丁苯酞氯化鈉注射液后處理對局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬CA1區(qū)凋亡相關(guān)因子表達的影響

邱振方，鄧春穎，李世英，張晉霞，賀永貴，余 紅，劉 斌

0 引 言

丁苯酞氯化鈉注射液治療缺血性腦血管病是近年醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點。藥物后處理指在缺血和再灌注之間對局灶性腦缺血進行處理，可更好地模擬人類疾病的發(fā)展規(guī)律。國內(nèi)外研究證實丁苯酞氯化鈉注射液后處理可通過多種機制產(chǎn)生神經(jīng)保護作用［1-2］，如抗細胞凋亡、保護線粒體、促進微循環(huán)等，但其抗細胞凋亡作用的具體機制尚未闡明。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-inhibitor of apoptosis，XIAP)、Bcl-2/腺病毒E1B19kDa相互作用蛋白3(Bcl-2/adenovirusE1B19kDa interacting protein 3，BNIP3)是近年來發(fā)現(xiàn)的2種凋亡相關(guān)蛋白，丁苯酞對其作用的研究不多［3-4］。因此本研究旨在研究丁苯酞氯化鈉注射液后后處理對大鼠大腦中動脈IR模型大鼠的神經(jīng)行為學(xué)、梗死體積及海馬CA1區(qū)細胞凋亡情況及凋亡相關(guān)因子XIAP、BNIP3的蛋白表達、基因表達的影響，并探討丁苯酞對局灶性腦IR大鼠的神經(jīng)保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 65只清潔級雄性SD大鼠，體重200～250g，鼠齡8周。由華北理工大學(xué)實驗動物中心提供，動物許可證編號:SCXK(軍)2009-003，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，室溫(23±2)℃，相對濕度55%。術(shù)前12 h禁食、禁水。將大鼠隨機分為假手術(shù)組(n=13)、IR 組(n=13)、丁苯酞組(n=39);丁苯酞組按照劑量不同分為低劑量亞組(2 mg/kg)，中劑量亞組(4 mg/kg)和高劑量亞組(6 mg/kg)，每組13只。其中每組5只大鼠用于氯化三苯四氮唑磷酸鹽染色，5只大鼠用于TUNEL染色和免疫組化檢查，3只大鼠用于RT-PCR檢查。

1.2 動物模型制作 每只大鼠采用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射方法麻醉。IR組:參照Zealonga線栓法加以改良制備大鼠大腦中動脈IR模型［4］，不分離頸內(nèi)動脈，暴露右側(cè)頸總動脈后，結(jié)扎頸外動脈遠端、夾閉頸內(nèi)動脈近心端與頸總動脈遠心端，直接將圓頭栓線插入頸總動脈，向上經(jīng)頸內(nèi)動脈遇到輕微阻力時停止進線，缺血2h時立即拔回栓線，形成再灌注，24 h后處死大鼠。低、中、高劑量亞組:在大鼠缺血2h后，拔出栓線的同時給予腹腔內(nèi)分別注射2、4、6mg/kg丁苯酞氯化鈉注射液(石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司)，余步驟同IR組。假手術(shù)組:栓線插入深度＜10mm，余步驟同IR組。各組大鼠均于再灌注24h時間點處死，迅速斷頭取腦，分別制作石蠟切片標(biāo)本與新鮮腦組織標(biāo)本。

1.3 各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)比較 參照ZeaLonga評分法，在大鼠清醒后進行神經(jīng)行為學(xué)評估。評分在0～3分者納入實驗［5］。

1.4 腦梗死體積的測定 每組隨機選取5只大鼠腦組織，冰凍后按2 mm厚度冠狀切片，將切片放入2%氯化三苯四氮唑磷酸鹽緩沖液中，37℃避光孵育30 min。正常腦組織染成紅色，梗死灶為白色。采用Motic Image Advance 3.0多媒體彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行處理，計算梗死灶體積占缺血側(cè)大腦半球總體積的百分比。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡 常規(guī)方法制作石蠟切片，切片脫蠟至水化;3%H2O2封閉RT 10 min之后用PBS液清洗;復(fù)合消化液37℃孵育20min之后用PBS液清洗;TUNEL混合液(1∶9)37℃孵育1 h;POD轉(zhuǎn)化劑(抗FITC-HRP)37℃ 40min之后PBS液清洗;DAB顯色;蘇木精復(fù)染;脫水、透明封固。圖像分析:每張切片在高倍顯微鏡(×400)下觀察海馬CA1區(qū)大致相同部位的5個互不重疊視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

1.6 免疫組化染色檢測蛋白表達 常規(guī)方法制作石蠟切片，預(yù)熱20 min后脫臘至水化，用3%H2O2封閉非特異性抗原10 min，采用高壓修復(fù)10 min，滴加適當(dāng)比例稀釋的一抗(濃度:XIAP 1∶50，BNIP3 1∶200)4℃，第2天用二抗37℃孵育，滴加DAB溶液顯色，蘇木精復(fù)染細胞核，切片經(jīng)乙醇脫水干燥，中性樹膠封固(陰性對照用PBS代替一抗，其余步驟相同)。圖像分析:每張切片在高倍顯微鏡(×400)下分別觀察海馬CA1區(qū)大致相同部位的5個互不重疊視野，計數(shù)陽性細胞數(shù)量。

1.7 RT-PCR法檢測mRNA表達 取大鼠海馬CA1區(qū)腦組織，按Trizol法，提取總RNA;XIAP:上游引物 GGCGGTTAGTTAGGACTGG;下游引物GGACTGCTGCTTGGGAAGT;BNIP3:上游引物GGCGGTTAGTTAGGACTGG，下游引物GGACTGCTGCTTGGGAAGT;β-actin:上游引物 ACGGTCAGGTCATCACTATCG，下游引物 GGCATAGAGGTCTTTTACGGATG;擴增條件:采用RT-PCR一步法擴增程序:擴增條件為:42℃ 5min 95℃ 5s，95℃ 10s 60℃30 s，設(shè)置為 40 cycles，結(jié)果分析:比較 CT 值，以2-^^ct法計算XIAP、BNIP3的相對表達量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用 SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較視方差齊性檢驗，當(dāng)方差齊時，選擇 LSD檢驗;當(dāng)方差不齊時，選擇 Tamhane's T3檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分 假手術(shù)組大鼠均活動自如，神經(jīng)功能缺損評分均為0分;丁苯酞低劑量亞組評分［(2.59±0.18)分］、中劑量亞組評分［(2.42±0.27)分］和高劑量亞組評分［(2.21±0.69)分］均小于 IR 組［(2.73 ±0.20)分］，且各亞組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 大鼠腦梗死體積測定 假手術(shù)組腦組織未見梗死灶，呈現(xiàn)均勻一致的紅色;IR組梗死灶體積百分比［(37.03±0.85)%］最為明顯，呈現(xiàn)中心區(qū)為白色，周圍為紅白交界區(qū)。丁苯酞低劑量亞組腦梗死體積為(33.21± 0.61)%，中 劑 量 亞 組 為 (30.64 ±0.74)%，高劑量亞組為(17.58 ±0.83)%，3 亞組間腦梗死體積差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)TUNEL染色結(jié)果 TUNEL染色后，凋亡細胞胞核呈紫黑色著色，胞核固縮，顆粒深染，呈橢圓形、圓形及不規(guī)則形，為散在性及彌散性分布。假手術(shù)組可見少量凋亡細胞表達［(4.78±0.57)個/Hp］。海馬 CA1區(qū)的凋亡細胞數(shù):丁苯酞低劑量亞組［(67.48±0.43)個/Hp］、中劑量亞組［(63.43 ±0.74)個/Hp］、高劑量亞組 ［(58.01± 0.69)個/Hp］均 少 于 IR 組［(78.07 ±0.38)個/Hp］，且低、中、高劑量亞組凋亡細胞數(shù)逐漸減少，各亞組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見圖1。

圖1 丁苯酞各劑量亞組海馬CA1區(qū)凋亡細胞表達(TUNEL×400)Figure 1 Apoptotic cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(TUNEL×400)

2.4 各組大鼠缺血側(cè)海馬 CA1區(qū) XIAP、BNIP3陽性細胞表達結(jié)果 免疫組化染色鏡下細胞漿呈棕黃色者為XIAP陽性細胞，鏡下細胞漿和細胞核均呈棕黃色者為BNIP3陽性細胞。與假手術(shù)組XIAP、BNIP3陽性細胞表達比較，IR組明顯增多(P＜0.05);與IR組XIAP陽性細胞數(shù)比較，丁苯酞各亞組明顯增加(P＜0.05)，而BNIP3陽性細胞數(shù)明顯減少(P＜0.05);且丁苯酞低、中、高劑量亞組XIAP陽性細胞數(shù)表達逐漸增多，BNIP3陽性細胞數(shù)表達逐漸減少，不同亞組之間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表1，圖2、圖3。

表1 各組大鼠 XIAP、BNIP3陽性細胞數(shù)比較(±s，個/HP)Table 1 Expression of XIAP-and BNIP3-positive cells in different groups of rats(±s，A/HP)

表1 各組大鼠 XIAP、BNIP3陽性細胞數(shù)比較(±s，個/HP)Table 1 Expression of XIAP-and BNIP3-positive cells in different groups of rats(±s，A/HP)

與假手術(shù)組相比，*P＜0.05;與IR組相比，#P＜0.05;與低劑量亞組比較，△P ＜0.05;與中劑量亞組比較，▲P ＜0.05

組別 n XIAP陽性細胞數(shù) BNIP3陽性細胞數(shù)假手術(shù)組5 3.07 ±1.43 5.78 ±0.44 IR 組 5 22.31 ±0.94* 60.13 ±2.59*丁苯酞組低劑量亞組 5 28.70 ±1.18# 52.07 ±1.02#中劑量亞組 5 32.79±0.88#△ 40.30±2.00#△高劑量亞組 5 37.01±1.24#△▲ 31.04±0.43#△▲

圖2 丁苯酞各劑量亞組海馬CA1區(qū)XIAP陽性細胞表達(IHC×400)Figure 2 Expression of XIAP-positive cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(IHC×400)

圖3 丁苯酞各劑量亞組海馬CA1區(qū)BNIP3陽性細胞表達(IHC×400)Figure 3 Expression of BNIP3-positive cells in the hippocampus CA1 neurons of focal cerebral ischemia reperfusion rats treated with different doses of dl-3N-butylphthalide(IHC×400)

2.5 大鼠缺血側(cè)海馬 CA1區(qū)大鼠 XIAP、BNIP3 mRNA表達比較 IR組XIAP、BNIP3 mRNA表達量較假手術(shù)組增多(P＜0.05);與IR組比較，丁苯酞各亞組XIAP mRNA表達量增加、BNIP3 mRNA表達量減少(P＜0.05);且低、中、高劑量亞組 XIAP mRNA表達隨劑量濃度增加而逐漸增多，BNIP3 mRNA表達逐漸減少，各亞組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)XIAP、BNIP3 mRNA相對濃度(±s，個/HP)Table 2 Expression of XIAP and BNIP3 mRNA in different groups of rats(±s，A/HP)

表2 各組大鼠缺血側(cè)海馬CA1區(qū)XIAP、BNIP3 mRNA相對濃度(±s，個/HP)Table 2 Expression of XIAP and BNIP3 mRNA in different groups of rats(±s，A/HP)

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05;與IR組比較，#P＜0.05;與低劑量亞組比較，△P ＜0.05;與中劑量亞組比較，▲P ＜0.05

組別 n XIAP mRNA BNIP3 mRNA假手術(shù)組3 1.00 ±0.00 1.00 ±0.00 IR 組 3 1.76 ±0.04* 3.59 ±0.14*丁苯酞組低劑量亞組 3 2.45 ±0.05# 2.83 ±0.12#中劑量亞組 3 5.03±0.16#△ 2.03±0.17#△高劑量亞組 3 5.40±0.20#△▲ 1.67±0.29#△▲

3 討 論

丁苯酞氯化鈉注射液是我國自主研發(fā)的治療急性缺血性腦血管病的國家一類新藥［6］。臨床及動物實驗研究均表明，丁苯酞可通過影響缺血瀑布的改變，阻斷缺血區(qū)域神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)功能損傷的程度、減小梗死面積及記憶障礙［7］。既往的研究大部分著重于觀察丁苯酞氯化鈉注射液預(yù)處理的干預(yù)效應(yīng)［8］，但預(yù)處理對于臨床的應(yīng)用空間狹小，藥物依從性差。因此本研究選用丁苯酞氯化鈉注射液后處理的方式干預(yù)IR過程。

在腦梗死病理生理發(fā)展過程中，細胞凋亡占有重要地位。XIAP既能抑制凋亡發(fā)生又能抑制凋亡進展，主要通過 Caspase經(jīng)典途徑發(fā)揮作用［9］。BNIP3是目前發(fā)現(xiàn)唯一通過多種途徑引起缺血性神經(jīng)細胞死亡的因子［10］，張明海等［11］發(fā)現(xiàn)腦缺血可誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元BNIP3上調(diào)。本研究結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，IR組海馬CA1區(qū)XIAP、BNIP3陽性細胞的表達均增多(P＜0.05)，說明人體正常的免疫應(yīng)答中神經(jīng)細胞僅表達少量XIAP、BNIP3，這與Asa等研究一致［12-14］，而腦組織發(fā)生IR后，一系列的病理生理改變會導(dǎo)致XIAP、BNIP3蛋白表達上調(diào)。XIAP抑制細胞凋亡、參與腦缺血耐受的途徑主要有:①XIAP通過抑制Caspase3和Caspase7等的活性阻止腦神經(jīng)功能的進一步惡化、改善腦神經(jīng)功能;②當(dāng)存在外界刺激時，如炎癥因子(TNF-α、IL-1β、LPS等)損傷內(nèi)皮細胞，XIAP的表達能誘導(dǎo)NF-kB的活化，通過NF-kB途徑促進XIAP基因表達，促進IAPs等的產(chǎn)生，從而抑制Caspase激活引起的細胞凋亡［15］;③XIAP的 RING鋅指結(jié)構(gòu)可使Caspase3、7和9發(fā)生降解，從而降低凋亡的敏感性;④體外實驗證實，XIAP通過 TAK1和TAB1信號(屬MAPKKK成員)介導(dǎo)激活JNK1，從而抑制細胞凋亡。隨著丁苯酞劑量的增加，XIAP陽性細胞表達逐漸增多，BNIP3陽性細胞表達逐漸減少，各亞組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。提示丁苯酞氯化鈉注射液能夠通過上調(diào)抗凋亡蛋白XIAP的表達，下調(diào)促凋亡蛋白BNIP3的表達參與凋亡的發(fā)生發(fā)展。劉新建等［16］研究提示XIAP在再灌注的早期升高可能為機體應(yīng)激時所產(chǎn)生的一種自我保護反應(yīng)，是一種內(nèi)源性保護作用，但短暫升高后又下降，同時很快受到表達上調(diào)的Smac/DIABLO的抑制。本研究RT-PCR結(jié)果顯示:與假手術(shù)組比較，IR組海馬CA1區(qū)XIAP、BNIP3 mRNA的表達呈現(xiàn)出增多趨勢，且差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，其增多的機制可能是發(fā)生急性IR時XIAP、BNIP3 mRNA表達增多，并在短時間內(nèi)形成大量XIAP、BNIP3 mRNA，進而促進了相應(yīng)蛋白的產(chǎn)生。缺血缺氧狀態(tài)下低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducing factor-1α，HIF-1α)表達明顯增多，HIF-1可誘導(dǎo)促凋亡蛋白BNIP3高度聚集。研究表明HIF-1α是誘導(dǎo)BNIP3表達的最強刺激因子［17］。以上趨勢均表明在發(fā)生IR后，丁苯酞不僅影響XIAP、BNIP3蛋白水平，而且還通過促進抗凋亡基因XIAP、抑制促凋亡基因BNIP3的轉(zhuǎn)錄參與IR大鼠的凋亡進程。

IR是一個復(fù)雜的過程，關(guān)系到多種基因的調(diào)控、轉(zhuǎn)錄因子的表達和眾多蛋白的產(chǎn)生［18-19］。目前研究認為XIAP、BNIP3的異常表達與IR的發(fā)生、進展和預(yù)后密切相關(guān)。本研究表明丁苯酞氯化鈉注射液可明顯調(diào)節(jié)其活性，這對于維持機體動態(tài)平衡與穩(wěn)態(tài)維持具有積極意義。

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