菌落PCR改良技術(shù)快速鑒定阿薩希毛孢子菌的實(shí)驗研究

張德全 劉涵 廖勇 夏志寬 楊冬倩 楊陽 呂雪蓮 楊蓉婭

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京100700；2.總政治部機(jī)關(guān)醫(yī)院，北京100120）

菌落PCR改良技術(shù)快速鑒定阿薩希毛孢子菌的實(shí)驗研究

張德全1，2劉涵1廖勇1夏志寬1楊冬倩1楊陽1呂雪蓮1楊蓉婭1

（1.北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍皮膚損傷修復(fù)研究所，北京100700；2.總政治部機(jī)關(guān)醫(yī)院，北京100120）

目的 探索快速鑒定阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）的簡便方法。方法 分別應(yīng)用直接法、直接離心法、酶解法、酶解改良法4種方法進(jìn)行樣本預(yù)處理后的菌落PCR技術(shù)檢測16株T.asahii，評價上述4種方法的敏感性和微量樣本陽性率，同時與DNA常規(guī)提取法PCR結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果 酶解改良法、直接法、常規(guī)提取法敏感性均為102CFU／mL，陽性率分別為93.75%、75%、50%；直接離心法敏感性為104CFU／mL，陽性率為43.75%；酶解法結(jié)果為陰性。結(jié)論 酶解改良法是一種簡便快速的PCR模板獲取方法，適用于菌落PCR技術(shù)對T.asahii進(jìn)行快速鑒定時的樣本預(yù)處理。

菌落PCR；阿薩希毛孢子菌；DNA初提

［Chin J Mycol，2015，10（1）：6?10］

阿薩希毛孢子菌（Trichosporon asahii，T.asahii）是毛孢子菌病最常見的致病菌，近年來關(guān)于T.asa?hii引起院內(nèi)感染的相關(guān)報道較多［1?2］，特別是侵襲性T.asahii感染，由于臨床表現(xiàn)缺乏特異性，僅根據(jù)臨床癥狀很難及時作出準(zhǔn)確診斷，因此病原學(xué)的準(zhǔn)確鑒定對于T.asahii引起院內(nèi)感染的早期診斷和臨床藥物選擇具有重要意義。然而目前T.asahii的傳統(tǒng)與分子鑒定常受到菌落培養(yǎng)時間長、生化鑒定特異性不高、DNA提取復(fù)雜、分子鑒定耗時長等多種因素限制，這給臨床診斷鑒定帶來了很多不便。因此，尋找快速、準(zhǔn)確的診斷方法對于爭取T.asahii感染的救治時機(jī)具有重要意義［3］。以往菌落PCR技術(shù)較多應(yīng)用于基因載體構(gòu)建后的驗證研究［4］，近年有學(xué)者嘗試應(yīng)用菌落PCR技術(shù)進(jìn)行病原微生物的臨床診斷鑒定，該方法可在短時間內(nèi)完成病原菌的檢測，不僅節(jié)約了時間和勞動成本，同時也給臨床治療工作爭取了空間優(yōu)勢。我們對以往文獻(xiàn)報道過的菌落PCR技術(shù)進(jìn)行了比較和改進(jìn)，以期縮短診斷時間，對T.asahii進(jìn)行更準(zhǔn)確的鑒定，為臨床治療贏得時間。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株來源 T.asahii（BZP07001、07002、07003、07004、07005、09001、09002、6108、6198、6674、4848、6956）為本實(shí)驗室保存菌株，T.asahii參考菌株（8904、8520、7137）購自荷蘭皇家科學(xué)院真菌多樣性研究中心（Centraalbureau voor Schimmelcultures，CBS），標(biāo)準(zhǔn)株CBS2479為日本千葉大學(xué)贈送。

儀器與試劑 干式恒溫器產(chǎn)自杭州瑞誠儀器有限公司，Thermo高速冷凍離心機(jī)產(chǎn)自美國熱電公司，F(xiàn)ASTPREP?24核酸蛋白提取儀購自美國MP公司，PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像系統(tǒng)均產(chǎn)自美國Bio?Rad公司，Taq DNA聚合酶、dNTP、250 bpDNA Marker等購自寶生物工程（大連）有限公司，PDA成品干粉產(chǎn)自德國默克公司，山梨醇、檸檬酸鈉、蝸牛酶均購自生工生物工程（上海）股份有限公司，酸洗玻璃珠產(chǎn)于Sigma公司。

1.2 方法

PCR引物 應(yīng)用真菌通用引物［5］26SF（5′?ATCCTTTGCAGACGACTTG A?3′）和 5SR （5′?AGCTTGACTTCGCAGATC GG?3′）擴(kuò)增部分26S rD?NA、IGS1區(qū)和部分5S rDNA區(qū)域。

PCR反應(yīng)體系與循環(huán)條件 反應(yīng)總體積為25 μL，10倍緩沖液3 μL，dNTP（各2.5 mmol／L）2 μL，MgCl21.5 μL，上下游引物各1 μL（10 μmol／L），Taq酶1 U，模板DNA 1 μL，無菌雙蒸水補(bǔ)足至反應(yīng)總體積25 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，53℃退火45 s，72℃延伸75 s，共30個循環(huán)，總延伸72℃ 7 min。

培養(yǎng)和菌懸液制備 將16株T.asahii接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，置于35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，挑取單菌落與無菌生理鹽水制備菌懸液，應(yīng)用血細(xì)胞計數(shù)板計數(shù)調(diào)整至濃度為1.0× 107CFU／mL。菌懸液3 000 r／min離心5 min，棄上清液，加入等量TE緩沖液重懸菌細(xì)胞，并用TE緩沖液對菌懸液進(jìn)行10倍連續(xù)稀釋，使菌懸液濃度為107、106、105、104、103、102、101CFU／mL。采用平板涂布方法對菌懸液濃度進(jìn)行復(fù)核，吸取20 μL濃度為103CFU／mL菌懸液涂布于平板之上，本實(shí)驗中所有菌株菌懸液平板涂布經(jīng)35℃培養(yǎng)48 h后，平皿中菌落計數(shù)為15～25個。

直接法和直接離心法 直接法為從制備好的菌懸液中直接吸取1 μL做為模板加入PCR反應(yīng)體系中。直接離心法是將制備好的菌懸液400 μL以3 000 r／min離心5 min后，吸取1 μL上清液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。

酶解法和酶解改良法 用10 mL pH 5.8的磷酸鉀緩沖液溶解1.82 g山梨醇、0.042 g檸檬酸鈉，取此溶液5 mL將1 g蝸牛酶完全溶解，制成蝸牛酶溶液。酶解法為取制備好的菌懸液400 μL加至無菌EP管中，并加入10 μL蝸牛酶溶液，置于37℃干式恒溫器溫浴1 h，取1 μL做為模板進(jìn)行后續(xù)PCR反應(yīng)。酶解改良法的不同之處在于將37℃溫浴后的菌懸液以14 000 r／min離心5 min，棄上清，加等量 TE重懸后再取1 μL作為模板加入PCR反應(yīng)體系中。

常規(guī)提取法 將制備好的菌懸液按所需濃度進(jìn)行稀釋，取400 μL至無菌EP管，3 000 r／min×5 min離心，棄上清，常規(guī)提取T.asahii DNA的方法參照文獻(xiàn)執(zhí)行［6］。

敏感性檢測 將制備的標(biāo)準(zhǔn)菌株CBS2479倍比稀釋菌懸液（107、106、105、104、103、102、101CFU／mL）分別應(yīng)用上述5種方法預(yù)處理后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

微量樣本陽性率檢測 選取103CFU／mL作為微量陽性率檢測菌懸液濃度，應(yīng)用制備好的16株T.asahii 103CFU／mL濃度菌懸液，通過上述5種方法預(yù)處理后各取1 μL分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

瓊脂糖凝膠電泳 用1×TAE緩沖液配制濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳45 min，凝膠成像儀下觀察拍照。

2 結(jié) 果

2.1 菌落PCR敏感性檢測

5種不同方法處理菌懸液并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，直接法在102處可見電泳條帶（見圖1a），提示最低檢測濃度為102CFU／mL；直接離心法在104處可見電泳條帶（見圖1b），提示最低檢測濃度為104CFU／mL；酶解法未見任何陽性條帶（見圖1c）；酶解改良法在102處可見電泳條帶（見圖1d），最低檢測濃度為102CFU／mL；常規(guī)提取法在102處出現(xiàn)特異性條帶（見圖1e），提示最低檢測濃度為102CFU／mL。

2.2 菌落PCR微量菌懸液陽性率檢測

16個樣本中，直接法可獲得12條特異性條帶（見圖2a），陽性率為75%；直接離心法得到7條特異性條帶（見圖2b），陽性率為43.75%；酶解法未見特異性條帶（見圖2c），酶解改良法可見15條特異性條帶（見圖2d），陽性率為93.75%；常規(guī)提取法僅得到8條特異性條帶（見圖2e），陽性率為50%。

圖1 不同預(yù)處理方法的阿薩希毛孢子菌標(biāo)準(zhǔn)株菌落PCR敏感性檢測電泳圖：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1?7.CBS2479連續(xù)10倍稀釋菌懸液，濃度依次為107、106、105、104、103、102、101CFU／mL；8.陰性對照（a.直接法，b.直接離心法，c.酶解法，d.酶解改良法，e.常規(guī)提取法） 圖2 16株阿薩希毛孢子菌不同預(yù)處理方法的菌落PCR微量樣本陽性率檢測電泳圖：M.DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物，1.BZP07001，2.BZP07002，3.BZP07003，4.BZP07004，5.BZP07005，6.BZP09001，7.BZP09002，8.CBS2479，9.CBS7137，10.CBS8520，11.CBS8904，12.BZP6108，13.BZP6198，14.BZP6674，15.BZP6956，16.BZP4848，17.陰性對照（a.直接法，b.直接離心法，c.酶解法，d.酶解改良法，e.常規(guī)提取法）Fig.1 The sensitivity of Colony PCR detection based on different methods：M.250 bp DNA Ladder；1?7.Suspension of the type strain of T.asahii CBS2479，Concentration followed by 107，106，105，104，103，102，101CFU／mL；8.Negative control（a.direct colony，b.direct colony with centrifugation，c.enzymolysis，d.improved enzymolysis method，e.traditional DNA extraction） Fig.2 The evaluation of positive rate of colony PCR trace detection based on different methods for 16 isolates of Trichosporon asahii：M.250 bp DNA Ladder，1.BZP07001，2.BZP07002，3.BZP07003，4.BZP07004，5.BZP07005，6.BZP09001，7.BZP09002，8.CBS2479，9.CBS7137，10.CBS8520，11.CBS8904，12.BZP6108，13.BZP6198，14.BZP6674，15.BZP6956，16.BZP4848，17.Negative control（a.direct colony，b.direct colony with centrifugation，c.enzymolysis，d.improved enzymolysis method，e.traditional DNA extraction）

3 討 論

T.asahii感染常見于免疫功能低下患者，特別是血液病、惡性腫瘤、免疫缺陷、白細(xì)胞減少癥的住院患者，更是T.asahii感染的高危人群。自2001年國內(nèi)首例播散性毛孢子菌病報道以來，國內(nèi)由該菌引起的院內(nèi)感染報道亦明顯增多［7?9］。但目前，由于T.asahii的鑒定常需要基于病理組織活檢標(biāo)本和血培養(yǎng)基礎(chǔ)上的生化鑒定、常規(guī)PCR或?qū)崟r定量PCR等分子技術(shù)來明確，而PCR擴(kuò)增常需要預(yù)先應(yīng)用液氮研磨、酶解、凍融、機(jī)械裂解等各種傳統(tǒng)的破壁方法后再進(jìn)行較為復(fù)雜的DNA提取，所需時間較長，這給臨床診斷和治療帶來了很多不便。因此，建立一種快速診斷鑒定T.asahii的分子方法對于贏取臨床治療時間具有重要意義。

Gussow和Clackon于1989年首次報道了菌落PCR的方法［10］，即挑取單個菌落到TE緩沖液中并煮沸5 min，渦旋振蕩后短暫離心，用少量裂解液作為DNA模板加入到PCR反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增。但傳統(tǒng)的菌落PCR技術(shù)常因假陽性的出現(xiàn)以及敏感性較低等原因，限制了該技術(shù)在臨床中的應(yīng)用［11］。為了克服傳統(tǒng)菌落PCR技術(shù)的這一不足，已有很多關(guān)于在進(jìn)行PCR擴(kuò)增之前對菌落進(jìn)行預(yù)處理的方法研究，如液氮凍融、超聲破碎、高鹽溶液、溶胞酶消解、陽離子螯合樹脂等［12?13］。到目前為止，在T.asahii鑒定過程中尚無采用菌落PCR方法的報道。我們采取直接法、直接離心法、酶解法和酶解改良法對T.asahii菌體進(jìn)行預(yù)處理，以期建立一種快速、經(jīng)濟(jì)、簡便的鑒定 T.asahii的菌落PCR技術(shù)。

直接菌落PCR法即直接挑取少量菌落加入到PCR反應(yīng)體系中，在反復(fù)高溫變性過程中部分菌體出現(xiàn)裂解，從而釋放出少量基因組DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。本研究中其菌落PCR敏感性為102CFU／mL，微量檢測陽性率為75%。我們推測該方法微量檢測時的陽性率偏低一方面由于菌體破裂后產(chǎn)生的雜質(zhì)可在一定程度上影響或抑制PCR擴(kuò)增反應(yīng)，從而降低擴(kuò)增效率；另一方面由于PCR循環(huán)擴(kuò)增中高溫條件有限，只能使少量孢子破壁并釋放出相對含量較低的基因組DNA，且不同菌株所釋放出的基因組DNA存在差異，從而導(dǎo)致該方法的微量檢測陽性率偏低，這提示基于直接法的菌落PCR技術(shù)更適用于菌含量較多的樣本檢測，如需對微量病原菌進(jìn)行檢測，尚需探索其他更為有效的菌落預(yù)處理方法。因此我們嘗試了在直接法基礎(chǔ)上對已有菌懸液進(jìn)行3 000 r／min離心5 min后，吸取1 μL上清液作為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，以期通過高速離心增加孢子破裂的概率，從而釋放出較直接法更多的基因組DNA，同時通過離心去除菌懸液中可能存在的抑制PCR反應(yīng)的雜質(zhì)。但我們的研究結(jié)果顯示，直接離心法敏感性為105CFU／mL，陽性率為43.75%，低于直接菌落法的陽性率。我們推測，高速離心只能使極少量孢子破裂，同時由于高速離心使未破裂孢子沉于管底，以致在應(yīng)用1 μL上清液作為模板加入至PCR反應(yīng)體系時，模板中實(shí)際DNA含量較少，從而使直接離心法的敏感性和微量檢測陽性率進(jìn)一步降低。

為解決真菌細(xì)胞壁破壁困難，影響菌落PCR擴(kuò)增效率的問題，本研究還采用酶解法對T.asahii進(jìn)行酶解破壁，并檢測其菌落PCR擴(kuò)增的敏感性和微量菌懸液陽性率，但均為陰性結(jié)果。蝸牛酶是目前公認(rèn)的可對真菌細(xì)胞壁進(jìn)行較理想的酶解破壁酶，在真菌分子研究中已得到廣泛應(yīng)用，常規(guī)用量可使106CFU／mL孢子有效破壁［14］，但我們應(yīng)用酶解后的菌落PCR卻呈陰性結(jié)果。我們推測這可能并非是蝸牛酶不能使T.asahii孢子破壁，而可能與蝸牛酶中復(fù)雜的制劑成分抑制PCR反應(yīng)有關(guān)。為了克服傳統(tǒng)酶解法基礎(chǔ)上的菌落PCR存在的不足，我們嘗試對該法進(jìn)行改良，即將37℃溫浴后的菌懸液離心，棄上清，加等量TE重懸后再取1 μL作為模板加入PCR反應(yīng)體系中。結(jié)果顯示，酶解改良法的敏感性為102CFU／mL，微量檢測的陽性率亦達(dá)93.75%。這進(jìn)一步印證了我們對常規(guī)酶解法菌落PCR陰性結(jié)果的推測。而通過對含有蝸牛酶的菌懸液進(jìn)行離心，可將T.asahii破壁后的原生質(zhì)體和基因組DNA沉積于管底，與上清液分離，使上清液成分中可能抑制PCR反應(yīng)的蝸牛酶中的復(fù)雜制劑得以去除，進(jìn)一步提高基于蝸牛酶改良法的菌落PCR擴(kuò)增效率。以往文獻(xiàn)報道中關(guān)于念珠菌和曲霉的直接菌落PCR模板中孢子含量為1×103～1×104相比［15］，本研究中的直接菌落法和酶解改良法的敏感性具有顯著優(yōu)勢。由于我們在進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增時僅加入1 μL上清液作為模板，102CFU／mL的敏感性實(shí)際僅相當(dāng)于10?1個孢子，如果僅以孢子數(shù)量進(jìn)行分析，這將很難對該結(jié)果進(jìn)行解釋，我們推測這可能和T.asahii基因組中目的基因核糖體DNA的多拷貝有關(guān)。早期有研究報道酵母基因組中含有100～200個核糖體DNA拷貝［16］。因此，即使僅有極少量的基因組DNA存在于反應(yīng)體系中，亦可因核糖體DNA的多拷貝性實(shí)現(xiàn)較理想的擴(kuò)增結(jié)果。酶解改良法的微量檢測陽性率為93.75%，這更間接地證實(shí)了核糖體DNA的多拷貝性。由于酶解法耗時僅為1 h，較常規(guī)提取法耗時明顯縮短，操作簡便，且由于具有較高的敏感性和微量檢測陽性率，適用于真菌載量較低的臨床標(biāo)本的快速檢測，值得進(jìn)一步的臨床深入研究。

同時我們也對基于常規(guī)提取法的菌落PCR技術(shù)進(jìn)行了對照研究，結(jié)果顯示敏感性為102CFU／mL，微量檢測陽性率為50%。我們認(rèn)為，常規(guī)法敏感性較高可能與DNA提取過程中TE重懸時僅為50 μL，使其DNA濃度進(jìn)一步提高有關(guān)。但微量檢測陽性率相對較低，可能與本研究中采用103CFU／mL這樣的微量檢測標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，103CFU／mL的菌懸液中的實(shí)際菌含量很少，而且在常規(guī)DNA提取過程中各種復(fù)雜的步驟極易引起DNA流失，這便造成相同病原菌濃度的不同樣本經(jīng)常規(guī)DNA提取后，所采用的1 μL模板中的DNA含量差異較大，故本研究中該方法的微量陽性率檢測未能獲得滿意效果。因此我們認(rèn)為當(dāng)對菌量較少的樣本進(jìn)行快速鑒定時，不宜采用程序復(fù)雜的常規(guī)提取法基礎(chǔ)上的常規(guī)PCR擴(kuò)增技術(shù)。

上述實(shí)驗結(jié)果顯示，基于酶解改良法的菌落PCR技術(shù)操作簡便，可實(shí)現(xiàn)對微量T.asahii的快速鑒定，具有經(jīng)濟(jì)、便捷、敏感、高效的特點(diǎn)，對早期診斷院內(nèi)T.asahii感染更有診斷價值和臨床意義。但由于本研究中未進(jìn)行臨床樣本或模擬臨床樣本的檢測，在下一步的研究工作中還需彌補(bǔ)此類不足。

［1］ Baka S，Tsouma I，Kouskouni E.Fatal lower limb infection by Trichosporon asahii in an immunocompetent patient［J］.Acta Dermatovenerol Croat，2013，21（4）：241?244.

［2］ Rubic Z，Novak A，Tomic Z，et al.Prompt diagnosis and effective treatment of Trichosporon asahii catheter?related infection in non?immunocompromised neurosurgical patient［J］.Mycopatho?logia，2014，Sep 24.［Epub ahead of print］

［3］ Colombo AL，Padovan AC，Chaves GM.Current knowledge of Tri?chosporon spp.and trichosporonosis［J］.Clin Microbiol Rev，2011，24（4）：682?700.

［4］ Meshkat Z，Soleimanjahi H，Mahmoudi M，et al.Determination of human papillomavirus type 16 genotype and construction of clo?ning vector pTZ57R encoding HPV16 E7 gene［J］.Saudi Med J，2006，28（10）：1511?1515.

［5］ 夏志寬，王文嶺，楊蓉婭.國內(nèi)臨床分離阿薩希毛孢子菌3個新基因型分析［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（14）：2988?2990.

［6］ Makimura K，Murayama SY，Yamaguchi H.Detection of a wide range of medically important fungi by the polymerase chain reac?tion［J］.J Med Microbiol，1994，40（5）：358?364.

［7］ 楊蓉婭，敖俊紅，王文嶺，等.阿薩希絲孢酵母引起播散性毛孢子菌病國內(nèi)首例報告［J］.中華皮膚科雜志，2001，34（5）：329?332.

［8］ 李新紅，馮新國，歐陽淑蘭.阿薩希毛孢子菌感染兩例［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（19）：2012.

［9］ 鄭曉麗，王志東，閆洪敏，等.異基因造血干細(xì)胞移植過程中并發(fā)播散性阿薩希毛孢子菌感染1例并文獻(xiàn)復(fù)習(xí)［J］.臨床血液學(xué)雜志，2013，26（5）：312?314.

［10］ Gussow D，Clackson T.Direct clone characterization from plaques and colonies by the polymerase chain reaction［J］.Nu?cleic Acids Res，1989，17（10）：4000.

［11］ Bergkessel M，Guthrie C.Colony PCR［J］.Methods Enzymol，2013，529：299?309.

［12］ 潘峰，周東風(fēng)，肖晶，等.一步法PCR聯(lián)合熒光原位雜交檢測曲霉菌屬感染標(biāo)本［J］.中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2012，22（10）：2223?2226.

［13］ 陳吉良，黃小龍，吳安迪，等.一種快速高效提取病原真菌DNA作為 PCR模板的方法［J］.菌物學(xué)報，2011，30（1）：147?149.

［14］ Ezeronye OU，Okerentugba PO.Optimum conditions for yeast protoplast release and regeneration in Saccharomyces cerevisiae and Candida tropicalis using gut enzymes of the giant African snail Achatina achatina［J］.Lett Appl Microbiol，2001，32（3）：190?193.

［15］ Alshahni MM，Makimura K，Yamada T，et al.Direct colony PCR of several medically important fungi using Ampdirect plus［J］.Jpn J Infect Dis，2009，62（2）：164?167.

［16］ Petes TD，Botstein D.Simple Mendelian inheritance of the reiter?ated ribosomal DNA of yeast［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1977，74（11）：5091?5095.

Study of improved colony PCR technologies for the identification of Trichosporon asahii

ZHANG De?quan1，2，LIU Han1，LIAO Yong1，XIA Zhi?kuan1，YANG Dong?qian1，YANG Yang1，LV Xue?lian1，YANG Rong?ya1
（1.The Military Institute of Injury and Reparation，General Hospital of Beijing Military Command of PLA，Beijing 100700，China；2.Hospital of General Political Department of PLA，Beijing 100120，China）

Objective To explore a direct colony PCR method for rapid identification of T.asahii.Methods Four methods inclu?ding direct colony，direct colony with centrifugation，enzymolysis，and improved enzymolysis method were used to preliminarily sample treatment.The sensitivity and the positive rate of colony PCR based on four methods for isolates of T.asahii were evaluated and com?pared with the PCR results of the traditional DNA extraction.Results The sensitivity of the improved enzymolysis method，direct col?ony method and the traditional DNA extraction were both 102CFU／mL，while the positive rates were 93.75%，75%and 50%，respec?tively.The direct colony with centrifugation presented the sensitivity of 104CFU／mL and the positive rate of 43.75%.The enzymolysis method presented total negative results in the detection of both sensitivity and positive rate.Conclusion The improved enzymolysis method which presented the advantages of high sensitivity and positive rate of trace samples，could be applied for the rapid identifica?tion of T.asahii.

Colony PCR；Trichosporon asahii；DNA preliminary extraction

R 379.9

A

1673?3827（2015）10?0006?05

2014?11?04

［本文編輯］ 王 飛

國家自然科學(xué)基金（81471928，81271764，81301410）

張德全，男（漢族），碩士研究生在讀，主治醫(yī)師.E?mail：mycologist＠qq.com

楊蓉婭，E?mail：yangrya＠sina.com；呂雪蓮，E?mail：myco?ses＠gmail.com