優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白cDNA 序列的克隆與生物信息學(xué)分析

寇曉艷，劉 靜，2，周志軍*，騫蕾陽(yáng)，石福明

(1.河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071002;2.中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041)

Schüpbach 和Wieschaus(1986)最早報(bào)道了果蠅Drosophila melanogaster 的vasa 基因，發(fā)現(xiàn)其在所有發(fā)育時(shí)期的生殖細(xì)胞中表達(dá)，在腹節(jié)形成和生殖細(xì)胞分化中具有重要作用。由于vasa 基因僅在后口動(dòng)物生殖細(xì)胞系中特異表達(dá)(Lasko and Ashburner，1988)，因此被公認(rèn)為是進(jìn)行原始生殖細(xì)胞的起源、遷移和分化途徑研究的理想分子標(biāo)記物(Yoon et al.，1997)，并先后用于小鼠Mus musculus(Toyooka et al.，2000)、雞Gallus gallus domesticus(Tsunekawa et al.，2000)、沙 漠 蝗Schistocerca gregaria(Chang et al.，2002)、太平洋牡蠣Crassostrea gigas(Fabioux et al.，2004)、家蠶Bombyx mori(柴春利等，2005)、斑馬魚Danio rerio(孫冬捷等，2013)等多種物種的原始生殖細(xì)胞研究。

VASA 蛋白是DEAD-box 蛋白家族成員中一種ATP 依賴的RNA 解旋酶，最先在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。DEAD-box 蛋白家族廣泛存在于細(xì)菌、酵母、植物和動(dòng)物之中，因具有高度保守的DEAD(Asp-Glu-Ala-Asp)序列模塊而得名(陳玉東等，2010)。VASA 蛋白具備DEAD-box 蛋白家族的9個(gè)保守基序:AxTGoGKT(Ⅰ)、PTRELA(Ia)、TPGR(Ib)、DEAD(Ⅱ)、SAT(Ⅲ)、lIFhxT+cx(Ⅳ)、TDVuARGID(Ⅴ)、HRIGRTGR(Ⅵ)和GaccPoh1Q(Q)(Cordin et al.，2006)。其中，基序Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共同形成一個(gè)ATP 水解的作用口袋，其中，基序Ⅰ、Ⅱ與NTP 的結(jié)合和水解有關(guān)(Caruthers and McKay，2002;Tanner，2003;Cordin et al.，2006)，基序Ⅲ則對(duì)ATP 酶和解旋酶的活性發(fā)揮起決定性作用，突變后可以導(dǎo)致解旋酶活性喪失;基序Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ia 和Ib 參與RNA 的結(jié)合，Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ具有調(diào)節(jié)ATP 酶和解旋酶的活性(Rocak et al.，2005;Cordin et al.，2006)。N 端RGG 重復(fù)序列和RG 重復(fù)序列可能與RNA 的結(jié)合有關(guān)，但并不是所有VASA 蛋白都具有RGG 和RG 重復(fù)序列(Cordin et al.，2006)。VASA 蛋白具有依賴ATP 的RNA 解旋酶活性，在細(xì)胞RNA 代謝中具有重要作用，參與RNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、前體mRNA 的剪接、核內(nèi)mRNA 的運(yùn)輸、翻譯起始的調(diào)控、細(xì)胞器基因的表達(dá)及RNA 的降解等多個(gè)重要的細(xì)胞進(jìn)程，是生殖細(xì)胞形成所需的母源性因子(Hay et al.，1988;Liang et al.，1994;Yoon et al.，1997)。VASA 蛋白是果蠅生殖質(zhì)的重要組成部分，對(duì)于生殖質(zhì)形成和生殖細(xì)胞的增殖與分化具有重要作用(Gavis et al.，1996;Styhler et al.，1998;Knaut et al.，2000)在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)vasa mRNA 是其生殖質(zhì)的組成部分，母源性的vasa mRNA 分布在發(fā)育早期的所有細(xì)胞中，之后逐漸集中于形成生殖質(zhì)的區(qū)域，PGCs 形成后，胚胎中的vasa mRNA 和VASA 蛋白選擇性保留，同時(shí)啟動(dòng)vasa 合子轉(zhuǎn)錄以保證PGCs 中的Vasa 蛋白含量，而體細(xì)胞中母源性vasa mRNA 迅速降解，到發(fā)育后期，VASA 蛋白僅在PGCs 中表達(dá)。VASA蛋白對(duì)于生殖細(xì)胞的形成和卵子極性的建立以及某些發(fā)育基因的mRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控都具有重要作用。

優(yōu)雅蟈螽Gampsocleis gratiosa 隸屬于昆蟲綱Insecta 直翅目Orthoptera 螽斯科Tettigoniidae，作為鳴蟲在中國(guó)已有數(shù)百年的人工飼養(yǎng)歷史，是螽斯生殖發(fā)育研究的良好模式昆蟲。與完全變態(tài)的果蠅、家蠶的滋養(yǎng)型卵巢管不同，優(yōu)雅蟈螽屬于半變態(tài)昆蟲，其卵巢管屬于無(wú)滋養(yǎng)型，卵子發(fā)生過(guò)程中沒有滋養(yǎng)細(xì)胞提供營(yíng)養(yǎng)和信號(hào)。二代測(cè)序技術(shù)具有快速、高通量和低成本的特點(diǎn)，深刻地改變了當(dāng)前生物學(xué)的研究模式，生物學(xué)研究因此進(jìn)入“組學(xué)時(shí)代”，普通實(shí)驗(yàn)室完成單個(gè)物種轉(zhuǎn)錄組，甚至基因組測(cè)序不再遙不可及。Gibbons 等(2009)率先采用Illumina 高通量測(cè)序平臺(tái)測(cè)定了岡比亞按蚊Anopheles gambiae 和埃及伊蚊Aedes egypti 轉(zhuǎn)錄組，證明在非模式昆蟲中利用短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)獲得的數(shù)據(jù)質(zhì)量與長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)同樣可靠。本研究基于實(shí)驗(yàn)室前期測(cè)得的優(yōu)雅蟈螽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從優(yōu)雅蟈螽雌性成體卵巢中克隆了vasa基因的全長(zhǎng)cDNA 序列，分析了序列特征，蛋白質(zhì)3D 結(jié)構(gòu)，并運(yùn)用鄰接法(Neighbor-Joining method，NJ)構(gòu)建了VASA 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1 材料與方法

1.1 材料

研究所用優(yōu)雅蟈螽采自河北省順平縣(38°83' N，115°13' E)，將捕獲的末齡若蟲帶回實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)至成蟲備用。

1.2 方法

1.2.1 總RNA 提取

選取發(fā)育情況良好的優(yōu)雅蟈螽雌性成體，快速解剖取出卵巢置于含有RNAiso Plus(TaKaRa)的勻漿器中，充分研磨，提取總RNA。具體操作依照RNAiso Plus 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，總RNA 溶解于30 μL RNase-free 無(wú)菌水中。

1.2.2 cDNA 合成

用Oligo dT 引物對(duì)總RNA(約1 μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體操作依照PrimeScript?RT-PCR Kit(TaKaRa)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.3 vasa 基因中間段PCR 擴(kuò)增及3'/5' 端RACE 擴(kuò)增

基于實(shí)驗(yàn)室之前測(cè)得的優(yōu)雅蟈螽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出的一段長(zhǎng)度為1215 bp 的vasa 基因片段，利用primer premier 5.0(Singh et al.，1998)軟件，共設(shè)計(jì)了1 對(duì)中間段擴(kuò)增引物(VF/VR)和4 條RACE 引物(V3F1，V3F2，V5R1，V5R2)(表1)。以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，用VF/VR 引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸90 s，共30個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。3' RACE 依照3'-Full RACE Core Set Ver.2.0 試劑盒說(shuō)明書對(duì)總RNA(約1μg)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)程序:42℃60 min，70℃15 min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，用V3F1 和3' Outer Primer 及V3F2 和3' Inner Primer 分別進(jìn)行Outer PCR 擴(kuò)增和Inner PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)程序:94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min(Outer PCR 20個(gè)循環(huán)/Inner PCR 30個(gè)循環(huán));72℃延伸10 min。5' RACE 依照5'-Full RACE Kit 試劑盒說(shuō)明對(duì)總RNA(約2 μg)進(jìn)行去磷酸化、去帽子、5' RACE Adaptor 連接及反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)程序:30℃10 min，42℃1 h，70℃15 min。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 為模板，用5' Outer Primer 和V5R1 及5' Inner Primer 和V5R2 分別進(jìn)行Outer PCR 和Inner PCR 擴(kuò)增(Outer Primer 和Inner Primer 由TaKaRa 公司試劑盒提供)。反應(yīng)程序同3' RACE。RT-PCR和3'/5'端RACE-PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳切膠、純化回收后，使用pMD19-T 載體(TaKaRa)進(jìn)行克隆測(cè)序。

表1 本研究中所用的vasa 基因引物Table 1 vasa primers used in this study

1.2.4 生物信息學(xué)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

測(cè)序結(jié)果使用Lasergene 軟件包中的SeqMan軟件(Burland，2000)拼接獲得vasa 基因cDNA序列全長(zhǎng)。使用NCBI 中的ORF finder 程序進(jìn)行開放閱讀框(ORF)及兩端非編碼區(qū)預(yù)測(cè)并推導(dǎo)出相應(yīng)氨基酸序列。蛋白質(zhì)的理論分子量、等電點(diǎn)及其它基本性質(zhì)的分析采用Prot Param(Gasteiger et al.，2005)進(jìn)行，二、三級(jí)結(jié)構(gòu)分別通過(guò)PROSITE(Castro et al.，2006)和Phyre 2(Kelley et al.，2009)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)。下載GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的其他生物的VASA 蛋白氨基酸序列，運(yùn)用BioEdit(Thomas，1999)進(jìn)行多重序列比對(duì)，尋找VASA 結(jié)構(gòu)域活性催化模體，并在MEGA 5.1(Tamura et al.，2011)軟件中基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 vasa 基因cDNA 全長(zhǎng)序列分析

以反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 為模板，用VF/VR 引物對(duì)進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序得到優(yōu)雅蟈螽vasa 基因cDNA中間段序列770 bp，5' RACE 和3' RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序分別得到vasa 基因cDNA 5'-和3'-末端序列467 bp 和2296 bp，其中，3'RACE 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)步移法測(cè)通(圖1)。測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接后獲得vasa基因cDNA 序列全長(zhǎng)3359 bp，GenBank 登錄號(hào)為KP273583。

ORF Finder 分析表明:vasa 基因cDNA 開放閱讀框長(zhǎng)1971 bp，編碼656個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子量(Mw)為72.3 kDa，理論等電點(diǎn)(pI)為5.48;5'端非編碼區(qū)(Untranslated region，UTR)長(zhǎng)82 bp;3'端非編碼區(qū)UTR 長(zhǎng)1306 bp。優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白可以劃分為Q-motif(DEAD-box RNA helicase Q motif profile)、HELICASE_ATP_BIND_1(Superfamilies 1 and 2 helicase ATP-binding type-1 domain profile)和HELICASE_CTER(Superfamilies 1 and 2 helicase C-terminal domain profile)3個(gè)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的其他物種VASA 蛋白序列比對(duì)，我們發(fā)現(xiàn)優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白序列具有DEAD-box 家族蛋白的9個(gè)保守基序:AxTGoGKT(I)、PTRELA(Ia)、TPGR(Ib)、DEAD(Ⅱ)、SAT(Ⅲ)、LVFVE(Ⅳ)、TDVuARGID(Ⅴ)、HRIGRTGR(Ⅵ)和GaccPoh1Q(Q)(Cordin et al.，2006)，其中，GaccPoh1Q(Q)有1個(gè)氨基酸替換，變?yōu)镚aLcPoh1Q(Q)(圖2)。除上述保守基序外，優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白尚有許多與RNA 結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)，如:N 端的2個(gè)RGG 重復(fù)序列和10個(gè)RG 重復(fù)序列(陳玉東等，2010;任爽等，2011);C 端的7個(gè)氨基酸殘基中有4個(gè)酸性氨基酸殘基(E)(Hay et al.，1988);起始密碼子和終止密碼子附近都有色氨酸(W)殘 基(Fujiwara et al.，1994;Castrillon et al.，2000)。這些保守的基序和結(jié)構(gòu)可能對(duì)于維持VASA 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要(圖2)。

圖1 優(yōu)雅蟈螽vasa 基因cDNA 克隆PCR 產(chǎn)物Fig.1 PCR products of Gampsocleis gratiosa vasa gene cDNA

2.2 VASA 蛋白基因系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖2 優(yōu)雅蟈螽vasa 基因cDNA 開放閱讀框及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 ORF region and deduced amino acids sequence from Gampsocleis gratiosa vasa cDNA

下載GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中所收錄的VASA 蛋白序列(截止2014年11月15日)，包括:水螅Hydra vulgaris(XP_002161873.2)、日本三角渦蟲Dugesia japonica(BAA34993.1)、秀麗隱桿線蟲Caenorhabditis elegans(AAB04136.1)、埃及伊蚊(AAY41941.1)、中華按蚊 Anopheles sinensis(KFB42544.1)、沙 蠶 Platynereis dumerilii(CAJ38803.1)、中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeus chinensis(ABQ00071.1)、擬穴青蟹 Scylla paramamosain(ACZ92304.1)、中華絨螯蟹 Eriocheir sinensis(ADM64419.1)、太平洋牡蠣(AAR37337.1)、紫球海膽 Strongylocentrotus purpuratus(NP_001139665.1)、沙漠蝗(AAO15914.1)、雙斑蟋Gryllus bimaculatus(BAG65665.1)、內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsis nevadensis(KDR22893.1)、致倦庫(kù)蚊Culex quinquefasciatus(EDS32555.1)、黑腹果蠅Drosophila melanogaster(CAA31405.1)、桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis(JAC56340.1)、地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata(JAC05266.1)、家蠅 Musca domestica(XP_005187523.1)、畢氏粗角蟻Cerapachys biroi(EZA52755.1)、佛羅里達(dá)弓背蟻Camponotus floridanus(EFN69344.1)、意大利蜜蜂Apis mellifera(ABC41341.1)、大蜜蜂Apis dorsata(XP_006623334.1)、歐洲熊蜂Bombus terrestris(XP_003393360.1)、腰帶長(zhǎng)體繭蜂Macrocentrus cingulum(AGU28209.1)、切葉蟻 Acromyrmex echinatior(EGI69006.1)、多胚跳小蜂Copidosoma floridanum(AAT12450.1)、蠅蛹金小蜂Nasonia vitripennis(XP_008211800.1)、家蠶(AGO02039.1)、帕眼蝶 Pararge aegeria(JAA87280.1)、豌豆蚜Acyrthosiphon pisum(XP_003244501.1)、乳草蝽 Oncopeltus fasciatus(AGJ83330.1)、柑橘木虱Diaphorina citri(XP_008476021.1)、赤擬谷盜 Tribolium castaneum(EFA07550.1)、海鞘Ciona savignyi(BAB12216.1)、斑馬魚(AAL89410.1)、非洲爪蟾Xenopus laevis(AAC03114.1)、原雞Gallus gallus(BAB12337.1)、鴨嘴獸Ornithorhynchus anatinus(NP_001233776.1)、人 Homo sapiens(AAF72705.1)、小鼠(NP_034159.1)、大鼠Rattus sp.(AAB33364.1)、野豬Sus scrofa(AAT46129.1)。

圖3 優(yōu)雅蟈螽VASA 預(yù)測(cè)蛋白的3D 結(jié)構(gòu)Fig.3 The deduced 3 dimensional structure of Gampsocleis gratiosa VASA

預(yù)測(cè)的3D 結(jié)構(gòu)模型(圖3)顯示VASA 蛋白折疊成兩個(gè)球形結(jié)構(gòu)域彼此共價(jià)相連，N 端(綠色)球形結(jié)構(gòu)域由8個(gè)α 螺旋包圍著8個(gè)β 折疊構(gòu)成，包含ATP 結(jié)合基序Q、Ⅰ和Ⅱ，ATP 水解基序Ⅲ和RNA 結(jié)合基序Ia 和Ib;C 端(紅色)球形結(jié)構(gòu)域由6個(gè)α 螺旋包圍著6個(gè)β 折疊構(gòu)成，包含RNA 結(jié)合基序Ⅳ和Ⅴ，可能具調(diào)節(jié)ATPase 和解旋酶活性的基序Ⅵ(Cordin et al.，2006);基序Ia 和Ib 在結(jié)構(gòu)上分別與基序Ⅴ和Ⅳ相當(dāng)，并行使相似的功能(Story et al.，2001)。兩個(gè)結(jié)構(gòu)域共同組成helicase 核心，中間部位為ATP 結(jié)合裂隙(Rocak et al.，2005)。

把優(yōu)雅蟈螽vasa 基因的cDNA 序列的ORF 序列通過(guò)NCBI 網(wǎng)站的Blast X 同源相似性搜索發(fā)現(xiàn):本文所得優(yōu)雅蟈螽 VASA 蛋白與雙斑蟋(BAG65665.1)相似性為 81%，與沙漠蝗(AAO15914.1)相似性為73%。利用MEGA 5.1軟件，基于不同生物VASA 蛋白氨基酸序列、采取中點(diǎn)賦根——原腔動(dòng)物的秀麗隱桿線蟲作為外群構(gòu)建的Neighbor-Joining 鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹如圖4所示:六足動(dòng)物、甲殼動(dòng)物和脊索動(dòng)物(不包括海鞘C.savignyi)形成3個(gè)明顯的分枝;其他類群雖然僅包括單條序列，但相互之間基本符合后生動(dòng)物整體系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，腔腸動(dòng)物水螅和扁形動(dòng)物日本三角渦蟲;環(huán)節(jié)動(dòng)物沙蠶和軟體動(dòng)物太平洋牡蠣皆各自形成姊妹群關(guān)系;脊索動(dòng)物海鞘和棘皮動(dòng)物紫海膽位于環(huán)節(jié)動(dòng)物沙蠶與軟體動(dòng)物太平洋牡蠣和脊索動(dòng)物海鞘形成的分枝基部。唯一值得注意的是脊索動(dòng)物海鞘沒有與其他脊索動(dòng)物聚在一起。優(yōu)雅蟈螽與雙斑蟋首先聚到一起，這與它們?cè)诜诸惿贤瑢僦背崮矿畞喣肯喾?而等翅目?jī)?nèi)華達(dá)古白蟻位于直翅目分枝內(nèi)部，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的位置介于螽亞目(優(yōu)雅蟈螽+雙斑蟋)和蝗亞目(沙漠蝗)之間。

3 結(jié)論與討論

圖4 基于VASA 蛋白氨基酸序列構(gòu)建的鄰接法系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Neighbor-Joining phylogenetic tree based on VASA amino acid sequence

vasa 基因及其蛋白產(chǎn)物是生殖細(xì)胞中生殖質(zhì)(germ plasm)的重要組成部分，最早在果蠅中被發(fā)現(xiàn)，作為一種母源效應(yīng)基因在果蠅的腹部形成(Schüpbach and Wieschaus，1986)和子代原始生殖細(xì)胞的起源、遷移、分化等發(fā)育過(guò)程密切相關(guān)(Yoon et al.，1997;Toyooka et al.，2000;Tsunekawa et al.，2000;Chang et al.，2002;Fabioux et al.，2004;柴春利等，2005;孫冬捷等，2013)。本文首次以優(yōu)雅蟈螽雌性成體為實(shí)驗(yàn)材料，基于實(shí)驗(yàn)室之前測(cè)得的優(yōu)雅蟈螽轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出的一段長(zhǎng)度為1215 bp 的vasa 基因片段，設(shè)計(jì)引物并利用RT-PCR 和RACE 技術(shù)獲得其cDNA 序列全長(zhǎng)。表明基于短讀長(zhǎng)高通量測(cè)序平臺(tái)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的質(zhì)量與長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)同樣可靠，可以很好地服務(wù)于非模式生物的功能基因研究。通過(guò)結(jié)構(gòu)特征、同源性分析、系統(tǒng)進(jìn)化等方面逐步分析驗(yàn)證最終確認(rèn)其cDNA 編碼VASA 蛋白。優(yōu)雅蟈螽vasa 基因cDNA 序列全長(zhǎng)3359 bp，其中，5' 端非編碼區(qū)82 bp，3' 端非編碼區(qū)1306 bp，開放閱讀框1971 bp 編碼656個(gè)氨基酸，雙斑蟋vasa 基因的開放閱讀框編碼650個(gè)氨基酸(Mito et al.，2008)，二者非常接近。預(yù)測(cè)其蛋白相對(duì)分子量為72.3 kDa，理論等電點(diǎn)為5.48。有關(guān)vasa 基因在其他生物中已有由于不同轉(zhuǎn)錄本剪切形成不同亞型、編碼不同長(zhǎng)度氨基酸序列的報(bào)道，如:家蠶的一種vasa 基因型(Strain Dazao clone 2，F(xiàn)J542312)僅編碼93個(gè)氨基酸。

VASA 蛋白是DEAD-box 蛋白家族成員中一種ATP 依賴的RNA 解旋酶(Benz et al.，1999)。DEAD-box 蛋白家族具有9個(gè)保守基序:AxTGoGKT(I)、PTRELA(Ia)、TPGR(Ib)、DEAD(Ⅱ)、SAT(Ⅲ)、LVFVE(Ⅳ)、TDVuARGID(Ⅴ)、HRIGRTGR(Ⅵ)和GaccPoh1Q(Q)(Cordin et al.，2006)。VASA 蛋白在保守區(qū)外還具有許多與RNA 結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)(Kiledjian and Dreyfuss，1992)，如:N 端 的RG/RGG重復(fù)序列(陳玉東等，2010;任爽等，2011)、甘氨酸富集區(qū)、N 端隨機(jī)分布的鋅指結(jié)構(gòu)(CCHC 框)、起始及終止密碼子附近的色氨酸(Fujiwara et al.，1994;Castrillon et al.，2000)、C 末端密集存在的酸性氨基酸殘基(E)(Fabioux et al.，2004)。這些保守基序和結(jié)構(gòu)可能對(duì)于維持VASA 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能至關(guān)重要。優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白的AxTGoGKT(I)位于N 端第267-274 位點(diǎn)(AQTGSGKT)，為ATP 酶的A-motif，是ATP 的結(jié)合位點(diǎn)，與ATP 酶和解旋酶活性密切相關(guān);DEAD(Ⅱ)是DEAD-box 蛋白家族中最為保守基序，位于381-384 位點(diǎn)，為ATP 酶的B-motif，是ATP 的水解位點(diǎn);SAT(Ⅲ)和HRIGRTGR(Ⅵ)分別位于416-418 和560-567位點(diǎn)，則被認(rèn)為與RNA 的結(jié)合及解旋有關(guān)(Pause and Sonenberg，1992);GaccPoh1Q(Q)的第3個(gè)氨基酸殘基發(fā)生替換，變?yōu)镚aLcPoh1Q(Q)，類似的情況同樣存在于雙斑蟋、沙漠蝗之中，分別為GaAcPoh1Q(Q)和GaTcPoh1Q(Q)，因此我們認(rèn)為GaccPoh1Q(Q)應(yīng)修改為GaxcPoh1Q(Q)。在優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白在保守區(qū)外還具有許多與RNA 結(jié)合有關(guān)的結(jié)構(gòu)，如:N 端的10個(gè)RG和2個(gè)RGG 重復(fù)序列、起始及終止密碼子附近的色氨酸、C 末端的7個(gè)氨基酸殘基中有4個(gè)酸性氨基酸殘基(E)，優(yōu)雅蟈螽VASA 蛋白的這些保守基序和結(jié)構(gòu)表明其具有DEAD-box 家族蛋白所特有的生物學(xué)功能。

基于VASA 蛋白氨基酸序列聚類結(jié)果表明:優(yōu)雅蟈螽與雙斑蟋首先聚到一起，這與它們?cè)诜诸惿贤瑢僦背崮矿畞喣肯喾?而等翅目?jī)?nèi)華達(dá)古白蟻位于直翅目分枝內(nèi)部，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上的位置介于螽亞目(優(yōu)雅蟈螽+雙斑蟋)和蝗亞目(沙漠蝗)之間。這可能與直翅目?jī)蓙喣块g生殖方式不同有一定關(guān)系，如:螽斯與蟋蟀的附腺均由第9腹節(jié)腹板后部?jī)?nèi)陷形成;而沙漠蝗附腺(假附腺Pseudocollateral gland)卻由卵巢萼外長(zhǎng)物(側(cè)卵巢管端部)形成。經(jīng)同源比對(duì)分析，本試驗(yàn)獲得的VASA 蛋白與雙斑蟋和沙漠蝗相關(guān)蛋白序列的相似性分別達(dá)81%和73%;而與等翅目?jī)?nèi)華達(dá)古白蟻相關(guān)蛋白序列的相似性則為72%。

本研究不僅表明基于短讀長(zhǎng)高通量測(cè)序技術(shù)獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以很好地服務(wù)于非模式生物的功能基因研究，而且所獲得的優(yōu)雅蟈螽vasa 基因cDNA 全長(zhǎng)對(duì)于后續(xù)深入研究半變態(tài)類昆蟲，尤其是螽斯生殖系細(xì)胞的起源和分化具有重要意義。

References)

Benz J，Trachsel H，Baumann U.Crystal structure of the ATPase domain of translation initiation factor 4A from Saccharomyces cerevisiae—the prototype of the DEAD box protein family［J］.Structure，1999，7(6):671-679.

Burland TG.DNASTAR's Lasergene sequence analysis software［J］.Methods Mol.Biol.，2000，132:71-91.

Caruthers JM，McKay DB.Helicase structure and mechanism［J］.Curr.Opin.Struct.Biol.，2002，12(1):123-133.

Castrillon DH，Quade BJ，Wang TY，et al.The human VASA gene is specifically expressed in the germ cell lineage［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000.，97(17):9585-9590.

Castro ED，Sigrist CJA，Gattiker A，et al.ScanProsite:Detection of PROSITE signature matches and ProRule-associated functional and structural residues in proteins［J］.Nucl.Acids Res.，2006，34:362-365.

Chai CL，Qian P，Guan GP，et al.Studies on structure and expression profile of vasa gene in silkworm［J］.Science of Sericulture，2005，32(4):469-476.［柴春利，錢平，關(guān)國(guó)平，等.家蠶vasa基因的結(jié)構(gòu)及表達(dá)型研究［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2005，32(4):469-476］

Chang CC，Dearden P，Akam M.Germ line development in the grasshopper Schistocerca gregaria:vasa as a marker［J］.Dev.Biol.，2002，252(1):100-118.

Chen YD，Zou ZH，Wang YL，et al.Progress in studies of vasa gene［J］.Chinese Journal of Zoology，2010，45(4):173-180.［陳玉東，鄒志華，王藝?yán)?，?vasa 基因研究進(jìn)展［J］.動(dòng)物學(xué)雜志，2010，45(4):173-180］

Cordin O，Banroques J，Tanner NK，et al.The DEAD-box protein family of RNA helicases［J］.Gene，2006，367:17-37.

Fabioux C，Pouvreau S，Roux FL，et al.The oyster vasa-like gene:a specific marker of the germline in Crassostrea gigas［J］.Biochem.Biophys.Res.Commun.，2004，315(4):897-904.

Fujiwara Y，Komiya T，Kawabata H，et al.Isolation of a DEAD-family protein gene that encodes a murine homolog of Drosophila vasa and its specific expression in germ cell lineage［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1994，91(25):12258-12262.

Gasteiger E，Hoogland C，Gattiker A，et al.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server.In:Walker JM，ed.The Proteomics Protocols Handbook［M］.New York:Humana Press.2005，571-607.

Gavis ER，Lunsford L，Bergsten SE，et al.A conserved 90 nucleotide element mediates translational repression of nanos RNA［J］.Development，1996，122(9):2791-2800.

Gibbons JG，Janson EM，Hittinger CT，et al.Benchmarking next-generation transcriptome sequencing for functional and evolutionary genomics［J］.Mol.Biol.Evol.，2009，26(12):2731-2744.

Hall TA.BioEdit:a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT［J］.Nucleic Acids Symp.Ser.，1999，(41):95-98.

Hay B，Jan LY，Jan YN.A protein component of Drosophila polar granules is encoded by vasa and has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases［J］.Cell，1988，55(4):577-587.

Kelley LA，Sternberg MJ.Protein structure prediction on the Web:A case study using the Phyre server［J］.Nat.Protoc.，2009，4(3):363-371.

Kiledjian M，Dreyfuss G.Primary structure and binding activity of the hnRNP U protein:binding RNA through RGG box［J］.EMBO J.，1992，11(7):2655-2664.

Knaut H，Pelegri F，Bohmann K，et al.Zebrafish vasa RNA but not its protein is a component of the germ plasm and segregates asymmetrically before germline specification［J］.J.Cell Biol.，2000，149(4):875-888.

Lasko PF，Ashburner M.The product of the Drosophila gene vasa is very similar to eukaryotic initiation factor-4A［J］.Nature，1988，335(6191):6l1-617.

Liang L，Diehl-Jones W，Lasko P.Localization of vasa protein to the Drosophila pole plasrn is independent of its RNA—binding and helicase activities［J］.Development，1994，120(5):1201-12l1.

Mito T，Nakamura T，Sarashina I，et al.Dynamic expression patterns of vasa during embryogenesis in the cricket Gryllus bimaculatus［J］.Dev.Genes Evol.，2008，218:381-387

Pause A，Sonenberg N.Mutational analysis of a DEAD box RNA helicase:the mammalian translation initiation factor eIF-4A［J］.EMBO J，1992，11(7):2643-2654.

Ren S，Chen C，Liu XS，et al.Molecular cloning and expression analysis of vasa gene in Ovomermis sinensis［J］.Acta Phytophy Sin.，2011，38(4):333-338.［任爽，陳沖，劉須生，等.中華卵索線蟲vasa 基因的克隆及其表達(dá)模式分析［J］.植物保護(hù)學(xué)報(bào)，2011，38(4):333-338］

Rocak S，Emery B，Tanner NK，et al.Characterization of the ATPase and unwinding activities of the yeast DEAD-box protein Has1p and the analysis of the roles of the conserved motifs［J］.Nucleic AcidsRes.，2005，33(3):999-1009.

Rocak S，Linder P.DEAD-box proteins:The driving forces behind RNA metabolism［J］.Nat.Rev.Mol.Cell Biol.，2004，5(3):232-241.

Rogers GW Jr，Komar AA，Merrick WC.eIF4A:The godfather of the DEAD box helicases［J］.Prog.Nucleic Acid Res.Mol.Biol.，2002，72:307-331.

Schüpbach T，Wieschaus E.Maternal-effect mutations altering the anterior-posterior pattern of the Drosophila embryo［J］.Dev.Biol.，1986，195(5):302-317.

Singh VK，Mangalam AK，Dwivedi S，et al.Primer premier:Program for design of degenerate primers from a protein sequence［J］.Biotechniques，1998，24(2):318-319.

Story RM，Li H，Abelson JN.Crystal structure of a DEAD box protein from the hyperthermophile Methanococcus jannaschii［J］.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，98(4):1465-1470.

Styhler S，Nakamura A，Swan A，et al.vasa is required for Gurken accumulation in the oocyte，and is involved in oocyte differentiation and germline cyst development［J］.Development，1998，125(9):1569-1578.

Sun DJ，Wang C，Yan JZ.Vasa mRNA expression pattern in different gonadal development stage of zebrafish［J］.Guangdong Agricultural Sciences，2013，40(13):132-134.［孫冬捷，王晨，嚴(yán)繼舟.vasa 基因在斑馬魚不同發(fā)育時(shí)期的mRNA 表達(dá)分析［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，40(13):132-134］

Tamura K，Peterson D，Peterson N，et al.MEGA5:molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods［J］.Mol.Biol.Evol.，2011，28(10):2731-2739.

Tanner NK，2003.The newly identified Q motif of DEAD box helicases is involved in adenine recognition［J］.Cell Cycle，2(1):18-19.

Tsunekawa N，Naito M，Sakai Y，et al.Isolation of chicken vasa homolog gene and tracing the origin of primordial germ cells［J］.Development，2000，127(12):2741-2750.

Toyooka Y，Tsunekawa N，Takahashi Y，et al.Expression and intracellular localization of mouse Vasa-homologue protein during germ cell development［J］.Mech.Dev.，2000，93(1/2):139-149.

van Doren M，Williamson AL，Lehmann R.Regulation of zygotic gene expression in Drosophila primordial germ cells［J］.Curr.Biol.，1998，8(4):243-246.

Yoon C，Kawakami K，Hopkins N.Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2-and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells［J］.Development，1997，124(16):3157-3165.