生防細(xì)菌K2-1對(duì)大菱鲆病原菌的抑制作用及其抗菌特性分析

方衛(wèi)東 , 唐 旭 劉源森 林 凌 黃仕新 徐長安

(1. 國家海洋局 第三海洋研究所 福建 廈門 361005； 2. 集美大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 福建 廈門 361005)

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmu), 是產(chǎn)于歐洲的一種冷水性海產(chǎn)鲆鰈類[1], 山東是中國大菱鲆的主要養(yǎng)殖區(qū), 居全國首位, 并帶動(dòng)了遼寧、河北、天津、江蘇等地的大菱鲆養(yǎng)殖的發(fā)展[2-3]。然而隨著養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大、水資源缺乏、長期使用抗生素造成耐藥性的產(chǎn)生, 養(yǎng)殖病害發(fā)生率逐年提升, 給養(yǎng)殖業(yè)帶了巨大的損失[4]。研究表明：生物防治技術(shù)是解決養(yǎng)殖病害的有效措施之一。蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)已被越來越多地研制成飼用微生態(tài)制劑, 其在促進(jìn)動(dòng)物營養(yǎng)的消化吸收、提高動(dòng)物的飼料轉(zhuǎn)化率和防病促生長等方面起到重要作用[5]。另外, 研究還表明蠟狀芽孢桿菌可以提高對(duì)蝦育苗的出苗率, 減少疾病的發(fā)生并提高產(chǎn)量[6]。本實(shí)驗(yàn)室篩選到一株蠟狀芽孢桿菌 K2-1, 其發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)有很強(qiáng)的抑制作用,本研究探討了蠟狀芽孢桿菌K2-1的發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大菱鲆養(yǎng)殖常見致病——菌副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、愛德華氏菌(Edwardsiella)、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的抑制效果,并考察分析蠟狀芽孢桿菌 K2-1 抗菌物質(zhì)的部分特性, 初步評(píng)估該菌株的使用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 菌株

K2-1是本實(shí)驗(yàn)室分離自福建省廈門市海滄港口污泥, 根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化特性和16S rDNA分析, 鑒定其為蠟狀芽孢桿菌。

1.2 測(cè)試菌和指示菌

測(cè)試菌為大菱鲆養(yǎng)殖常見致病菌, 包括副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌, 這些測(cè)試菌由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)從當(dāng)?shù)氐拇罅怫茵B(yǎng)殖場(chǎng)病魚中分離獲得, 保藏工作正在進(jìn)行中,實(shí)驗(yàn)室攻毒試驗(yàn)表明, 測(cè)試菌毒力較強(qiáng)； 指示菌為溶藻弧菌, 由福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g , pH 7.3, 水1 000 mL。

SLB培養(yǎng)基： 蛋白胨10 g, 酵母提取物5 g, NaCl 10 g, 瓊脂20 g, pH 7.3, 水1 000 mL。

1.4 儀器設(shè)備

常規(guī)玻璃器皿、電子天平、超凈工作臺(tái)、打孔器、移液槍、臺(tái)式搖床、高壓蒸汽滅菌鍋、酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱等。

1.5 抑菌效果檢測(cè)

采用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行測(cè)定[7]。通過測(cè)量圓形的透明帶(抑菌圈)直徑的大小來表示發(fā)酵上清抑菌活性的強(qiáng)弱。

1.5.1 抑菌板制作

選擇大菱鲆常見致病菌——副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌, 用接種環(huán)刮下菌體接種至裝有5 mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為 37 ℃, 轉(zhuǎn)速為 180 r/min的搖床中培養(yǎng)16 h后, 取1 mL的培養(yǎng)液至100 mL的45～50 ℃的SLB培養(yǎng)基中, 迅速搖勻, 倒板, 待凝固后, 每個(gè)抑菌板打6個(gè)孔。

1.5.2 發(fā)酵上清的制備方法

用接種環(huán)刮下K2-1菌體接種至裝有7.5 mL LB培養(yǎng)基的試管中, 放入溫度設(shè)置為 37 ℃, 轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中活化6 h后, 倒入150 mL的LB培養(yǎng)基中, 放入溫度設(shè)置為37 ℃, 轉(zhuǎn)速為180 r/min的搖床中發(fā)酵15 h, 取發(fā)酵液, 經(jīng)10 000 r/min, 6 min離心后, 再經(jīng)0.22 μm兩次過濾, 去除菌體得發(fā)酵上清。

1.5.3 抑菌效果檢測(cè)

每個(gè)抑菌板的3個(gè)孔加入50 μL的發(fā)酵上清, 另外3個(gè)孔加50 μL未接種的LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照,然后置于37 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 觀察、測(cè)量抑菌圈直徑, 并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.6 抗菌物質(zhì)的初步鑒定

將K2-1在上述LB培養(yǎng)基中發(fā)酵12h, 制得上清液, 上清液用飽和度為 60%的硫酸銨溶液沉淀,離心后得沉淀物和離心液, 對(duì)沉淀物進(jìn)行透析除鹽,所得透析液與離心液分別用上述瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)抑菌活性并比對(duì)抑菌能力, 初步檢測(cè)抗菌物質(zhì)是否含有蛋白(肽)類成分。

1.7 抗菌物質(zhì)部分特性分析

[8～13], 以福建師范大學(xué)教育部工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供的溶藻弧菌為指示菌, 考察不同的發(fā)酵時(shí)間、溫度、酸堿度(pH值)、紫外線、蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶 K、木瓜蛋白酶)對(duì)發(fā)酵上清抑菌活性的影響, 每個(gè)水平設(shè)定3個(gè)重復(fù)。

1.7.1 發(fā)酵時(shí)間對(duì)抑菌效果的影響

發(fā)酵時(shí)間設(shè)定 4、8、12、16、20、24、28 h , 每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取發(fā)酵上清, 按照1.5的方法檢測(cè)發(fā)酵液的抑菌效果, 并同時(shí)用比濁法測(cè)定K2-1菌液的OD600,繪制生長曲線。

1.7.2 發(fā)酵上清對(duì)溫度的耐受分析

發(fā)酵上清分別在溫度設(shè)定為： 40、50 、60 、70 、80 、90 ℃的水浴鍋中水浴加熱10 min, 按照1.5的方法檢測(cè)其抑菌活性。

1.7.3 發(fā)酵上清對(duì)pH值的耐受分析

發(fā)酵上清分別在 pH值為 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 處理發(fā)酵上清3 h, 然后調(diào)回原值, 并稀釋至同體積, 避免濃度的影響, 且以未用酸堿處理的發(fā)酵上清作為對(duì)照(pH值為7.3)。并按照1.5的方法檢測(cè)其抑菌活性。

1.7.4 發(fā)酵上清耐受紫外線照射分析

發(fā)酵上清分別在紫外線下照射10、20、40、60 min,且以未進(jìn)行紫外線照射的發(fā)酵上清為對(duì)照。并按照1.5的方法檢測(cè)其抑菌活性。

1.7.5 發(fā)酵上清對(duì)蛋白酶的敏感性分析

分別選取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4種酶質(zhì)量濃度均為1 g/L)在37 ℃水浴條件下與發(fā)酵上清進(jìn)行酶解反應(yīng)4 h后, 在70 ℃下水浴30 min,滅活各蛋白酶, 并按照1.5的方法檢測(cè)其抑菌活性。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS11.5 軟件進(jìn)行相關(guān)數(shù)據(jù)的處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蠟狀芽孢桿菌K2-1對(duì)大菱鲆常見致病菌的抑制效果

拮抗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明： 如表1及圖1～圖5所示, 蠟狀芽孢桿菌K2-1對(duì)大菱鲆養(yǎng)殖常見致病菌, 包括副溶血弧菌, 愛德華氏菌, 哈維氏弧菌, 嗜水氣單胞菌,溶藻弧菌均有較強(qiáng)的抑制作用, 其中對(duì)嗜水氣單胞菌的抑制作用最強(qiáng)。

2.2 抗菌物質(zhì)初步鑒定結(jié)果

發(fā)酵液經(jīng)離心及過濾去菌體、鹽析、透析后, 離心液和透析液以溶藻弧菌為指示菌, 在同一個(gè)培養(yǎng)板中進(jìn)行抑菌活性檢測(cè), 抑菌結(jié)果如圖6所示, 可以明顯看出, 透析液的抑菌圈最大, 且明顯大于離心液的抑菌圈, 原因是透析液濃縮了抗菌蛋白?；诹蛩徜@對(duì)蛋白質(zhì)的特異性沉淀性質(zhì), 可以判斷, 抗菌物質(zhì)含有蛋白(肽)類成分, 至于發(fā)酵上清中是否還含有其它非蛋白(肽)類的抗菌物質(zhì), 則還需進(jìn)一步進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析。

表1 蠟狀芽孢桿菌 K2-1發(fā)酵上清對(duì)大菱鲆常見致病菌的抑制效果Tab. 1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against selected pathogens of Scophthalmus maximus

圖1 K2-1發(fā)酵液對(duì)副溶血弧菌的抑菌效果Fig.1 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio parahaemolyticus

圖2 K2-1發(fā)酵液對(duì)愛德華氏菌的抑菌效果Fig.2 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Edwardsiella

圖3 K2-1發(fā)酵液對(duì)哈維氏弧菌的抑菌效果Fig.3 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio harveyi

圖4 K2-1發(fā)酵液對(duì)嗜水氣單胞菌的抑菌效果Fig.4 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Aeromonas hydrophila

圖5 K2-1發(fā)酵液對(duì)溶藻弧菌的抑菌效果Fig.5 Antibacterial activity of strain K2-1 supernatant against Vibrio alginolyticus

圖6 透析液和離心液的抑菌圈Fig. 6 Inhibition zone of dialysate and centrifugation.

2.3 抗菌物質(zhì)部分特性分析結(jié)果

2.3.1 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì) K2-1菌株抗菌物質(zhì)產(chǎn)量的影響

選用LB培養(yǎng)基, 在37 ℃, 180 r/min條件下發(fā)酵 4 h開始取樣, 以后每隔4 h取樣1次, 檢測(cè)發(fā)酵上清的抑菌活性和測(cè)定 K2-1的生物量, 結(jié)果如圖 7所示, 從圖中可以看出, 8 h出現(xiàn)抑菌活性, K2-1處于指數(shù)生長期, 發(fā)酵12 h抑菌活性達(dá)到最強(qiáng), K2-1進(jìn)入平臺(tái)期, 隨著發(fā)酵時(shí)間的延長, 抑菌活性逐漸減弱, 當(dāng)發(fā)酵時(shí)間到達(dá)24 h時(shí), K2-1進(jìn)入衰亡期, 發(fā)酵上清的抑菌活性也逐漸減弱, 表明K2-1發(fā)酵過程生物量與發(fā)酵上清抑菌活性存在正相關(guān)。

圖7 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)K2-1菌株抗菌活性及生物量的影響Fig. 7 Effect of fermentation time on the antibacterial activity and biomass of strain K 2-1

2.3.2 不同溫度處理對(duì)發(fā)酵上清中抗菌物質(zhì)活性的影響

選用LB培養(yǎng)基, 在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵 15 h, 所得發(fā)酵上清分別在溫度為40、50、60、70、80、90 ℃的水浴鍋中水浴加熱10 min后檢測(cè)抑菌活性, 結(jié)果如圖8所示, 在50 ℃保持較好的抑菌活性, 60 ℃時(shí)抑菌活性開始下降, 70 ℃時(shí)抑菌活性有明顯下降, 90 ℃時(shí)無抑菌活性, 結(jié)果表明抗菌物質(zhì)具有一定的耐熱性。

圖8 不同溫度處理對(duì)K2-1發(fā)酵上清抗菌活性的影響Fig.8 Effect of heat treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.3 pH值對(duì) K2-1發(fā)酵上清中抗菌物質(zhì)活性的影響

選用LB培養(yǎng)基, 在37 ℃, 180 r/min條件下發(fā)酵 15 h, 所得發(fā)酵上清用HCl、NaOH調(diào)整pH值分別為： 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0, 處理 3 h后檢測(cè)抑菌活性, 結(jié)果如圖9所示, pH對(duì)K2-1發(fā)酵上清抑菌效果略有影響, 在酸性條件下抑菌效果略差, 但抑菌效果保持在較好的水平(抑菌圈均達(dá)到19.50以上)； 在中性或弱堿性的條件下抑菌效果最好, 隨著堿性提高, 抑菌效果也隨著下降, 顯示發(fā)酵上清中的抗菌物質(zhì), 耐酸堿能力較強(qiáng)。

圖9 pH對(duì)K2-1發(fā)酵上清抗菌活性的影響Fig.9 Effect of pH on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.4 不同紫外線照射時(shí)間對(duì) K2-1發(fā)酵上清中抗菌物質(zhì)活性的影響

選用LB培養(yǎng)基, 在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵 15 h, 得發(fā)酵上清, 發(fā)酵上清在紫外線波長365 nm、距離10 cm下分別照射10、20、40、60 min后, 檢測(cè)抑菌活性, 結(jié)果如圖 10所示, 發(fā)酵上清中的抗菌物質(zhì)對(duì)紫外線不敏感, 不同照射時(shí)間對(duì)抑菌效果影響差異不明顯(P＞0.01), 照射后的發(fā)酵上清仍保持較好的抑菌效果。

圖10 不同紫外線照射時(shí)間對(duì)K2-1發(fā)酵上清的抗菌活性的影響Fig. 10 Effect of UV treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

2.3.5 不同蛋白酶對(duì) K2-1發(fā)酵上清中抗菌物質(zhì)活性的影響

選用LB培養(yǎng)基, 在37 ℃、180 r/min條件下發(fā)酵 15 h, 得發(fā)酵液, 分別選取胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K、木瓜蛋白酶(4種酶濃度均為1 g/L)在37 ℃水浴條件下與發(fā)酵上清進(jìn)行酶解反應(yīng)4 h后, 在70 ℃下水浴30 min滅活各蛋白酶, 取出檢測(cè)抑菌活性。結(jié)果如圖 11所示, 可以看出, 發(fā)酵上清中的抗菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶不敏感, 均保持較好的抑菌效果, 而對(duì)蛋白酶K敏感。

圖11 不同蛋白酶對(duì)K2-1發(fā)酵上清的抗菌活性的影響Fig. 11 Effect of enzymatic treatment on the antibacterial activity of strain K 2-1 supernatant

3 討論

目前食品安全備受關(guān)注, 作為一類重要的生防細(xì)菌, 芽孢桿菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用, 也取得了很好的效果, 如芽孢桿菌能較好地降解亞硝酸鹽[13]；巨大芽孢桿菌SZ-3對(duì)污染水體中的亞硝酸鹽具有較強(qiáng)的降解效果[14]。另外研究表明某些芽孢桿菌在拮抗水產(chǎn)病原菌方面也有良好的效果, 如海洋生境枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)LHB02發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)海水養(yǎng)殖常見致病菌弧菌有很強(qiáng)拮抗能力[10]； 短小芽孢桿菌 X93菌株, 其胞外產(chǎn)物對(duì)病原弧菌、遲緩愛德華菌和嗜水氣單胞菌等水產(chǎn)上常見的主要致病菌具有很好的抑制效果[8]。蠟狀芽孢桿菌在植物病害防治方面有明顯的效果, 如蠟狀芽胞桿菌N5對(duì)金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、青枯假單胞桿菌(Pseudomonas solanacearum)等多種細(xì)菌和黃綠青霉(Penicillium)、炭疽菌(Colletotrichum)等多種真菌均表現(xiàn)出較好的抑菌活性, 抑菌譜更廣[15]。本實(shí)驗(yàn)室篩選到的蠟狀芽孢桿菌 K2-1 對(duì)大菱鲆養(yǎng)殖中常見的致病菌包括副溶血弧菌、愛德華氏菌、哈維氏弧菌、嗜水氣單胞菌、溶藻弧菌都有很強(qiáng)的抑制作用, 顯示出較廣的抑菌譜。

抗菌活性物質(zhì)的產(chǎn)生除了與菌體本身的特性外,還受到培養(yǎng)基、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度、pH值、接種量和裝瓶量等因素的影響。其中發(fā)酵時(shí)間的控制至關(guān)重要, 發(fā)酵時(shí)間過短, 抗菌活性物質(zhì)產(chǎn)量少, 發(fā)酵時(shí)間過長, 抗菌活性物質(zhì)也隨之降低。然而發(fā)酵時(shí)間也是影響發(fā)酵成本的主要因素之一, 當(dāng)抗菌活性物質(zhì)達(dá)到高峰時(shí)的發(fā)酵時(shí)間越短, 則成本越低。許多研究表明, 一般發(fā)酵時(shí)間在32 h以上抗菌活性物質(zhì)才能達(dá)到高峰, 如健康刺參腸道的益生菌—枯草芽孢桿菌(菌種保藏號(hào)為 CCTCC M2010316), 發(fā)酵時(shí)間32 h抑菌效果最佳[16]； 交替單胞菌 YTW-10發(fā)酵時(shí)間36 h抑菌效果最佳[17]； 枯草芽孢桿菌B2發(fā)酵時(shí)間36 h抑菌效果最佳[18]； 枯草芽孢桿菌G發(fā)酵38 h抑菌效果最佳[19]； 拮抗鏈霉菌No.2發(fā)酵時(shí)間96 h抑菌效果最佳[20]。本實(shí)驗(yàn)室所分離的蠟狀芽孢桿菌K2-1發(fā)酵時(shí)間 12 h, 抗菌活性物質(zhì)達(dá)到高峰, 因此可以大幅度的降低發(fā)酵成本, 有利于該菌的開發(fā)利用。

蠟狀芽孢桿菌 K2-1發(fā)酵上清在 40～70 ℃下保持較好的抑菌效果, 對(duì)酸堿度有較強(qiáng)的耐受性, 以及對(duì)多數(shù)蛋白酶不敏感, 特別是對(duì)胃蛋白酶不敏感,提高了該菌株抗菌物質(zhì)應(yīng)用的可行性, 如制備成生物抗生素, 利用其抵抗胃蛋白酶和胃酸的特性, 給藥進(jìn)入動(dòng)物消化道, 用于動(dòng)物腸炎的防治。

K2-1所具有的對(duì)大菱鲆致病菌較強(qiáng)的抑制作用,以及抗菌活性物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)時(shí)間較短, 耐受環(huán)境條件較強(qiáng), 賦予了該菌株具有較好的開發(fā)應(yīng)用前景,下一步, 本實(shí)驗(yàn)室將開展K2-1的發(fā)酵條件優(yōu)化及活性產(chǎn)物的分離提取制備研究, 并開發(fā)基于該菌株的微生物殺菌劑及生物抗生素。

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