄰位相連(Neighbor-Joining)算法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，使用bootstrap 檢驗進化樹的可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉花粉蚧Hsp 基因的鑒定及sHsp 分析

在棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組中共鑒定出24 條熱激蛋白(Hsp)基因，其中Hsp90 為3 條，Hsp70 為8 條，Hsp60 為2 條，small Hsp 為11 條，將這些序列遞交到GenBank，獲得了登錄號(表1)。所分析的8 條Hsp70 基因中有6 條序列包含完整的開放性閱讀框，另外3 條為部分序列;使用Antheprot 對所推導的氨基酸分析發(fā)現(xiàn)，6 條完整的序列均含有Hsp70 家族 3 條特征基序:IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSVL 和 VVLVGGSTRIPKIQQ，這6 條序列中其中有3 條序列以EEVD 結(jié)尾為胞質(zhì)基序，另外3 條以HDEL 結(jié)尾為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)基序。此外2 條非全長序列包含部分特征序列。所分析的3 條Hsp90 基因序列中有2 條包含完整的開放性閱讀框，經(jīng)Antheprot 軟件分析發(fā)現(xiàn)，這2 條序列均含有Hsp90 家族的5個簽名序列:YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、TGQFGVGFYSAYLVAD、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR。另外1 條均含部分特征序列。所分析的2 條Hsp60 基因中，其中有1 條包含完整的開放性閱讀框，并含有Hsp60 家族的特征序列:AAVEEGIVPGGG。小分子熱激蛋白基因序列保守性差，使用在線分析軟件InterProScan 分析了棉花粉蚧sHsp 的二級結(jié)構(gòu)，棉花粉蚧sHsp C 端包含經(jīng)典的α-晶體結(jié)構(gòu)域(圖1)。

2.2 棉花粉蚧Hsp 系統(tǒng)進化分析

進化樹分析顯示，棉花粉蚧、家蠶、黑腹果蠅和赤擬谷盜大分子量Hsp 與低分子量sHsp 之間在進化樹上各自獨立成族，沒有交叉成族現(xiàn)象，說明昆蟲中大分子量Hsp 和低分子量sHsp 分屬獨立的基因家族，從進化樹上可以觀察到棉花粉蚧、家蠶和黑腹果蠅的sHsp 均能獨立成族，赤擬谷盜無獨立成族現(xiàn)象，與棉花粉蚧有交叉成枝的現(xiàn)象(圖2)。大分子量熱激蛋白Hsp90 和Hsp70 在4個種間交叉成族，種屬特異性不強。相比于小分子熱激蛋白大分子熱激蛋白序列保守性強，目與目之間差異性較小。

表1 棉花粉蚧熱激蛋白基因以及與其他物種熱激蛋白相似性Table 1 Phenacoccus solenopsis heat shock protein(PsHsps)genes and their similarities with those of other species

(續(xù)上表)

圖1 棉花粉蚧小分子熱激蛋白(sHsp)多序列比對和功能結(jié)構(gòu)域分析Fig.1 Multiple aligments and analysis of functional domains of sHsp sequences from Phenacoccus solenopsis

圖2 棉花粉蚧、家蠶、黑腹果蠅和赤擬谷盜Hsp 系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of the Hsps of Phenacoccus solenopsis，Bombyx mori，Drosophila melanogaster and Tribolium castaneum

3 結(jié)論與討論

熱休克蛋白在昆蟲應對外界脅迫刺激時起著重要作用，該類蛋白質(zhì)主要作為分子伴侶與目標蛋白結(jié)合，保護蛋白在脅迫環(huán)境下的穩(wěn)定性，從而保護機體，在昆蟲抗逆境的生理過程中扮演了重要角色。目前對熱激蛋白的功能研究在多種生物上已有報道(李明等，2008;Fangue et al.，2009;申建茹等，2011)。近年來棉花粉蚧基因轉(zhuǎn)錄組測序的完成為棉花粉蚧Hsp 基因家族的鑒定提供了有利的平臺，在此基礎(chǔ)上本研究運用生物信息學方法，從棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出24個Hsp 基因，其中包括3個Hsp90、8個Hsp70、2個Hsp60 和11個sHsp 基因。所分析的8 條Hsp70 基因中有3 條定位為胞質(zhì)內(nèi)，3 條定位為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，胞質(zhì)內(nèi)的Hsp70 又有2種，一種為基礎(chǔ)合成型Hsc70(又稱Hsp73)，另一種為高度誘導型Hsp70(又稱為Hsp72)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Hsp70 的代表性成員是78 kDa 的蛋白稱為免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白(BiP 蛋白)或Grp78(Welch，1992)。小分子Hsp 是一個非常多樣的群體，廣泛分布于分枝菌和所有真核生物體內(nèi)。本研究從棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組鑒定的11個sHsp 基因，其編碼產(chǎn)物分子量大小在10-27.1 kDa 之間，C 端有均含有一個約100個氨基酸的C-端保守區(qū)域(α-crystalling domain)，該結(jié)構(gòu)域在分子識別和分子伴侶功能上發(fā)揮著重要的作用，并可作為識別sHsp 的重要結(jié)構(gòu)域，在分子進化分析上具有重要的意義(Montfort et al.，2001;Sun and MacRae，2005)。

系統(tǒng)進化樹分析顯示，棉花粉蚧、家蠶和黑腹果蠅的sHsp 都能獨立成族，而赤擬谷盜與棉花粉蚧和家蠶的親緣關(guān)系較近，均可匯成一枝。這說明昆蟲的sHsp 雖然有很強的保守性，但仍然具有種屬的特異性。Hsp70 是生物體內(nèi)最保守的一類熱休克蛋白(王薇等，2009)，進化樹分析顯示棉花粉蚧Hsp70 和家蠶、赤擬谷盜之間親緣關(guān)系較近，但是相比sHsp，Hsp70 的種屬特異性相對較弱，棉花粉蚧和家蠶之間，家蠶和黑腹果蠅之間，以及黑腹果蠅和赤擬谷盜之間均存在交叉現(xiàn)象，表明 Hsp70 蛋白家族在昆蟲中的保守性比sHsp 強。

本研究以棉花粉蚧轉(zhuǎn)錄組序列為材料，利用生物信息學軟件進行Hsp 基因的鑒定和分析，獲得24個Hsp 基因序列，并對Hsp 基因結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育、序列特征等方面進行了分析，為深入研究棉花粉蚧生長發(fā)育與Hsp 的關(guān)系，以及在特定脅迫如高溫、低溫等條件下Hsp 對棉花粉蚧的保護作用奠定了基礎(chǔ)。

References)

Chen JS.Progress of study on heat shock proteins in molecular genetics［J］.Section Genetics Foreign Medical Sciences，2001，24(3):128-132.［陳勁松.熱休克蛋白的分子遺傳學研究進展［J］.國外醫(yī)學遺傳學分冊，2001，24(3):128-132］

Ding JT，A DL，Sha TE，et al.Studies on impact of high temperature and relative humidity on survival rates of Phenacoccus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Xinjiang Agricultural University，2013，36(5):387-390.［丁吉同，阿地力，沙塔爾，等.溫度和相對濕度對扶桑綿粉蚧存活率的影響研究［J］.新疆農(nóng)業(yè)大學學報，2013，36(5):387-390］

Fangue NA，Hofmeister M，Schulte PM.Intraspecific variation in thermal tolerance and heat shock protein gene expression in common killifish，F(xiàn)undulus heteroclitus［J］.The Journal of Experimental Biology，2006，209(15):2859-2872.

Gu J，Huang LX，Shen Y，et al.Hsp70 and small hsps are the major heat shock protein members involved in midgut metamorphosis in the common cutworm，Spodoptera litura［J］.Insect Molecular Biology，2012，21(5):535-543.

Guan X，Lu YY，Zeng L，et al.Supercooling points and freezing points of mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Environmental Entomology，2009，31(4):381-384.［關(guān)鑫，陸永躍，曾玲，等.扶桑綿粉蚧的過冷卻點和體液結(jié)冰點測定［J］.環(huán)境昆蟲學報，2009，31(4):381-384］

Guy CL，Li QB.The organization and evolution of the spinach stress 70 molecular chaperone gene family［J］.The Plant Cell，1998，10(6):539-556.

Kiang JG，Tsokos GC.Heat shock protein 70 kDa:Molecular biology，biochemistry，and physiology［J］.Pharmacology ＆ Therapeutics，1998，80(2):183-201.

Lindquist S，Craig EA.The heat shock proteins［J］.Annual Review of Genetics，1988，22:631-677.

Li M，Lu WC，F(xiàn)eng YZ，et al.Cloning and expression analysis of a heat shock protein 70 gene TCHSP70-4 from Tetranychus cinnabarinus(Acari:Tetranychidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2008，51(12):1235-1243.［李明，盧文才，馮宏祖，等.朱砂葉螨熱激蛋白HSP70 基因TCHSP70-4 的克隆與表達［J］.昆蟲學報，2008，51(12):1235-1243］

Lu YY，Zeng L，Wang L，et al.Precaution of solenopsis mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Environmental Entomology，2008，30(4):386-387.［陸永躍，曾玲，王琳，等.警惕一種危險性綿粉蚧入侵中國［J］.環(huán)境昆蟲學報，2008，30(4):386-387］

Luo M，Dong ZY，Bin SY，et al.Molecular cloning，prokaryotic expression and expression at different developmental stages of cathepsin B gene in mealybug Phenacoccus solenopsis Tinsley(Hemiptera:Pseudococcidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2012，55(3):276-283.［羅梅，董章勇，賓淑英，等.扶桑綿粉蚧組織蛋白酶B 基因的克隆、原核表達和不同發(fā)育階段表達分析［J］.昆蟲學報，2012，55(3):276-283］

Luo M，Donf ZY，Bin SY，et al.Molecular cloning and bioinformatics analysis of calmodulin genes in Phenacoccus solenopsis Tinsley［J］.Journal of Huazhong Agricultural University，2012，31(3):320-324.［羅梅，董章勇，賓淑英，等.扶桑綿粉蚧鈣調(diào)蛋白基因的克隆與生物信息學分析［J］.華中農(nóng)業(yè)大學學報，2012，31(3):320-324］

Ma J，Hu XN，Peng ZQ，et al.The potential geographical distribution of Phenacoccus solenopsis Tinsley based on the CLMEX in China［J］.Plant Quarantine，2011，25(1):5-8.［馬俊，胡學難，彭正強，等.基于CLMEX 模型的扶桑綿粉蚧在中國潛在地理分布預測［J］.植物檢疫，2011，25(1):5-8］

Montfort RV，Sligsby CV.Structure and the function of the small heat shock protein/alpha-crystallin family of molecular chaperones［J］.Advances in Protein Chemistry，2001，59:105-156.

Michaud S，Marin R，Westwood JT，et al.Cell-specific expression and hetat-shock induction of Hsps during spematogenesis in Drosophila melanogaster［J］.Journal of Cell Science，1997，110:1989-1997.

Pockley AG.Heat shock proteins as regulators of immune response［J］.Lancet，2003，362:469-476.

Prodromou C，Roe SM，O Brien R，et al.Identification and structural characterization of the ATP/ADP-binding site in the Hsp90 molecular chaperone［J］.Cell，1997，90(1):65-75.

Rinehart JP，Li A，Yocum GD，et al.Up-regulation of heat shock proteins is essential for cold survival during insect diapause［J］.Proceedings of the National Academy Sciences of the United States of America，2007，104:11130-11137.

Ritossa F.A new puffing pattem induced by temperature shock and DNP in Drosophila［J］.Experientia，1962，18(12):571-573.

Shen JR，Li MF，Chen NZ，et al.Cloning and analysis of the expression characteristics under heat stress of Hsp90 gene in the codling moth，Cydia pomonella(Lepidoptera:Tortricidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2011，54(11):1236-1248.［申建茹，李明福，陳乃中，等.蘋果蠹蛾熱激蛋白Hsp90 基因的克隆及熱脅迫下的表達分析［J］.昆蟲學報，2011，54(11):1236-1248］

Stebbins CE，Russo AA，Schneider C，et al.Crystal structure of an Hsp90-geldanamycin complex:targeting of a protein chaperone byan antitumor agent［J］.Cell，1997，89(2):239-250.

Sun F，Lu YY.A new invasive mealybug，Phenacoccus solenopsis，could cause serious damage to cotton plants［J］.China Cotton，2011，38(2):19-20.［孫峰，陸永躍.新入侵害蟲扶桑綿粉蚧嚴重危害棉花［J］.中國棉花，2011，38(2):19-20］

Sun Y，MacRae TH.Small heat shock proteins:molecular structure and chaperone function［J］.Cellular Molecular Life Sciences，2005，62:2460-2476.

Tamura K，Peterson N，Stecher G，et al.MEGA 5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Molecular Biology Evolution，2011，28(10):2731-2739.

Tang E，Kuang BF，Chen JZ，et al.The identification and prevention of a quarantine pests Phenacoccus solenopsis［J］.China Vegetables，2011，19:26-28.［唐鍔，曠碧峰，陳建芝，等.檢疫性害蟲扶桑綿粉蚧的識別及防治［J］.中國蔬菜，2011，19:26-28］

Tinsley JD.Notes on Coccidae，with descriptions of new species［J］.Canadian Entomologist，1898，30:317-320.

Wang W，Han LL，Zhao KJ.Research advance of heat shock protein 70 in entomology［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2009，40(11):129-132.［王薇，韓嵐嵐，趙奎軍.昆蟲熱休克蛋白Hsp70 的研究進展［J］.東北農(nóng)業(yè)大學學報，2009，40(11):129-132］

Welch WJ.Mammalian stress response:cell physiologt，structure/function of stress proteins，and implications for medicine and disease［J］.Physiological Review，1992，72(4):1063-1081.

Wu SA，Zhang RZ.A new invasive pest，Phenacoccus solenopsis，threatening seriously to cotton production［J］.Chinese Bulletin of Entomology，2009，46(1):159-162.［武三安，張潤志，威脅棉花生產(chǎn)的外來入侵新害蟲-扶桑綿粉蚧［J］.昆蟲知識，2009，46(1):159-162］

Zhai HF，Jiang XF，Luo LZ.Cloning and expression of Hsp90 cDNA in larvae of the beet armyworm，Spodoptera exigua(Lepidoptera:Noctuidae)under high temperature stress［J］.Acta Entomologica Sinica，2010，53(1):20-28.［翟會芳，江幸福，羅禮智，2010.甜菜夜蛾Hsp90 基因克隆及高溫脅迫下表達量的變化［J］.昆蟲學報，2010，53(1):20-28］

Zhao J，Sun Y，Tan YA，et al.Genetic differentiation among different geographic populations of Phenacoccus solenopsis based on sequences of COI and 28S rDNA［J］.Cotton Science，2014，26(2):130-137.［趙靜，孫洋，譚永安，等.基于COI 及28S rDNA 序列分析的扶桑綿粉蚧地理種群的遺傳分化研究［J］.棉花學報，2014，26(2):130-137］