諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻的毒性研究

官奕宏，李紅衛(wèi)，呂 謀

(青島理工大學環(huán)境與市政工程學院，山東青島 266033)

近幾年，抗生素的用量越來越大，全世界每年抗生素的使用量在10萬噸～20萬噸，大部分抗生素具有水溶性，人類和動物服用的抗生素有40%～90% 將隨尿液排出體外［1］?？股貫E用所造成的環(huán)境污染問題在國內外已經引起高度重視，尤其是在歐美一些發(fā)達國家。目前很多國家在污水、地表水甚至地下水中檢測到磺胺、喹諾酮和大環(huán)內酯類等抗生素的存在［2～4］。諾氟沙星和四環(huán)素分別作為喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的代表，在水中的檢出的頻率都很高［5，6］。

藻類是水生態(tài)系統的初級生產者，可以作為監(jiān)測評價水環(huán)境質量和污染物生態(tài)毒性的重要指示生物［7］，外源污染物對藻類的毒性作用將直接影響水生食物鏈的能量傳遞，進而對高營養(yǎng)級生物和整個水生態(tài)系統產生影響。銅綠微囊藻是水華藍藻的常見藻類，是藻類爆發(fā)時的優(yōu)勢種群［8］，可以作為水生態(tài)系統初級生產者的代表，因此研究抗生素對銅綠微囊藻的毒性，可以反應兩種抗生素對于水生態(tài)系統的影響，對于評價抗生素在水環(huán)境中的生態(tài)風險具有重要意義。

本文利用葉綠素熒光技術 (PAM)，通過檢測銅綠微囊藻的生物量、葉綠素-a含量、光合作用參數、活性氧 (ROS)和丙二醛 (MDA)等指標的變化，研究了兩種抗生素對銅綠微囊藻的毒性，揭示了兩種抗生素對銅綠微囊藻的作用機制，為準確評估不同抗生素的水環(huán)境生態(tài)風險提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

銅綠微囊藻藻種 (FACHB)購于武漢水生生物研究所，采用BG-11培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的化學組分均為分析純。試驗中使用的諾氟沙星和四環(huán)素均購于美國Aladdin公司。

1.2 試驗方法

銅綠微囊藻的培養(yǎng)方法如下:批量式培養(yǎng)在光照培養(yǎng)箱 (上海精科，250 L)中，培養(yǎng)箱溫度設置為25℃ ±1℃，光照強度為3000～4000 Lux，采用12h∶12h的光照/黑夜循環(huán)模式。試驗時，取對數期的藻細胞置于250 mL錐形瓶中，用BG-11培養(yǎng)基稀釋至所需藻密度，在預實驗的基礎上每種抗生素設置5個濃度梯度，諾氟沙星和四環(huán)素的濃度梯度分別為 0.2mg/L，0.5mg/L，1.0mg/L，2.0mg/L，5.0mg/L 和 0.2mg/L，1.0mg/L，5.0mg/L，10.0mg/L，15.0 mg/L，同時設置空白對照組，將銅綠微囊藻置于原培養(yǎng)條件下暴露培養(yǎng)，每隔24 h檢測不同濃度抗生素作用下銅綠微囊藻細胞的OD680，葉綠素光，光合量子產率，ROS和MDA，檢測至96 h，48 h時檢測不同樣品的SEM照片。

抗生素儲備液配制:由于諾氟沙星水溶性較差，在酸性或堿性時易溶，所以諾氟沙星配制過程中加入少量的NaOH，最后再用1.0 mol/L HCl調節(jié)pH至7.0;四環(huán)素的鹽酸鹽能溶于水，實驗中利用無水乙醇可以加快溶解速度，放置在搖床震蕩1～2 h，4℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測指標

藻細胞生物量:本試驗采用吸光度法和流式細胞儀法結合的方法定量銅綠微囊藻細胞數。流式細胞儀可以很準確的確定細胞個數，本文建立了一條OD680和細胞數的相關曲線 Y=0.055X-0.005，如圖1所示，二者的相關性很好，R2達到0.999，后續(xù)試驗都可以根據該曲線來表征細胞個數。

圖1 吸光度與細胞密度的相關曲線Fig.1 Relation curve between absorbance in 680 nm and cell density

葉綠素和光合作用參數:

藻的葉綠素和光合活性參數采用Phyto-PAM(Walz，德國)測定，取不同劑量抗生素作用的樣品4 mL，置于PAM用的檢測管中。

光合量子產率Y值通過式 (1)計算得到:

式中:

Fm——在暗適應狀態(tài)下，PSII系統在打開飽和脈沖后產生的最大熒光值;

F0——在暗適應狀態(tài)下，PSII系統在打開飽和脈沖前產生的熒光值。

快速光響應曲線 (PLC)的測定條件設定為:步長 20 s，最大光照強度 1564 μmol/(m2·s)。通過快速光響應曲線的測定可得到相應光能利用率α的值，藻細胞內的葉綠素-a含量也可以通過熒光性能檢測，Phyto-PAM可以直接得到藻細胞葉綠素-a 的含量［9］。

活性氧 (ROS)的檢測:將培養(yǎng)48h后的藻細胞樣品收集，取1 mL藻液在2000 r/min條件下離心，將細胞收集，用磷酸緩沖溶液洗兩遍，黑暗條件下，在10 μM的熒光探針H2DCF-DA中培養(yǎng)30 min，離心后用磷酸緩沖液沖洗2遍，用酶標儀(SynergyTM4)檢測細胞內部DCF的熒光強度，即可表示細胞內部ROS含量［10］，ROS相對含量計算公式如下:

丙二醛 (MDA)的檢測:取在不同條件下培養(yǎng)48 h的藻液50mL，在4000 r/min的條件下離心，去掉上清液，將分離的藻細胞加入石英砂充分研磨，之后加入磷酸緩沖液充分攪拌，離心得到上清液即為酶液。取0.6克TBA(硫代巴比妥酸)，先用少量1M NaOH溶解，用10%TCA(三氯乙酸)定容至100 mL。1 mL酶液 +2 mL0.6%的TBA，封口沸水浴15 min，迅速冷卻后再離心，取上清液，在600、532、450 nm三個波長下測定吸光度［11］，計算公式如下:

1.4 數據處理與統計

每種試驗處理都設置3組平行樣品，結果以均值加標準偏差表示。每種處理后的樣品都與空白組進行對照，數據置信度在P＜0.05，用 origin數據處理軟件作圖處理。

2 結果與討論

2.1 兩種抗生素對銅綠微囊藻生長曲線的影響

諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻生長曲線影響如圖2所示。從圖2A中可以看出，諾氟沙星濃度低于0.5 mg/L時對銅綠微囊藻的生長抑制作用不強，在0.2 mg/L時促進了藻細胞的生長;諾氟沙星濃度達到1.0 mg/L時，對銅綠微囊藻生長有明顯的抑制，超過2.0 mg/L時，培養(yǎng)1天后銅綠微囊藻停止生長。由圖2B可知，隨濃度增加，四環(huán)素對銅綠微囊藻的抑制作用越來越明顯，當四環(huán)素濃度超過5.0 mg/L時，培養(yǎng)1天后藻細胞停止生長。諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠藻的抑制作用都有明顯的濃度-效應關系，二者對銅綠微囊藻96 h的EC50分別為0.85 mg/L 和 2.64 mg/L，這說明諾氟沙星對銅綠微囊藻的抑制作用比四環(huán)素更強。

圖2 不同劑量抗生素對銅綠微囊藻生長曲線影響(A為諾氟沙星處理組，B為四環(huán)素處理組)Fig.2 Effects of different dosage of antibiotic on the growth curve of Microcystis aeruginosa(A.Norfloxacin，B.Tetracycline)

2.2 兩種抗生素作用前后銅綠微囊藻的掃描電子顯微鏡 (SEM)照片

圖3所示為銅綠微囊藻在不同抗生素作用后的SEM照片。圖3A為正常銅綠微囊藻細胞，細胞表面光滑，呈規(guī)則球狀。圖3B和圖3C分別為諾氟沙星和四環(huán)素作用后的銅綠微囊藻細胞，藻細胞發(fā)生明顯變形，表面凹陷，表面分泌物明顯減少，這說明諾氟沙星和四環(huán)素能夠破壞藻細胞的生理機能，改變細胞內外滲透壓，導致藻細胞死亡。另外，諾氟沙星作用后的藻細胞變形要比四環(huán)素的明顯，這說明諾氟沙星對銅綠微囊藻的毒性強過四環(huán)素。

2.3 兩種抗生素對銅綠微囊藻葉綠素-a含量的影響

圖3 銅綠微囊藻的SEM照片A為空白組，B為諾氟沙星處理組，C為四環(huán)素處理組Fig.3 The SEM images of Microcystis aeruginosa.A.black ontrol，B.treated by Norfloxacin，C.treated by Tetracycline.

葉綠素-a是植物進行光合作用的重要物質，在光能的吸收、傳遞和轉換過程中起著關鍵作用。葉綠素-a含量可以間接反映細胞的活性和光合作用能力，圖4為兩種抗生素作用96 h后對銅綠微囊藻葉綠素-a含量的影響。從圖中可知，低濃度時，兩種抗生素都可以刺激銅綠微囊藻葉綠素-a的合成，隨著兩種抗生素濃度的升高葉綠素-a含量呈現下降的趨勢，10 mg/L的諾氟沙星作用96 h后，藻液幾乎變?yōu)橥该鳎~綠素下降的原因可能是葉綠體的流失或破壞［12］。在相同劑量時，諾氟沙星作用后的藻細胞葉綠素-a含量更低，說明諾氟沙星比四環(huán)素對銅綠微囊藻光合作用的影響更嚴重。

圖4 銅綠微囊藻葉綠素-a含量變化ig.4 The changes of chlorophyll-a in Microcystis aeruginosa

2.4 兩種抗生素對銅綠微囊藻光合作用的影響

光合量子產率Y值表示PSII原初光能轉換效率，Y值變化能夠直接顯示光合作用強弱。α值為光能利用率，它的值為快速光響應曲線的初始斜率，能夠表示藻細胞光合作用中光能的利用效率。圖5為不同劑量抗生素作用96 h后銅綠微囊藻Y值得變化，從圖中可以看出諾氟沙星低于0.5 mg/L時Y值變化很小，超過0.5 mg/L時，隨著諾氟沙星濃度增大Y值逐漸降低，最后變?yōu)?。四環(huán)素對銅綠微囊藻Y值得影響規(guī)律與諾氟沙星類似，但同劑量條件下，諾氟沙星作用的藻細胞Y值更低，說明諾氟沙星對藻細胞光合作用過程破壞程度比四環(huán)素更大。

圖6為兩種抗生素對銅綠微囊藻α值的影響，由圖可知，諾氟沙星低于0.5 mg/L時對α值沒有明顯影響，四環(huán)素在達到1.0 mg/L前對α值影響很小，隨兩種抗生素濃度增加，銅綠微囊藻的α值降低，二者都表現出顯著的濃度-效應關系。這說明諾氟沙星和四環(huán)素都明顯的阻礙了銅綠微囊藻對光能的利用，且諾氟沙星的阻礙作用更明顯，由于光能的利用率降低導致藻細胞活性減弱。由Y值和α值得變化可知，破壞光合系統是諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻重要的致毒機理。

圖5 銅綠微囊藻光合量子產率Y值得變化Fig.5 The changes of photosynthetic quantum yield in Microcystis aeruginosa

圖6 銅綠微囊藻光能利用率α值的變化Fig.6 The changes of efficiency for solar energy utilization α in Microcystis aeruginosa

2.5 兩種抗生素在銅綠微囊藻內部產生的氧化脅迫

活性氧 (ROS)是生物有氧代謝過程中的一種副產品，當細胞受到外部刺激時，ROS含量會急劇增多［13］，過高的 ROS水平會使細胞及其基因結構受到嚴重的損壞。圖7為兩種抗生素作用48 h后銅綠微囊藻內部ROS含量變化，由圖可知諾氟沙星在較低濃度就可引起ROS明顯增加，且與投加劑量成正相關;諾氟沙星濃度超過5.0 mg/L，藻細胞內ROS含量出現降低，這是因為藻細胞大量死亡后內部的ROS會釋放出來，因此出現下降［14］。四環(huán)素濃度低于 1.0 mg/L，藻細胞內部ROS并無明顯增加，隨四環(huán)素濃度繼續(xù)升高，ROS含量出現快速上升，10mg/L的四環(huán)素作用后，ROS相對含量達到300%，但同劑量條件下，諾氟沙星對銅綠微囊藻產生的氧化脅迫明顯強于四環(huán)素。

高濃度的諾氟沙星和四環(huán)素都能誘導藻細胞內ROS的大量產生，而逐漸增加的抗氧化酶活性并不足以清除細胞內的 ROS和阻止光致氧化作用，造成其過度積累，誘導對生物大分子 (如蛋白質，DNA，細胞膜脂)的氧化損傷，引起細胞代謝紊亂，使得藻細胞膜系統和功能異?；蚴艿綋p傷，嚴重時導致細胞死亡［15］。因此，氧化脅迫是諾氟沙星和四環(huán)素致死銅綠微囊藻的重要機理。

圖7 銅綠微囊藻ROS相對含量的變化Fig.7 The changes of ROS relative content in Microcystis aeruginosa

2.6 兩種抗生素對銅綠微囊藻細胞膜的破壞

圖8 銅綠微囊藻MDA相對含量的變化Fig.8 The changes of MDA relative content in Microcystis aeruginosa

丙二醛 (MDA)是細胞膜脂質過氧化的產物，其含量可以反映活性氧自由基對細胞膜結構的損傷程度［16］，其含量的大量增加也說明藻細胞的抗氧化系統處于一個不平衡的狀態(tài)。圖8為兩種抗生素作用48 h后藻細胞內部MDA含量的變化，兩種抗生素在高濃度時都會引起銅綠微囊藻內部MDA的急劇升高，在同劑量時，諾氟沙星處理組的MDA含量明顯高于四環(huán)素，說明諾氟沙星對銅綠微囊藻細胞膜的損傷明顯強于四環(huán)素。試驗結果從側面證明，諾氟沙星和四環(huán)素都能在藻細胞內部誘導產生大量活性氧，從而使細胞膜結構受損，最終導致藻細胞死亡。

3 結論

3.1 諾氟沙星和四環(huán)素在低濃度時都可以促進銅綠微囊藻生長，高濃度時二者對銅綠微囊藻表現出明顯的抑制作用，且諾氟沙星抑制能力明顯強于四環(huán)素;諾氟沙星和四環(huán)素對銅綠微囊藻96 h EC50分別為0.85 mg/L 和2.64 mg/L。

3.2 諾氟沙星和四環(huán)素在高濃度時對銅綠微囊藻光合作用有顯著的破壞，葉綠素-a濃度、Y值和α值變化都表現出明顯的濃度-效應關系，光合系統的破壞是諾氟沙星和四環(huán)素致死銅綠微囊藻的重要機理之一。

3.3 諾氟沙星和四環(huán)素在高濃度時會在藻細胞內部誘導產生大量活性氧，氧化藻細胞膜，引起MDA濃度明顯升高，且同劑量諾氟沙星產生的氧化脅迫明顯強于四環(huán)素，因此氧化脅迫是兩種抗生素破壞藻細胞的重要途徑。

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