六味地黃丸抑制移植性原發(fā)性肝癌小鼠腫瘤生長的實(shí)驗(yàn)研究

羅春蕾 顧怡中 鐘 薏 周榮耀

(上海市靜安區(qū)中心醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科，上海 200040)

1 上海市普陀區(qū)中醫(yī)醫(yī)院老年科，上海 200062

2 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院腫瘤科，上海 200021

原發(fā)性肝癌(以下簡稱肝癌)是指發(fā)生在肝細(xì)胞或肝內(nèi)膽管細(xì)胞的腫瘤，我國肝癌發(fā)病率居世界前列，以肝細(xì)胞癌為多，后者不足5%［1］。六味地黃丸是中醫(yī)臨床常用滋陰補(bǔ)腎的中藥方劑，有研究表明其對(duì)肝癌的治療也有顯著療效［2-3］。本實(shí)驗(yàn)觀察六味地黃丸對(duì)移植性肝癌模型小鼠腫瘤細(xì)胞生長的影響，探討其對(duì)肝癌的作用機(jī)制，以期為肝癌的中醫(yī)藥治療提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

1．1．1 動(dòng)物 昆明種小鼠30只，雄性，體質(zhì)量(20±2)g，無特定病原體(SPF)級(jí)條件下飼養(yǎng)，由上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物責(zé)任有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)SCXK(滬)2009-0069。

1．1．2 試劑及儀器 腹水型肝癌 H22細(xì)胞株(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫);血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)試劑盒(美國 R＆D公司);RPMI-1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司);小牛血清(美國Hyclone公司);酶標(biāo)儀(美國Biotek公司);流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)。

1．1．3 藥物 氟尿嘧啶注射液(5-FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H31020593)，超凈工作臺(tái)避光條件下，以無菌0．9%氯化鈉注射液稀釋至2 mg/mL，環(huán)氧樹脂(EP)管分裝，錫紙遮蓋，保存于4℃冰箱。六味地黃丸藥物組成:山藥12 g，澤瀉9 g，熟地黃12 g，山茱萸9 g，牡丹皮9 g，茯苓12 g。中藥生藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院中藥房提供，采用標(biāo)準(zhǔn)水煎提取，制成湯劑，蒸餾提取至含生藥2 mg/mL的水煎液，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 造模及分組 腹水型肝癌H22細(xì)胞株由上海中醫(yī)藥大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成預(yù)處理，接種于小鼠右前肢腋窩下，皮下注射種植。造模24 h后，將30只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組、5-FU組及實(shí)驗(yàn)組，每組10只，以苦味酸標(biāo)記，分籠飼養(yǎng)，每籠5只，自由飲食。

1．2．2 給藥方法 造模后第5 d給藥，模型組和實(shí)驗(yàn)組小鼠按0．1 mL/10 g分別予蒸餾水及六味地黃丸湯劑灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃10 d;5-FU組按照0．1 mg/10 kg予5-FU腹腔注射，隔日1次，治療10 d。

1．3 觀察指標(biāo)及方法

1．3．1 腫瘤表觀擴(kuò)散系數(shù)(ADC) 各組小鼠造模后第14 d禁食1 d，第15 d稱取體質(zhì)量，予0．5%戊巴比妥鈉0．1 mL/10 g腹腔注射麻醉，麻醉完成后進(jìn)行核磁共振成像(MRI)檢查。由2位MRI診斷專家采用雙盲法測(cè)量各組小鼠ADC值，結(jié)合T1WI(T1加權(quán)像)及T2WI(T2加權(quán)像)，選取病灶最大層面，在ADC圖上選取病灶實(shí)性部分，手工繪制橢圓形感興趣區(qū)(ROI)，測(cè)量腫瘤實(shí)質(zhì)部分的ADC值。若觀測(cè)者測(cè)量結(jié)果出現(xiàn)較大分歧，另由1位高年資經(jīng)驗(yàn)豐富的MRI診斷專家復(fù)核測(cè)量。

1．3．2 血清 VEGF 血清 VEGF的測(cè)定采用ELISA法。造模后第16 d，各組小鼠摘眼球取不抗凝血，血液樣本于2 h內(nèi)以5 000 r/min速度離心20 min，離心后去血清，-20℃保存。

1．3．3 體質(zhì)量、去瘤體質(zhì)量、腫瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)及腫瘤生長抑制率(抑瘤率) 各組小鼠體質(zhì)量固定于每日給藥前測(cè)定。各組小鼠摘眼球取血后脫頸椎處死，剖取瘤體，測(cè)定瘤體質(zhì)量。去瘤體質(zhì)量=處死前小鼠體質(zhì)量-瘤體質(zhì)量。腫瘤指數(shù)=瘤體質(zhì)量/去瘤體質(zhì)量。抑瘤率=［1-(用藥組瘤體質(zhì)量/模型組瘤體質(zhì)量)］×100%。

1．3．4 腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期檢測(cè) 各組小鼠均取新鮮腫瘤組織0．5～1．0 g，由上海中醫(yī)藥大學(xué)生化與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)肝癌細(xì)胞凋亡百分比，觀察細(xì)胞周期。

1．4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 16．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(ˉx±s)表示，組間比較先采用方差分析進(jìn)行顯著性檢驗(yàn);多組樣本均數(shù)間兩兩比較采用q檢驗(yàn);非參數(shù)檢驗(yàn)采用χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2．1 各組小鼠體質(zhì)量及去瘤體質(zhì)量比較 見表1。

表1 各組小鼠體質(zhì)量及去瘤體質(zhì)量比較g，±s

表1 各組小鼠體質(zhì)量及去瘤體質(zhì)量比較g，±s

與模型組比較，*P ＜0．05;與5-FU 組比較，△P ＜0．05

組 別 n體質(zhì)量第1 d 第5 d 第8 d 第16 d 去瘤體質(zhì)量模型組 10 20．43 ±1．32 24．15 ±2．00 24．89 ±1．95 24．58 ±2．43 20．11 ±2．25 5-FU 組 10 20．57 ±1．39 24．23 ±1．48 25．99 ±1．11 28．65 ±3．49* 26．67 ±3．69*實(shí)驗(yàn)組 10 20．34±1．29 24．06±1．86 28．33±3．05＊△ 35．42±1．82＊△ 32．36±1．79＊△

由表1可見，造模后第8 d，實(shí)驗(yàn)組小鼠體質(zhì)量均高于5-FU組及模型組(P＜0．05)，5-FU組與模型組體質(zhì)量相當(dāng)(P＞0．05);造模后第16 d，實(shí)驗(yàn)組及5-FU組小鼠體質(zhì)量及去瘤體質(zhì)量均高于模型組(P＜0．05)，且實(shí)驗(yàn)組比5-FU組高出更明顯(P ＜0．05)。

2．2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)及抑瘤率比較見表2。

表2 各組小鼠腫瘤質(zhì)量、腫瘤指數(shù)及抑瘤率比較

由表2可見，各組小鼠腫瘤質(zhì)量及腫瘤指數(shù)比較，實(shí)驗(yàn)組均低于模型組(P＜0．05)，均高于5-FU組(P＜0．05)，各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);實(shí)驗(yàn)組與5-FU組抑瘤率比較，實(shí)驗(yàn)組低于5-FU組(P＜0．05)。

2．3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期所占百分比比較 見表3。

表3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期所占百分比比較%，±s

表3 各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期所占百分比比較%，±s

與模型組比較，*P ＜0．05;與5-FU 組比較，△P ＜0．05

組 別 n 細(xì)胞凋亡細(xì)胞周期G0-G1期 S期 G2-M期模型組 10 3．628 ±2．150 46．13 ±6．39 38．61 ±8．43 15．27 ±7．11 5-FU 組 10 24．296 ±2．748* 70．77 ±13．21* 15．33 ±6．10* 13．62 ±7．95實(shí)驗(yàn)組 10 10．670±2．318＊△ 57．50±5．86＊△ 33．07±4．67△9．44 ±4．09

由表3可見，各組小鼠腫瘤細(xì)胞凋亡百分比比較，實(shí)驗(yàn)組高于模型組(P＜0．05)，低于5-FU組(P＜0．05)，各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。各組小鼠細(xì)胞周期百分比比較，實(shí)驗(yàn)組G0-G1期細(xì)胞高于模型組(P＜0．05)，低于5-FU組(P＜0．05)，各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05);實(shí)驗(yàn)組S期細(xì)胞高于5-FU組(P ＜0．05)，與模型組相當(dāng)(P ＞0．05);各組G2-M期細(xì)胞組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0．05)。

2．4 各組小鼠血清VEGF水平及ADC值比較表4。

表4 各組小鼠血清VEGF水平及腫瘤ADC值比較 ±s

表4 各組小鼠血清VEGF水平及腫瘤ADC值比較 ±s

與模型組比較，*P ＜0．05;與5-FU 組比較，△P ＜0．05

組 別 n VEGF(pg/mL) ADC(mm2/s)模型組10 34．385 6 ±5．370 3 1421．058 ±159．903 5-FU 組 10 15．895 1 ±2．907 1* 743．777 ±104．882*實(shí)驗(yàn)組 10 18．725 4±0．936 8＊△ 940．376±124．263＊△

由表4可見，各組小鼠血清VEGF水平及ADC值比較，實(shí)驗(yàn)組均低于模型組(P＜0．05)，均高于5-FU組(P＜0．05)，各組組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05)。

3 討論

肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，病因尚不完全清楚，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，死亡率高。VEGF是迄今為止已知人體內(nèi)最強(qiáng)的血管生成因子［4］，能直接或間接參與血管生成，大量臨床研究顯示，VEGF高表達(dá)與腫瘤惡性程度及患者預(yù)后不良密切相關(guān)［5］。因此，抗腫瘤血管生成藥物的研制和應(yīng)用廣受國內(nèi)外醫(yī)藥界關(guān)注，并有一些藥物應(yīng)勢(shì)而生，但仍然存在一些問題不容忽視，因VEGF亞型較多，其作用機(jī)制尚未完全明晰，長期服用該類藥物是否會(huì)造成其他難以估測(cè)的損傷尚不明確［4］。氟尿嘧啶在體內(nèi)先轉(zhuǎn)變?yōu)?-氟-2-脫氧尿嘧啶核苷酸，后者可抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻斷脫氧尿嘧啶核苷酸轉(zhuǎn)變?yōu)槊撗跣叵汆奏ず塑账?，從而抑制DNA的生物合成，抑制腫瘤生長［6］。

影像學(xué)檢查是肝癌動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)的重要技術(shù)手段，彌散成像作為一種無創(chuàng)性成像技術(shù)，可根據(jù)組織的水分子張力差，別即擴(kuò)散受限程度的不同進(jìn)行成像，通過檢測(cè)生物體內(nèi)水分子運(yùn)動(dòng)狀態(tài)的改變而間接反映組織結(jié)構(gòu)和細(xì)胞密度等信息，提供的ADC值能消除T2穿透效應(yīng)，提供量化指標(biāo)，從分子水平分析組織內(nèi)部特征以及對(duì)治療的反應(yīng)［7］。腫瘤細(xì)胞增生活躍時(shí)，細(xì)胞、血管外周間隙增大，水分子擴(kuò)散受限較低，故表現(xiàn)出較高的ADC值;而細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，胞漿濃縮，細(xì)胞固縮，細(xì)胞外周間隙相對(duì)偏小，水分子自由擴(kuò)散受限較高，表現(xiàn)出較低的ADC值。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，肝癌之病位在肝，常累及周身。肝、腎母子相生，精血同源，且同寄相火，藏瀉互用，一者為病，常累及余者。又腎為先天之本，乃臟腑陰陽之根本，古有“久病及腎”之說，肝、腎功能息息相關(guān)，一榮俱榮，一辱俱辱，故在治法上有“乙癸同源，肝腎同治”之說，發(fā)展至今，于臨床廣為應(yīng)用［8-9］。六味地黃丸為肝、腎同治的代表方。宋·錢仲陽論“腎主虛，無實(shí)也”，以腎氣丸裁桂枝、附子，成六味地黃此通補(bǔ)開闔之劑，大補(bǔ)肝、脾、腎，用治各類疾病過程中出現(xiàn)的腎陰虧損，或肝腎不足之證。六味，即苦、酸、甘、咸、辛、淡者也。熟地黃味苦，入腎，大補(bǔ)腎之精血，固封蟄之本;山茱萸味酸，入肝，補(bǔ)肝固精，緩罷極之牢;山藥味甘，入脾，健脾助運(yùn)。此3味以后天之精助先天之用，謂曰“三補(bǔ)”。古人用補(bǔ)，必兼瀉邪，邪去則補(bǔ)方得力。方中“三瀉”即指澤瀉、牡丹皮、茯苓。澤瀉味咸，入膀胱，泄腎濁，兼制熟地黃之滋膩，開氣化之源，助熟地黃填少陰、太陽之精;牡丹皮味辛，入膽，清中正之氣，制山茱萸之溫，佐其補(bǔ)厥陰、少陽之精;茯苓味淡，入胃，利出入之器，滲脾利濕，以助山藥養(yǎng)脾陰，補(bǔ)太陰、陽明之精。三補(bǔ)三瀉合用，通方滋而不膩，相和相濟(jì)，不燥不寒，清·張秉成謂之曰“王道之方”。臨床研究表明，六味地黃可應(yīng)用于腫瘤患者的放化療、手術(shù)前后、內(nèi)分泌治療等多個(gè)階段，具有減毒、增效作用，可協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞生長和擴(kuò)散，提高患者生活質(zhì)量，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能［10］。

本研究結(jié)果顯示，六味地黃丸可抑制肝癌小鼠腫瘤生長，對(duì)于細(xì)胞周期亦有影響，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，促使G0-G1期細(xì)胞聚集，減少S期細(xì)胞，干擾了小鼠肝癌細(xì)胞在細(xì)胞周期中的進(jìn)程，鑒于細(xì)胞周期的調(diào)控復(fù)雜未明，因此具體的作用機(jī)制仍有待探究。六味地黃丸可抑制血清VEGF的表達(dá)，降低腫瘤ADC值，提示其抗癌作用可能與下調(diào)VEGF水平相關(guān)。綜上所述，六味地黃丸可明顯抑制肝癌小鼠瘤體生長，影響瘤體細(xì)胞周期，誘導(dǎo)小鼠肝癌細(xì)胞凋亡，降低血清VEGF水平，降低腫瘤ADC值，從而產(chǎn)生良好的抗腫瘤作用。

［1］ 王吉耀．內(nèi)科學(xué)(上冊(cè))［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2008:513．

［2］ 周斌，曾柏榮．六味地黃丸在腫瘤治療中的作用［J］．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010，23(1):91-93．

［3］ 任怡．六味地黃湯對(duì)小鼠原發(fā)性肝癌模型的作用機(jī)制研究［J］．湖南中醫(yī)雜志，2013，29(2):124-126．

［4］ 鄒文員，張自力．血管內(nèi)皮生長因子與原發(fā)性肝癌血管新生關(guān)系及抗血管治療的進(jìn)展［J］．放射學(xué)實(shí)踐，2009，24(3):338-339．

［5］ 羅春蕾，周榮耀．補(bǔ)腎健脾方治療肝腎陰虛兼脾氣虛肝癌30 例［J］．中醫(yī)研究，2010，23(6):30-32．

［6］ 高君，程研，孔健，等．氟尿嘧啶植入劑對(duì)H22肝癌移植瘤射頻消融后殘留癌的抑制作用及其機(jī)制［J］．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2011，28(8):1299-1302．

［7］ 汪洋，林從堯，周夏．大腸癌中β-catenin表達(dá)及與COX-2、VEGF表達(dá)的關(guān)系［J］．腫瘤防治研究，2006，33(1):20-22．

［8］ 張怡．原發(fā)性肝癌與脾腎關(guān)系之病機(jī)淺探［J］．新中醫(yī)，2011，43(2):4-5．

［9］ 譚程，李曉君．肝腎相關(guān)的病機(jī)及治療規(guī)律探討［J］．北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào):中醫(yī)臨床版，2007，14(2):28-30．

［10］ 周斌，曾柏榮．六味地黃丸在腫瘤治療中的作用［J］．腫瘤基礎(chǔ)與臨床，2010，23(1):91-93．