甲磺酸伊馬替尼對(duì)高氧暴露新生大鼠肺保護(hù)作用及其機(jī)制

沙寧，田兆方，李玉紅

(1南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院，江蘇淮安223300;2淮安市第二人民醫(yī)院)

高氧肺損傷是危重癥新生兒救治過(guò)程中的主要并發(fā)癥，其常見(jiàn)形式是支氣管肺發(fā)育不良(BPD)［1］。血小板源性生長(zhǎng)因子B亞型(PDGF-B)與其受體結(jié)合后，可以刺激成纖維細(xì)胞產(chǎn)生膠原酶，造成間質(zhì)膠原斷裂及排列紊亂，引起肺組織纖維化，從而發(fā)生BPD［2，3］。研究證實(shí)，甲磺酸伊馬替尼能夠抑制血小板源性生長(zhǎng)因子受體(PDGFR)的酪氨酸激酶和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而抑制纖維化過(guò)程，在肺、骨髓等多種組織纖維化的治療中具有較好療效，但其對(duì)高氧所致肺損傷的影響鮮見(jiàn)報(bào)道［4，5］。2014 年11 月～2015 年3 月，我們對(duì)高氧暴露新生大鼠給予甲磺酸伊馬替尼治療，觀察其肺保護(hù)作用，并探討其機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)新生SD大鼠24只，雌雄不限，體質(zhì)量8.0～12.0 g，3日齡，均購(gòu)自江蘇省動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。甲磺酸伊馬替尼購(gòu)于諾華制藥有限公司，PDGF試劑盒購(gòu)自美國(guó)R＆D Systems公司，酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海盈公生物技術(shù)有限公司，GDS-8000型凝膠成像分析系統(tǒng)購(gòu)于英國(guó)UVP公司。

1.2 造模與分組處理 將24只新生大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組和伊馬替尼組各8只。正常對(duì)照組暴露于正常室內(nèi)空氣中(FiO2:21%)，高氧對(duì)照組、伊馬替尼組暴露于高濃度氧氣中(FiO2:95%，溫度23～25℃);伊馬替尼組高氧暴露的同時(shí)腹腔內(nèi)注射甲磺酸伊馬替尼50 mg/(kg·d)，正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組同時(shí)注射等量生理鹽水，共7天。各組母鼠每24 h互換，避免母鼠氧中毒影響新生鼠哺乳。

1.3 血清及支氣管肺泡灌洗液(BALF)PDGF-B檢測(cè) 各組均于造模10天腹腔注射10%水合氯醛8 mL/kg，采用眼眶取血法收集血液2 mL，1 500 r/min離心10 min，取血清。切斷腹主動(dòng)脈后放血處死大鼠，頸正中暴露氣管;剪開一小口插入導(dǎo)管并固定，向?qū)Ч軆?nèi)緩緩注入1 mL冷生理鹽水，反復(fù)回抽3次，收集BALF約0.8 mL。采用ELISA法檢測(cè)各組血清及BALF中PDGF-B水平，所有操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 肺組織病理學(xué)觀察及肺損傷評(píng)分 各組收集BALF后，快速剪開胸腔，取出雙側(cè)肺臟。生理鹽水反復(fù)沖洗。右肺組織以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋后連續(xù)切片。切片行HE染色，200倍光鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)改變。同時(shí)參照田兆方等［6］的方法，從肺泡間隔水腫、肺泡出血、肺泡內(nèi)纖維蛋白沉積、肺泡內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)4個(gè)方面對(duì)肺損傷進(jìn)行評(píng)分。

1.5 肺組織PDGF-B mRNA檢測(cè) 采用RT-PCR法。取大鼠左下肺組織，TRIzol試劑提取總RNA，計(jì)算RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。PDGF-B上游引物 5'-TCTGCTGCTACCTGCGTCTG-3'，下游引物5'-GCGTTGGTGCGGTCTATGA-3'，引物長(zhǎng)度316 bp;以GAPDH為內(nèi)參，上游引物5'-GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3'，下游引物5'-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3'，引物長(zhǎng)度540 bp。PCR反應(yīng)體系:RT 產(chǎn)物 2.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 2 μL，dNTPS(10 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，鎂離子4 μL。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性 5 min，56.3 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。將所得產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，采用GDS-8000型凝膠成像分析分析軟件檢測(cè)其灰度值，PDGF-B mRNA相對(duì)表達(dá)以目的基因與內(nèi)參基因灰度值的比值來(lái)表示。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血清及BALF中PDGF-B水平比較 見(jiàn)表1。

表1 各組血清及BALF中PDGF-B水平比較(±s)

表1 各組血清及BALF中PDGF-B水平比較(±s)

注:與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05;與高氧對(duì)照組比較，#P均＜0.01。

組別 n PDGF-B(pg/mL)BALF正常對(duì)照組血清0.462 0.000 8 0.71 ±0.19 66.15 ±3.99高氧對(duì)照組 8 0.86 ±0.29 103.91 ±6.79*伊馬替尼組 8 0.81 ±0.23 85.08 ±6.33*#P

2.2 各組肺組織病理觀察 正常對(duì)照組肺組織形態(tài)正常，肺泡結(jié)構(gòu)清晰。高氧對(duì)照組、伊馬替尼組肺泡壁明顯水腫、增厚，肺間質(zhì)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，出現(xiàn)輕、中度肺出血、肺水腫，肺泡充滿各種白細(xì)胞、纖維素，且高氧對(duì)照組上述變化更明顯。

2.3 各組肺損傷評(píng)分比較 正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組和伊馬替尼組肺損傷評(píng)分分別為(0.62±0.21)、(2.32 ±0.38)、(1.61 ±0.46)分。組間兩兩比較，P均 ＜0.05。

2.4 各組肺組織PDGF-B mRNA表達(dá)比較 正常對(duì)照組、高氧對(duì)照組和伊馬替尼組PDGF-B mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為 0.26 ±0.04、0.44 ±0.09、0.32±0.03。組間兩兩比較，P 均 ＜0.05。

3 討論

隨著肺表面活性物質(zhì)替代治療及機(jī)械通氣方式的改進(jìn)，近年來(lái)早產(chǎn)兒生存率明顯升高，但BPD的發(fā)病率也逐年增加［7，8］。BPD 的發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，其本質(zhì)是各種環(huán)境因素導(dǎo)致發(fā)育不成熟肺損傷及損傷后肺組織的異常修復(fù)［9］。當(dāng)未成熟肺暴露于高氧狀態(tài)下，產(chǎn)生大量氧自由基，超過(guò)機(jī)體消除能力，表現(xiàn)為進(jìn)行性肺損傷［10］。高氧肺損傷是組織彌散性肺泡炎和損傷后修復(fù)重建的病理生理過(guò)程，早期特征性改變是肺泡炎性水腫，繼而出現(xiàn)肺間質(zhì)增生和肺纖維化［11］。2～3日齡新生大鼠的肺臟發(fā)育處于囊泡期，肺發(fā)育尚未完善，塑形及重塑均較活躍，相當(dāng)于人類胎齡28周左右的肺發(fā)育結(jié)構(gòu)，由于肺泡發(fā)育不成熟，高氧更易對(duì)其產(chǎn)生損傷。本研究采用高氧誘導(dǎo)新生大鼠BPD模型，在病理過(guò)程及病理變化上符合早產(chǎn)兒BPD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程。

PDGF是刺激成纖維細(xì)胞分裂、增殖的重要因子。近年研究發(fā)現(xiàn)，PDGF在正常胎肺發(fā)育過(guò)程中存在動(dòng)態(tài)變化。PDGF與PDGFR在肺發(fā)育過(guò)程中起介導(dǎo)整個(gè)肺器官生長(zhǎng)的作用，其動(dòng)態(tài)變化與肺發(fā)育階段有關(guān)，主要影響上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化，也與呼吸道上皮出現(xiàn)或控制肺血管形成有關(guān)［12］。甲磺酸伊馬替尼是一種PDGFR酪氨酸激酶抑制劑，能抑制PDGFR的酪氨酸激酶和TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)通路上的 c-ABL，從而抑制纖維化過(guò)程［13，14］。

本研究結(jié)果表明，在高氧暴露下，肺組織損傷評(píng)分增加，提示高氧對(duì)肺組織有損傷;PDGF-B及PDGF-B mRNA表達(dá)明顯增多，提示PDGF-B可能是介導(dǎo)高氧肺損傷的機(jī)制之一，這與嚴(yán)青然等［15］報(bào)道一致。本研究結(jié)果還顯示，與高氧對(duì)照組比較，伊馬替尼組肺出血、肺水腫不明顯，肺泡白細(xì)胞、纖維素減少，肺組織損傷評(píng)分顯著降低，提示甲磺酸伊馬替尼對(duì)肺組織有保護(hù)作用。而PDGF-B及PDGF-B mRNA表達(dá)明顯減少，提示甲磺酸伊馬替尼可能通過(guò)PDGF及其受體軸對(duì)高氧誘導(dǎo)的新生大鼠肺損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。本研究中各組血清PDGF-B水平比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示甲磺酸伊馬替尼的這種保護(hù)作用直接作用于肺部。鑒于新生動(dòng)物肺組織的特殊性，有關(guān)甲磺酸伊馬替尼保護(hù)高氧所致肺損傷的確切機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

［1］Wong PM，Lees AN，Louw J，et al.Emphysema in young adult survivors of moderate-to-severe bronchopulmonary dysplasia［J］.Eur Respir J，2008，32(2):321-328.

［2］Schultz ED，Potts EN，Mason SN，et al.Mast cells mediate hyperoxia-induced airway hyper-reactivity in newborn rats［J］.Pediatr Res，2010，68(1):70-74.

［3］Zhang X，Reinsvold P，Thibeault DW，et al.Responses of pulmonary platelet-derived growth factor peptides and receptors to hyperoxia and nitric oxide in piglet lungs［J］.Pediatr Res，2005，57(4):523-529.

［4］Cho AY，Kim DH，Im M，et al.Pityriasis rosealike drug eruption induced by imatinib mesylate(GleevecTM)［J］.Ann Dermatol，2011，23(3):360-363.

［5］ García-Romero MT，Durán-McKinster C，de Ocariz MS，et al.Imatinib mesylate-induced neutrophilic folliculitis in a teenager［J］.Int J Dermatol，2012，51(12):1529-1530.

［6］田兆方，吉萍，李玉紅，等.人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)高氧暴露新生大鼠肺組織晚期糖基化終末產(chǎn)物受體通路的影響［J］.中華兒科雜志，2012，50(5):356-360.

［7］孫欽迎，張艷麗.早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良高危因素分析［J］.山東醫(yī)藥，2006，46(18):27-28.

［8］Mukherjee S，Duan F，Kolb Mr，et al.Platelet derived growth factor-evoked Ca2+wave and matrix gene expression through phospholipase C in human pulmonary fibroblast［J］.Int J Biochem Cell Biol，2013，45(7):1516-1524.

［9］田兆方，杜江，王斌，等.高氧對(duì)新生大鼠肺組織Cx26表達(dá)的影響［J］.山東醫(yī)藥，2006，46(24):19-20.

［10］趙詩(shī)萌，曹美玲，吳紅敏.體外高氧對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖、凋亡的影響［J］.山東醫(yī)藥，2011，51(41):22-24.

［11］胡劍，俞敏，唐云，等.小劑量糖皮質(zhì)激素預(yù)防早產(chǎn)兒支氣管肺發(fā)育不良效果觀察［J］.山東醫(yī)藥，2014，54(48):48-49.

［12］張海鴻，劉秀香，趙國(guó)英，等.谷酰胺對(duì)新生大鼠急性高氧肺損傷的保護(hù)機(jī)制［J］.山東醫(yī)藥，2012，52(21):8-10.

［13］Popova AP，Bentley JK，Cui TX，et al.Reduced platelet-derived growth factor receptor expression is a primary feature of human bronchopulmonary dysplasia［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，307(3):231-239.

［14］劉紅春，王吉耀.甲磺酸伊馬替尼對(duì)大鼠肝纖維化及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1表達(dá)的影響［J］.中華消化雜志，2007，27(6):363-367.

［15］嚴(yán)青然，鮑春德.甲磺酸伊馬替尼:一種潛在的抗纖維化藥物［J］.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2010，14(5):352-354.