冬季大亞灣微表層浮游植物群落結構與DNA指紋的日變化

馬長江, 王朝暉, 楊 雪, 梁建新

(暨南大學 生態(tài)學系 水體富營養(yǎng)化與赤潮防治廣東普通高校重點實驗室, 廣東 廣州 510632)

海洋微表層是位于海洋與大氣之間的薄層(≤1000 μm), 與其他水層相比, 具有獨特的物理、化學和生物性質, 同時也在海洋與大氣之間的熱量與氣體交換、顆粒循環(huán)及微生物圈上扮演著重要角色[1-4]。作為海洋與大氣之間相互作用的一個重要界面, 微表層對營養(yǎng)鹽、有機化合物、重金屬以及微生物、浮游生物等均具有明顯富集作用[5-7]。微表層浮游植物的光合作用能改變海-氣物質交換, 其群落結構則對生物地化循環(huán)產生影響[8]。由于許多無脊椎浮游動物依賴微表層浮游植物生存, 微表層浮游植物能對浮游動物產生上行效應[9]。

微表層位于水體表面, 直接與陽光接觸, 水溫較高, 環(huán)境因子的日變化變動劇烈[10-11], 浮游植物群落結構也會產生一定變化以適應微表層特殊、多變的環(huán)境。本課題組前期研究結果顯示微表層浮游植物群落結構與水層具有一定差異, 耐高溫的藍細菌數(shù)量明顯增加[2,12]。Falkowska等[13]通過對南波羅的海微表層、次表層葉綠素 a含量的日變化研究得出, 太陽輻射和紫外輻射能明顯抑制葉綠素 a含量,在正午及午后葉綠素 a的含量明顯降低。但是目前尚未有對微表層浮游植物群落結構及遺傳多樣性日變化的研究報道, 本文通過對大亞灣大鵬澳海域微表層、次表層浮游植物群落結構的日變化進行分析,并利用PCR-DGGE技術研究了浮游植物DNA指紋圖譜, 以揭示微表層以及次表層浮游植物群落結構的日變化規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 采樣位點的設置與樣品的采集

在大亞灣海域設置了 3個采樣位點(圖 1), 于2013 年 12 月 3 日清晨(6：00)、正午(12：00)、傍晚(18：00)采集了微表層和次表層水樣, 三個站位的微表層和次表層樣品分別以W1、W2、W3以及C1、C2、C3表示。微表層樣品的采集采用篩網法, 將孔徑為1.0 mm的不銹鋼網篩鑲在40 cm×50 cm的鋁框中, 將篩網取樣器水平沒入海面下, 然后輕輕提起, 將篩網垂直豎起, 附在網格上的水膜逐漸脫離網格, 微表層水樣流入樣品瓶中。重復此過程直至收集到所需的水樣體積, 取樣量除以取樣次數(shù)和篩板表面積可得微表層厚度(200 μm±10 μm)。次表層水樣用 5LWB-PM有機玻璃采水器采集離水面0.5 m的水樣。

圖1 大亞灣采樣點的設置Fig.1 Sampling stations in Daya Bay

采集微表層、次表層水樣500 mL, 用4%的福爾馬林固定, 經沉淀濃縮至20 mL, 用于進行浮游植物定性定量。采集水樣 3 L, 用 1.5%的魯格試劑固定,用孔徑1.2 μm的Millipore RTTP濾膜進行抽濾, 濾膜保存于-20℃, 用于浮游植物總DNA的提取。

1.2 環(huán)境參數(shù)的測定

用ProPlus型YSI儀以及Digital Luxmeter ZDS-10W照度儀現(xiàn)場測定水溫、鹽度、溶解氧、電導率、pH值以及光照強度。

1.3 浮游植物的分析鑒定

浮游植物的定性定量分析是在萊卡 DMIRB顯微鏡下進行, 取 0.1mL經過固定濃縮的樣品, 根據(jù)海洋浮游植物分類學相關資料[14-15], 對浮游植物進行定性定量分析, 大部分浮游植物鑒定至種, 不能確定的種類鑒定至屬。每個樣品至少觀察兩次, 計數(shù)100個以上細胞, 浮游植物細胞密度以個/L表示。

1.4 浮游植物總DNA的提取與PCR擴增

采用上海生工的 UNIQ柱式植物基因組提取試劑盒提取浮游植物總DNA, 經Nanodrop 2000/2000C檢測 DNA的濃度及純度, 用 1%的瓊脂糖凝電泳膠檢測提取效果后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PCR擴增區(qū)域為18S rDNA V3區(qū)片段, 用真核生通用引物對18S rDNA進行PCR擴增, 上下游引物分別為 Euk1209f-GC(5'-CGCCCGGGGCGCGCCC CGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG-3')和Uni1392r(5'-ACGGGCGGTGTGTA C-3')[16], 由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應在 Applied Biosystems verityTMPCR儀中進行, 反應體系為40 μL,包括 4 μL 10×反應緩沖液、0.8 μL上、下游引物(10 μmol/L)、1.2 μL dNTPs(10 mmol/L)、0.6 μL Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)、模板量 1.5 μL, 最后以 ddH2O補足體積。本實驗采用降落PCR, 反應條件為94℃1 min, 94℃變性1 min, 65℃退火2 min, 72℃延伸2 min,共10個循環(huán)(每個循環(huán)退火溫度降低1℃)； 94℃變性7 min； 55℃退火 1 min, 72℃延伸3 min, 20個循環(huán),最后72℃延伸7 min。用1%的瓊脂糖凝電泳膠檢測PCR產物, 其目的片段大小為210 bp, 大小均一, 符合DGGE電泳擴增范圍(200～600 bp)。

1.5 DGGE分析

在 Bio-Rad公司的 DcodeTM通用突變檢測系統(tǒng)對PCR產物(40 μL)進行DGGE分析。條件為： 丙烯酰胺質量分數(shù)8%, 變性梯度30%～70%(100%的變性劑濃度為 7 mol/L尿素和質量分數(shù) 40%去離子甲酰胺), 先用100 V電壓電泳2 min, 然后再用100 V電壓電泳16 h, 緩沖液為1×TAE, 電泳結束后用SYBR GREEN I染色30 min, 用 Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000TM)進行拍照。

1.6 計算與數(shù)據(jù)分析

1.6.1 富集系數(shù)與富集率

微表層浮游植物的富集系數(shù)(Enrichment factor,EF)定義為微表層浮游植物細胞密度與同一站位次表層浮游植物細胞密度之比, 富集率則為富集系數(shù)大于1.0的樣品所占的百分比。

1.6.2 數(shù)據(jù)處理與分析

DNA指紋圖譜用Quantity one軟件進行帶型分析, 條帶光密度值強度低于 0.05被排除。將浮游植物細胞密度進行了自然對數(shù)轉換, 用SPSS19軟件采用組間聯(lián)接、平方Euclidean距離的度量方法對3個站位微表層、次表層樣品進行聚類分析, 并對清晨、正午、傍晚及微表層與次表層浮游植物群落結構進行顯著性差異分析。

2 結果

2.1 環(huán)境參數(shù)的變化

由表 1可以看出, 光照強度遵循一天中由弱到強到弱的變化趨勢, 微表層光強遠高于次表層(P＜0.05), 由于采樣時間的不一致, 清晨最后采樣的St.3光照強度明顯高于其他兩個站點, 而傍晚則以St.1的光強最高。三個站點水溫相近, 正午最高, 清晨較低, 為 18.8～20.3℃之間； 微表層的鹽度和電導率明顯低于次表層, 溶解氧含量明顯高于次表層,其余參數(shù)在微表層和次表層之間沒有明顯變化。

表1 大亞灣海域微表層和次表層水環(huán)境參數(shù)的日變化Tab.1 Daily changes of the environment parameters in the surface microlayer (SML) and subsurface water (SSW) from Daya Bay

2.2 DNA指紋圖譜

DNA指紋圖譜清晰, 各站位不同時間浮游植物DNA指紋條帶基本相近, 同時又具有一定差異(圖2)。DGGE圖譜帶型圖則能更清楚地反映各站位DNA指紋條帶數(shù)以及優(yōu)勢種的分布規(guī)律(圖3), 其中傍晚條帶數(shù)最為豐富, 共有 41個條帶, 清晨和正午的條帶數(shù)分別為23條、28條。

在同一時刻樣品中的優(yōu)勢種和常見種基本上相近, 如條帶1、2、4、5、9、18是清晨樣品中的常見條帶, 在所有站位中均大量出現(xiàn)(圖 3A)； 正午樣品的DNA指紋較為豐富, 條帶4、7、14、15、20為常見優(yōu)勢條帶(圖 3B)； 傍晚條帶更為豐富多元, 條帶2、4、6、13、25為常見優(yōu)勢條帶(圖3C), 條帶16、19、23和27也在所有樣品中出現(xiàn)。樣品DNA指紋條帶數(shù)為 12～28條(圖 4), 微表層略高于次表層, 平均分別為18.8條和18.1條, 其中W2的條帶數(shù)較為豐富。傍晚條帶較為豐富, 為 19～28條, 平均為 22條, 明顯高于清晨與正午(P＜0.05)； 正午與清晨DNA 指紋條帶相近, 差異不顯著 (P＞0.05), 平均條帶數(shù)分別為17.8條和15.7條。

2.3 浮游植物群落結構

在本次調查中, 共分析觀察到浮游植物 79種,微表層和次表層浮游植物種分別為61種、68種, 清晨、正午和傍晚觀察分別為 49種、61種、51種。每個樣品觀察到 26～40種, 其中微表層和次表層平均分布為32.3種和33.9種, 兩者之間沒有明顯差異(P＞0.05)； 清晨、正午和傍晚每個樣品所觀察到的種類數(shù)也沒有明顯差別(P＞0.05), 平均分別為30.8種、35.2種、33.3種。

硅藻是本次調查的絕對優(yōu)勢類群, 優(yōu)勢硅藻主要包括角毛藻(Chaetocerosspp.)、中肋骨條藻(Skeletonema costatum)、丹麥細柱藻(Leptocylindrus danicus)、菱形海線藻(Thalassionema nitzschioides)以及擬菱形藻(Pseudo-nitzschiaspp.)等, 其中角毛藻的種類較豐富, 主要為扭鏈角毛藻(Chaetocerostortissimus)、洛氏角毛藻(C. lorenzianus)、扁面角毛藻(C. compressus)、窄隙角毛藻(C. affinis)等。優(yōu)勢甲藻主要為原甲藻類, 如反曲原甲藻(Prorocentrum sigmoides)和海洋原甲藻(P.micans)等。

圖2 大亞灣微表層和次表層浮游植物18S rDNA V3 區(qū)DGGE圖譜Fig.2 The DGGE fingerprints of V3 region of 18S rDNA of phytoplankton in the SML and SSW from Daya Bay

圖3 浮游植物DGGE圖譜分析帶型圖Fig.3 DGGE profiles of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

在一天的調查中, 浮游植物密度變化范圍在4.6×105～4.0×106個/L, 平均為 1.5×106個/L。浮游植物細胞密度的日變化不顯著(P＞0.05, 圖5), 清晨、正午和傍晚的平均細胞密度分別為1.2×106、1.6×106、1.6×106個/L； 微表層和次表層間差異也不顯著(P＞0.05), 平均細胞密度分別為 1.7×106個/L 和1.2×106個/L。本次調查中, 雖然正午和傍晚微表層浮游植物細胞密度高于次表層, 特別是 W3正午細胞密度明顯高于其余樣品, 但微表層和次表層之間無顯著性差異(P＞0.05)。

微表層和次表層浮游植物均以硅占據(jù)絕對優(yōu)勢,硅藻所占比例均在98%以上。此外還有少量的甲藻,而其他類別的浮游植物甚少出現(xiàn)(圖 6)。整體來說,清晨 6： 00的樣品中硅藻百分比含量較高, 達到99.6%, 基本上沒有其他類別的浮游植物出現(xiàn)； 正午和傍晚甲藻出現(xiàn)的數(shù)量增加(圖 6A)。微表層硅藻的百分比含量也高于次表層(圖 6B), 甲藻和其他藻類在次表層百分比含量增加。

圖4 浮游植物DNA指紋條帶數(shù)的日變化Fig.4 DNA fingerprints of 18S rDNA V3 region of phytoplankton

圖5 大亞灣微表層和次表層浮游植物總細胞密度的日變化Fig.5 Cell density of total phytoplankton in the SML and SSW from Daya Bay

2.4 浮游植物群落聚類分析

圖7為浮游植物群落結構的聚類分析圖, 清晨(圖 7A)、正午(圖 7B)和傍晚(圖7C)浮游植物聚類結果都可明顯看出St.1和St.2的微表層與次表層樣品分別聚集在一起, 而St.3則單獨成一類。在全天的浮游植物聚類中(圖 7D), 大部分站位的微表層和次表層樣品以較小的距離聚集成一大類, 但是 St.3的 5個樣品未與其余樣品聚在一起, 特別是 W3正午和傍晚樣品與其他樣品距離較遠。結果說明大亞灣海域微表層和次表層浮游植物群落結構比較相近, 站位間的差異大于微表層和次表層之間的差異, 而且相對較為離岸的St.3與近岸的St.1和St.2差異較大。

2.5 微表層對浮游植物的富集作用

由表2可以看出, 微表層對總浮游植物、硅藻以及優(yōu)勢硅藻種類的富集系數(shù)均在1.0以上, 富集率均超過了 66.7%； 但是微表層僅在清晨對甲藻具有較高的富集作用, 在正午和傍晚均無富集作用。角毛藻、中肋骨條藻和丹麥細柱藻是大亞灣海域優(yōu)勢硅藻, 在所有樣品中均出現(xiàn), 它們對浮游植物總數(shù)的貢獻超過了 70%, 微表層對這三種優(yōu)勢硅藻均具有明顯的富集作用, 其中對中肋骨條藻和丹麥細柱藻的富集系數(shù)分別高達 4.20和 5.47, 富集率均為100%。

圖6 大亞灣海域各類別浮游植物的數(shù)量百分比組成Fig.6 The quantitative percentages of different groups of Phytoplankton

表2 大亞灣海域微表層對浮游植物的富集系數(shù)與富集率Tab.2 The enrichment factor (EF) and enrichment frequency (%) of the SML on phytoplankton

圖7 浮游植物群落結構的聚類分析Fig.7 Clustering dendrogam of sampling stations based on phytoplankton community

2.6 浮游植物種類與DNA指紋條帶的比較

圖8對浮游植物DGGE指紋條帶數(shù)以及顯微鏡下觀察分析的浮游植物種類數(shù)進行了比較。結果顯示, 所有站位樣品中, DNA指紋條帶數(shù)均低于顯微鏡下觀察分析得到的浮游植物種類數(shù), 并且正午和傍晚浮游植物種類數(shù)和DNA指紋條帶數(shù)較為豐富。微表層平均 DNA指紋條帶數(shù) 18.9條, 平均種類為32.3種； 次表層平均DNA指紋條帶數(shù)為18.1條, 平均種類33.9種, 條帶數(shù)僅為種類數(shù)的60%左右。

如果剔除數(shù)量上小于 0.1%的浮游植物種類數(shù),種類數(shù)仍高于 DNA 指紋條帶數(shù)(圖 8)； 如果剔除數(shù)量上小于 0.5%的浮游植物種類數(shù), 則指紋條帶數(shù)與優(yōu)勢種的種類數(shù)相近； 如果剔除了在數(shù)量上小于1%的浮游植物種類數(shù), DNA指紋條帶數(shù)高于優(yōu)勢浮游植物種類數(shù), 而且各樣品之間優(yōu)勢浮游植物種類數(shù)相差不大。DNA指紋條帶數(shù)、浮游植物種類數(shù)以及＞0.1%、＞0.5%、＞1%浮游植物優(yōu)勢種種類數(shù)的平均值分別為22條、33種、27種、16種、11種。

3 討論

與前期研究結果相近[2], 大亞灣浮游植物種類和數(shù)量均較為豐富, 一天調查分析中就鑒定出浮游植物 79種, 平均細胞密度為 1.5×106個/L。由于大亞灣地處亞熱帶海域, 冬季水溫較高, 同時臨近大亞灣和嶺澳兩個核電站, 溫排水的排放也致使大亞灣冬季水溫的上升[17], St.3由于更靠近核電站, 水溫均高于其他站位。有研究表明, 較高的水溫在冬季更有利于浮游植物的生長[18], 本研究中 St.3細胞密度均高于其他兩個站位, 而前期研究也顯示大亞灣海域浮游植物密度幾乎在每年在冬季都出現(xiàn)高峰值[19]。

微表層被認為是在海洋表面的一種親水性膠質膜[20-21], 風浪容易導致微表層膠質膜的破裂, 使微表層與次表層產生混合[22]。在本研究中, 微表層和次表層浮游植物群落結構較相近, 無顯著性差異(P＞0.05), 而且在聚類分析中同一站位或者相近站位會聚集在一起, 說明大亞灣海域微表層和次表層浮游植物混合均勻。小型鞭毛藻類和硅藻被認為是溫帶近岸海域微表層浮游植物的主要組成成分[9]。在本研究中, 硅藻也是大亞灣微表層和次表層的絕對優(yōu)勢種類, 而甲藻等鞭毛藻類則在微表層出現(xiàn)較少。

圖8 DNA指紋條帶數(shù)與浮游植物種類數(shù)的比較Fig.8 Comparison between DNA fingerprints and species richness of phytoplankton.

微表層對有機物、重金屬、營養(yǎng)鹽、生物代謝物以及細菌、光合色素等具有很強的富集作用, 對某些物質的富集系數(shù)甚至高達幾個數(shù)量級[23]。在本研究中,微表層對總浮游植物、硅藻以及角毛藻、中肋骨條藻、丹麥細柱藻等優(yōu)勢硅藻均具有明顯的富集作用, 而對甲藻沒有富集作用。分析其原因, 首先是因為大亞灣海域的浮游植物是一個由硅藻占據(jù)絕對優(yōu)勢的群落, 在以往的大量調查中硅藻的年均百分比含量均超過90%,而且常常形成冬季硅藻水華； 其次, 微表層中較高的營養(yǎng)鹽以及光照強度也是其對小型硅藻產生富集作用的重要原因[23]； 此外本研究是通過光學顯微鏡觀察來分析浮游植物種類和數(shù)量, 可能有少數(shù)小型鞭毛藻類(＜10 μm), 由于體型過小, 在顯微鏡分析中被忽略。

雖然有文獻報道正午和下午高強度輻射以及紫外輻射能對微表層和次表層浮游植物的色素體產生傷害作用, 導致在正午和午后微表層和次表層葉綠素a含量的下降[13]。但在本研究中, 清晨、正午和傍晚浮游植物種類及數(shù)量沒有明顯差別(P＞0.05), 浮游植物日變化不明顯； DNA指紋條帶數(shù)也僅在清晨明顯較低(P＜0.05), 然而正午微表層對總浮游植物以及硅藻的富集系數(shù)較高。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能是由于本次調查為冬季, 正午日照強度雖然也較高, 微表層光強達到820～1196 μE, 但由于其紫外強度較弱, 高強度日照時間較短, 尚未達到抑制浮游植物生長的程度, 此外次表層正午甲藻數(shù)量的增加也在一定程度上說明正午的高日照強度促進了浮游植物的生長。

大亞灣冬季浮游植物 DNA指紋條帶比較豐富,但是DNA指紋條帶數(shù)均遠低于顯微鏡下觀察分析得到的浮游植物種類數(shù), 條帶數(shù)僅為種類數(shù)的 60%左右。一方面可能是因為在利用Quantity one軟件分析DNA指紋圖譜時, 會將光密度值強度低于0.05的條帶剔除。另一方面可能是因為DNA在PCR擴增過程中, 一些稀有種類的 DNA含量少, 浮游植物優(yōu)勢種類對其產生屏蔽作用, 而且在電泳過程中容易發(fā)生共遷移現(xiàn)象[24]。在本調查中, 浮游植物群落均是由一種或者兩種硅藻占據(jù)絕對優(yōu)勢, 從而導致在PCR-DGGE分析中對其他非優(yōu)勢種的屏蔽作用相對更強。但是如果剔除數(shù)量上小于0.5%的浮游植物種類數(shù),指紋條帶數(shù)則與優(yōu)勢種的種類數(shù)相近, 結果說明PCR-DGGE技術能較大程度地反映浮游植物優(yōu)勢種群的組成, 而對于相對含量較少的物種可能會由于優(yōu)勢種的屏蔽作用而被掩蓋, 對浮游植物種類的檢測靈敏度為優(yōu)勢度0.5%。此外尚需結合熒光定量PCR以及切膠測序等方法對浮游植物群落結構進行定性定量分析。由此說明PCR-DGGE技術在分析浮游植物群落結構上具有一定的可行性, 但傳統(tǒng)的顯微鏡分析方法仍是浮游植物群落結構研究中最為可靠的方法之一。

微表層的采樣有很多種方法[25-26], 包括玻璃板法(采集厚度 40～60 μm)、金屬篩網法(200～400 μm)、平滑采樣器(1 000～2 000 μm)以及轉筒采樣器(70～100 μm),取樣方法的不同, 所取得的樣品厚度也有所不同,可能會對分析結果產生一定的影響[17]。但是研究顯示, 不同的采樣方法對芳香烴[25]及多氯聯(lián)苯類[26]在微表層的富集沒有明顯影響, 其中篩網法可以適應不同的氣候條件, 是較為理想的微表層采樣方法[26]。在本研究中采用篩網法采集微表層水樣, 采集的是厚度為200 μm以內的微表層水樣, 這部分微表層水樣中不僅包括浮游植物, 也包括了浮游細菌以及一些小型浮游動物。此外, 風浪也影響微表層膜的形成,風速為5～10 m/s下對微表層影響不大, 但是超過12 m/s的風速可以破壞微表層, 水華也可導致微表層的破壞[22]。大亞灣屬于半封閉內灣, 風浪較小, 在沒有降雨和藻華的情況下微表層應保存完好。

4 結論

1) 大亞灣海域浮游植物種類、數(shù)量以及 DNA指紋均較豐富, 硅藻占據(jù)絕對優(yōu)勢； 清晨、正午和傍晚浮游植物種類和數(shù)量無明顯差異, 浮游植物群落結構日變化不明顯。

2) 雖然微表層與次表層浮游植物群落結構相近,但微表層對浮游植物具有較好的富集作用, 對硅藻以及優(yōu)勢硅藻種類的富集作用較為明顯, 其中對中肋骨條藻及丹麥細柱藻的富集率高達100%, 而對甲藻的富集作用卻不明顯。

3) 傳統(tǒng)的顯微鏡分析方法仍是浮游植物群落結構研究中最為可靠的方法之一, 但是一些微微型浮游植物很難在顯微鏡下準確鑒定, PCR-DGGE技術能快速、準確地反映數(shù)量百分比在0.5%以上的浮游植物優(yōu)勢種的DNA指紋圖譜。

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