2種高尿酸血癥及相關(guān)并發(fā)癥動(dòng)物模型的建立與比較研究

林志健，王雪潔，朱春勝，牛紅娟，王 雨，張 冰

·代謝性疾病·

2種高尿酸血癥及相關(guān)并發(fā)癥動(dòng)物模型的建立與比較研究

林志健，王雪潔，朱春勝，牛紅娟，王 雨，張 冰

目的 采用飲食誘導(dǎo)法分別建立鵪鶉及大鼠高尿酸血癥模型，觀察模型的發(fā)病過程，比較2種模型的病理特征。方法 20只雄性迪法克鵪鶉隨機(jī)分為正常組鵪鶉、模型組鵪鶉，正常組給予普通鵪鶉飼料，模型組鵪鶉給予高嘌呤飼料；20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組大鼠、模型組大鼠，正常組大鼠給予普通大鼠飼料，模型組大鼠給予高果糖飼料：檢測各組動(dòng)物的血清尿酸、三酰甘油、血糖水平及相關(guān)代謝酶活性。結(jié)果 各組動(dòng)物體質(zhì)量呈自然增長趨勢。模型組鵪鶉血清尿酸水平顯著升高，造模后期血清三酰甘油水平顯著升高(P＜0.05)，血清黃嘌呤氧化酶活性顯著升高(P＜0.05)。模型組大鼠血清三酰甘油水平顯著升高，造模后期血清尿酸水平顯著升高(P＜0.05)。結(jié)論 高嘌呤及高果糖飼料可成功建立高尿酸血癥并高甘油三酯血癥動(dòng)物模型。鵪鶉及大鼠高尿酸并高甘油三酯血癥模型的病理表現(xiàn)及相關(guān)代謝酶變化不盡相同，可根據(jù)研究需要選擇動(dòng)物模型。

高尿酸血癥；高甘油三酯血癥；高嘌呤飼料；高果糖飼料；鵪鶉；大鼠

隨著我國人民生活水平的不斷提高和高蛋白的攝入量增加，高尿酸血癥(hyperuricemia，HUA)的患病率呈逐年上升趨勢。近年來流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)HUA不僅是痛風(fēng)發(fā)生的病理基礎(chǔ)，而且與多種代謝性疾病密切相關(guān)。目前HUA模型的造模方法多樣，根據(jù)HUA的發(fā)病機(jī)制主要采用補(bǔ)充尿酸前體物質(zhì)、補(bǔ)充外源性尿酸、使用氧嗪酸抑制尿酸氧化酶活性、腺嘌呤抑制尿酸排泄，使血尿酸水平升高，但HUA動(dòng)物模型尚缺乏公認(rèn)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物涉及嚙齒類和禽類。嚙齒類動(dòng)物大、小鼠模型廣泛應(yīng)用于HUA或痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎、痛風(fēng)性腎病的病理研究及藥理研究。由于嚙齒類動(dòng)物體內(nèi)存在尿酸氧化酶，能將尿酸轉(zhuǎn)化成更易溶于水的尿囊素排出體外，造模較為困難。禽類與人類的嘌呤核苷酸代謝途徑相似，體內(nèi)都缺乏尿酸氧化酶，尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物排出體外，其體內(nèi)尿酸濃度能較確切地反映體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝水平。作者選擇鵪鶉和大鼠，分別建立HUA模型，觀察模型的發(fā)病過程，比較2種模型的病理特征。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 雄性迪法克鵪鶉(動(dòng)物檢疫合格證號：1100546039)，20只，(180±20)g，由北京市種禽公司德嶺鵪鶉場提供；雄性SD大鼠(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號：11401500006654)，20只，(220±20)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供。

1.1.2 試劑 酵母浸膏粉購自英國OXOID公司(批號：1267856-03)；D-果糖購自美國AMRSESCO公司(批號：1744C467)；尿酸(uric acid，UA)試劑盒(批號：141131)，三酰甘油(triglyceride，TG)試劑盒(批號：404161C)，葡萄糖(glucose，GLU)試劑盒(批號：312032K)，均購自北京利德曼生物技術(shù)有限公司；黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)試劑盒(批號：20150605)，肝脂酶(hepatic lipase，HL)試劑盒(批號：20150612)，脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL，批號：20150612)，均購自南京建成生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 儀器 貝克曼CX4型全自動(dòng)生化分析儀(美國貝克曼有限公司)，LXJ-Ⅱ型恒溫高速離心機(jī)(上海醫(yī)用儀器分析廠)，UV2000紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限責(zé)任公司)，SHZ88-1型恒溫水浴箱(太倉市光明實(shí)驗(yàn)分析儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與飼料 雄性迪法克鵪鶉、雄性SD大鼠，在實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性飼養(yǎng)3～5 d，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組各2組，每組10只；正常組鵪鶉自由攝取普通鵪鶉飼料，模型組鵪鶉每天早晨給予高嘌呤飼料每只15 g(高嘌呤造模飼料按鵪鶉體質(zhì)量計(jì)算在普通飼料中添加15 g/kg酵母浸膏粉)，食后補(bǔ)充普通飼料，各組自由飲水。正常組大鼠自由攝取普通大鼠飼料，模型組大鼠自由攝取含果糖41%的高果糖飼料，各組自由飲水。實(shí)驗(yàn)周期35 d。

1.2.2 檢測指標(biāo) 實(shí)驗(yàn)期間，動(dòng)物每7 d取血1次，取血前12 h禁食、不禁水。次日大鼠尾尖取血，鵪鶉頸靜脈取血，取血量均為1 mL。離心分離血清，貝克曼CX4型全自動(dòng)生化分析儀測血清UA(酶比色法)、TG(終點(diǎn)法)、GLU(氧化酶終點(diǎn)法)含量。化學(xué)比色法測定血清XOD活性，比色法測定血清HL、LPL活性。每次取血前稱動(dòng)物體質(zhì)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物整體狀態(tài)良好，體質(zhì)量呈自然增長趨勢，與各自正常組比較，模型組動(dòng)物體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.1 血清UA、TG、GLU水平 與正常組鵪鶉比，模型組鵪鶉在造模第14、21、35天血清UA水平顯著升高(t14＝2.163、P14＝0.044，t21＝2.487、P21＝0.023，t35＝3.030、P35＝0.007)。與正常組大鼠比，模型組大鼠在造模第14、21、35天血清UA水平顯著升高(t14＝2.244、P14＝0.038，t21＝4.975、P21＝0.000，t35＝2.470、P35＝0.024)。見表1。

與正常組鵪鶉比，模型組鵪鶉造模第28天血清TG顯著升高(t28＝3.025、P28＝0.007)，第35天有升高趨勢。與正常組大鼠比，模型組大鼠第7、14、21、35天血清TG水平顯著升高(t7＝4.097、P7＝0.001，t14＝3.968、P14＝0.001，t21＝5.411、P21＝0.000，t35＝6.068、P35＝0.000)。見表1。

與正常組鵪鶉比，造模第7、35天模型組鵪鶉GLU水平顯著升高(t7＝3.232、P7＝0.005，t35＝6.261、P35＝0.000)，其他時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常組大鼠比，模型組大鼠第7天GLU水平一過性升高(t7＝3.951、P7＝0.001)，其他時(shí)間點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

2.2 血清尿酸代謝酶XOD活性 與正常組鵪鶉比，造模第14、28、35天模型組鵪鶉血清XOD活性顯著升高(t14＝2.474、P14＝0.024，t28＝2.340、P28＝0.031，t35＝2.184、P35＝0.043)。與正常組大鼠比，造模第35天模型組大鼠血清XOD活性顯著升高(t35＝5.445、P35＝0.000)。見表1。

2.3 血清脂代謝酶HL、LPL活性 與正常組鵪鶉比，模型組鵪鶉血清HL活性有下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常組大鼠比，造模第7、14、35天模型組大鼠血清HL活性顯著降低(t7＝2.360、P7＝0.030，t14＝2.635、P14＝0.017，t35＝7.857、P35＝0.000)，其余時(shí)間點(diǎn)有降低趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常組鵪鶉比，模型組鵪鶉血清LPL活性變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。與正常組大鼠比，造模第7、14天模型組大鼠血清LPL活性顯著升高(t7＝3.379、P7＝0.003，t14＝5.206、P14＝0.000)。見表1。

表1 各組動(dòng)物血清UA、TG、GLU、XOD、HL和LPL水平(±s，n＝10)

表1 各組動(dòng)物血清UA、TG、GLU、XOD、HL和LPL水平(±s，n＝10)

注：與各自正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01

組別UA(μmol/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天TG(mmol/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天正常組鵪鶉 250.96±93.14 197.12±87.36 253.84±72.67 215.69±80.29 187.20±66.54 0.95±0.18 1.13±0.37 0.94±0.16 0.92±0.17 1.01±0.22模型組鵪鶉 262.55±86.69 275.03±73.11?327.53±59.14?279.53±79.62 277.59±66.87?? 1.05±0.27 1.25±0.20 0.96±0.25 1.15±0.17??1.22±0.29正常組大鼠 102.34±41.10 133.99±20.46 101.28±23.52 136.45±35.43 119.11±25.90 1.15±0.21 0.98±0.29 1.00±0.17 1.35±0.24 1.10±0.21模型組大鼠 133.78±58.02 177.03±57.10?156.55±26.40??143.66±21.72 150.93±31.44? 1.69±0.36??1.60±0.40??1.62±0.32??1.56±0.23 1.95±0.39??GLU(mmol/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天XOD(U/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天10.82±1.64 13.70±1.49 12.34±2.09 15.02±1.94 14.10±1.29 4.04±0.99 5.45±0.47 3.32±0.56 6.93±1.97 6.74±1.14 12.81±1.05? 15.39±1.73 13.53±3.26 15.33±2.53 19.13±2.21?? 3.96±0.98 6.21±0.85? 3.39±0.66 9.53±2.91? 8.27±1.90?2.12±0.20 4.29±0.36 3.94±0.27 4.45±0.37 3.91±0.25 35.58±2.86 66.85±7.99 54.71±4.28 46.33±4.01 50.77±5.50 2.44±0.16? 4.67±0.85 3.74±0.17 4.58±0.47 3.77±0.30 36.47±4.73 62.43±4.83 58.19±6.04 48.97±6.18 63.05±4.54??HL(U/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天LPL(U/L)第7天 第14天 第21天 第28天 第35天2.03±0.56 1.43±0.46 2.19±0.61 3.49±1.47 2.39±0.47 2.31±0.99 2.11±1.03 3.14±1.02 2.14±0.67 2.19±0.97 1.96±0.79 1.96±0.97 2.01±0.79 3.14±1.16 2.05±1.02 2.49±0.88 2.24±0.87 2.91±0.91 1.98±0.83 2.08±1.12 12.47±1.97 13.45±2.33 12.78±2.48 15.13±1.66 15.69±1.06 5.81±2.22 6.95±1.36 8.56±1.90 4.07±0.51 8.78±2.03 10.79±1.09? 10.05±3.35? 11.98±1.24 13.81±2.60 11.58±1.27? 9.01±2.01?? 10.81±1.91?? 8.45±2.07 4.24±0.49 10.80±3.65

3 討論

3.1 模型動(dòng)物 鵪鶉，屬鳥綱雞形目雉科鶉屬(Coturnix)，動(dòng)物學(xué)名為Coturnix joponica，常作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物進(jìn)行科學(xué)研究，在日本及我國有很多的應(yīng)用群體[1]。鵪鶉在尿酸代謝及脂質(zhì)構(gòu)成方面與人類有較高的相似性。其一，鵪鶉與人類一樣缺乏尿酸氧化酶，攝入的核酸類物質(zhì)在體內(nèi)降解后產(chǎn)生的尿酸無法進(jìn)一步分解，尿酸作為嘌呤代謝的終產(chǎn)物直接排出體外，鵪鶉體內(nèi)尿酸濃度能較確切反應(yīng)體內(nèi)嘌呤核苷酸代謝水平。其二，禽類血漿TG、膽固醇以及游離脂肪酸水平與人類接近，低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的脂質(zhì)構(gòu)成與人類十分相似[2]。

SD大鼠生長快，繁育性能好，對營養(yǎng)、維生素、氨基酸等物質(zhì)攝入較敏感，廣泛用于藥理、毒理及藥效等實(shí)驗(yàn)，尤其是安全性試驗(yàn)及營養(yǎng)與生長發(fā)育有關(guān)的研究。由于SD大鼠體內(nèi)存在尿酸氧化酶，嘌呤代謝產(chǎn)物尿酸可在體內(nèi)進(jìn)一步分解為尿囊素排出體外[3]。

有研究顯示，人類、靈長類動(dòng)物及禽類由于體內(nèi)缺乏尿酸氧化酶，不能將尿酸進(jìn)一步水解成尿囊素，尿酸是其體內(nèi)嘌呤代謝的終產(chǎn)物，導(dǎo)致體內(nèi)尿酸水平高于其他物種[4-5]。本實(shí)驗(yàn)也觀察到正常鵪鶉體內(nèi)尿酸水平高于正常大鼠的尿酸水平。

3.2 造模飼料 近年來臨床流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高蛋白、高嘌呤及高果糖食物攝入是HUA及其并發(fā)癥的危險(xiǎn)因素，高嘌呤、高果糖食物與血尿酸升高、高血壓、白蛋白尿、代謝綜合征、胰島素抵抗和糖尿病的產(chǎn)生相關(guān)[6-9]。

有研究顯示，酵母浸膏粉中核酸類物質(zhì)高達(dá)8%～10%，是一種嘌呤含量非常高的添加劑。酵母浸膏粉攝入，增加尿酸合成的前體物質(zhì)，可升高體內(nèi)尿酸水平[10]。果糖是一種己酮糖，其代謝途徑中關(guān)鍵酶果糖激酶無負(fù)性反饋抑制，所有進(jìn)入細(xì)胞的果糖迅速被磷酸化，從而使細(xì)胞內(nèi)磷酸化減弱和三磷酸腺苷耗竭，導(dǎo)致短暫蛋白質(zhì)合成障礙和形成多量一磷酸腺苷。三磷酸腺苷耗竭活化嘌呤代謝酶的活性，一磷酸腺苷經(jīng)脫氨酶形成次黃嘌呤核苷酸，后經(jīng)黃嘌呤氧化酶作用生成次黃嘌呤、黃嘌呤，可導(dǎo)致尿酸前體物質(zhì)增加[11]。同時(shí)，果糖在特異性果糖激酶及1-磷酸果糖醛縮酶的催化下生成磷酸二羥丙酮和甘油醛。磷酸二羥丙酮在肝臟經(jīng)磷酸甘油脫氫酶作用下可產(chǎn)生3-磷酸甘油，最終可形成TG[12]。

因此，無論是酵母浸膏粉還是果糖，在代謝過程中均導(dǎo)致了體內(nèi)尿酸前體物質(zhì)含量增加，進(jìn)一步氧化為尿酸，可引起HUA，并可引起脂質(zhì)代謝紊亂。本研究分別采用酵母浸膏粉及果糖進(jìn)行造模，實(shí)驗(yàn)觀察到含酵母浸膏粉的高嘌呤飼料和高果糖飼料均可引起模型動(dòng)物出現(xiàn)HUA及高甘油三酯血癥，但2個(gè)模型UA與TG水平的變化不盡相同。

3.3 模型的病理變化 高嘌呤飼料可導(dǎo)致鵪鶉UA水平持續(xù)升高；實(shí)驗(yàn)第28天血清TG水平顯著升高；造模第35天模型組鵪鶉血糖一過性升高。高果糖飼料造模第7、14、21、35天模型組大鼠血清TG水平顯著升高，造模第14、21、35天血清UA水平顯著升高，造模期間血糖未見明顯變化。

黃嘌呤氧化酶是包括人類在內(nèi)的多種生物尿酸代謝的關(guān)鍵酶。實(shí)驗(yàn)觀察到鵪鶉模型血清XOD活性顯著升高；而大鼠模型血清XOD活性在后期有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。提示以嘌呤飼料作為尿酸前體物質(zhì)，可顯著升高XOD活性，導(dǎo)致尿酸生成增多；而果糖攝入并未見到XOD活性的顯著變化。HL和LPL是體內(nèi)參與內(nèi)源性TG代謝有關(guān)的催化酶。HL的生理功能是水解各種脂蛋白中的TG和磷脂。LPL生理功能是催化TG分解為脂肪酸和單酸甘油酯，以供組織氧化供能或貯存。實(shí)驗(yàn)觀察到果糖飼料誘導(dǎo)的大鼠模型血清HL的活性下降，水解脂蛋白中的TG減少，可能引起高甘油三酯血癥，而高嘌呤飼料并未引起HL活性的改變。實(shí)驗(yàn)期間，僅觀察到高果糖飼料造模在第7、14天時(shí)血清LPL活性一過性升高。

有研究顯示，HUA并高甘油三酯血癥的機(jī)制是：一方面，體內(nèi)尿酸水平的增高可導(dǎo)致LPL活性降低，TG分解減少，使血中TG水平升高；另一方面，脂代謝紊亂時(shí)血清中升高的LPL可能導(dǎo)致血尿酸的清除障礙，從而使尿酸水平升高。兩者互為因果，導(dǎo)致HUA與高甘油三酯血癥同時(shí)在一個(gè)個(gè)體上出現(xiàn)[13]。

綜上，高嘌呤飼料誘導(dǎo)的鵪鶉模型首先出現(xiàn)HUA，隨著造模時(shí)間延長可出現(xiàn)高甘油三酯血癥。高果糖飼料誘導(dǎo)的大鼠模型首先出現(xiàn)高甘油三酯血癥，隨著造模時(shí)間延長可出現(xiàn)HUA。2種模型在HUA和高甘油三酯血癥的病理表現(xiàn)上稍有不同。這樣的病理表現(xiàn)與研究前期采用高嘌呤或高果糖飼料誘發(fā)模型動(dòng)物出現(xiàn)尿酸、高甘油三酯及血糖代謝紊亂的表現(xiàn)基本一致[14]。

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Comparison of two animal models of hyperuricemia and its complications

LIN Zhijian，WANG Xuejie，ZHU Chunsheng，NIU Hongjuan，WANG Yu，ZHANG Bing
(School of Chinese Medicine，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China)

Objective To compare the pathological differences of quail and rat hyperuricemia and complication models.Methods Model quails were fed with purine-rich diet.Model rats were fed with high fructose diet.Serum uric acid，triglyceride，glucose and metabolic enzymes including xanthine oxidase，hepaticlipase and lipoprotein lipase were detected.Results There was no difference of body weight between groups(P＜0.05).Serum uric acid levels were increased in purine-rich diet induced quail model，and triglyceride levels were increased in later period(P＜0.05).Serum triglyceride levels were increased in high fructose diet induced rat model，uric acid levels were increased in later period(P＜0.05).Serum xanthine oxidase activities were increased in quail model. Serum hepatic lipase activities were decreased in rat model.Conclusion Purine-rich diet and high fructose diet can induce quail or rat hyperurcemia combined with hypertriglyceridimia.There are some differences of the pathological features between the two animal models.

Hyperuricemia；Hypertriglyceridimia；Purine-rich diet；High fructose diet；Quail；Rat

R589.7；R-332

A

2095-3097(2015)06-0347-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2015.06.008

2015-08-12 本文編輯：徐海琴)

國家自然科學(xué)基金(81274153)；教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金(20130013120001，20120013130002)；北京中醫(yī)藥大學(xué)“重點(diǎn)學(xué)科”開放課題(2013-ZDXKKF-19)

100029北京，北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(林志健，王雪潔，朱春勝，牛紅娟，王 雨，張 冰)

張 冰，E-mail：zhangbing6＠263.net