龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180肉瘤的抑制作用研究

郭秋蘭

（河南漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校藥學(xué)系，漯河462002）

龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180肉瘤的抑制作用研究

郭秋蘭

（河南漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校藥學(xué)系，漯河462002）

目的研究龍眼外果皮粗黃酮提取物對荷瘤小鼠的抗腫瘤作用。方法以S180荷瘤小鼠為模型，觀察龍眼外果皮粗黃酮提取物（100、200、300 mg·kg-1）組和龍眼外果皮粗黃酮提取物+CTX（20 mg·kg-1）組的抑瘤率，計算龍眼外果皮粗黃酮提取物+CTX組小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，并采用ELISA法檢測龍眼外果皮粗黃酮提取物組小鼠血清TNF-α的含量。結(jié)果不同劑量的龍眼外果皮粗黃酮提取物均可抑制S180肉瘤生長，抑瘤率分別為28.24%、44.91%、60.65%，且其對小鼠血清TNF-α含量影響不明顯；CTX組抑瘤率為47.69%，龍眼外果皮粗黃酮提取物低、中、高劑量+CTX組抑瘤率分別為53.7%、65.74%、70.37%，龍眼外果皮粗黃酮提取物中、高劑量+CTX組與CTX組抑瘤率比較差異顯著（P＜0.05），且龍眼外果皮粗黃酮提取物+CTX組，與CTX組比較，可不同程度地升高荷瘤小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)（P＜0.05）。結(jié)論龍眼外果皮粗黃酮提取物可抑制S180肉瘤生長，具有抗腫瘤作用，且對化療藥物CTX具有增效減毒作用。

龍眼外果皮粗黃酮提取物；S180荷瘤小鼠；增效減毒；實驗研究

無患子科龍眼的果實俗名桂圓，為我國著名的亞熱帶水果。傳統(tǒng)中醫(yī)學(xué)認為，龍眼肉安神、益心脾、補氣血可用于治療驚悸、怔忡、失眠、健忘、虛勞羸弱［1-3］，龍眼外果皮（龍眼殼）味甘、性溫、無毒，其散邪祛風(fēng)、聰耳明目，可治心虛頭暈，研細治湯火傷亦佳，已確定龍眼外果皮中含有糖類、核苷類、萜類、香豆素、多酚等［4-6］，而目前對龍眼外果皮中總黃酮的提取研究鮮有報道。本研究從龍眼外果皮中提取了粗黃酮，測定了含量，并對其體內(nèi)抗腫瘤作用方面進行了研究。

1 資料與方法

1.1 藥品與試劑龍眼采自福建泉州，取外果皮洗凈烘干粉碎；氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、乙醇均為分析純；環(huán)磷酰胺注射液（江蘇恒瑞醫(yī)藥有限公司）；蘆丁標準品（中國藥品生物制品檢定所）。

1.2 儀器旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器公司）；101C-2B電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海市實驗儀器總廠）；AL104電子天平（上海有限公司）；恒溫水浴鍋（陜西太康生物科技有限公司）；高速萬能粉碎機（黃驊卸甲綜合電器廠），冷凍干燥儀（德國MARTIN CHRIST公司）。

1.3 動物及瘤株昆明種小鼠由河南省醫(yī)學(xué)實驗動物中心提供，體質(zhì)量（26±3）g，均為雄鼠；S180肉瘤瘤株購自河南省醫(yī)科所。

1.4 龍眼外果皮粗黃酮提取物的制備將龍眼外果皮洗凈烘干后粉碎，過60目篩，稱取約100 g，加8倍量95%乙醇，浸泡過夜，60℃加熱回流提取，每次4 h，重復(fù)提取3次，合并3次提取液抽濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，冷凍干燥，即得龍眼外果皮粗黃酮提取物。

1.5 龍眼外果皮粗黃酮提取物定性鑒別［7］1）濃氨水反應(yīng)：取提取物乙醇溶液1滴點在濾紙上，將濾紙放在氨水上方熏30 s，立即在紫外燈下觀察。2）三氯化鋁反應(yīng)：取提取物乙醇溶液1滴點在濾紙上，滴加1滴質(zhì)量濃度為1%的三氯化鋁乙醇溶液，吹干，分別在可見光及紫外光下觀察顏色變化。3）鹽酸-鎂粉反應(yīng)：取提取物乙醇溶液1 mL于試管中，加入少許鎂粉，再加入2滴濃鹽酸，進行黃酮類化合物的顯色反應(yīng)。

1.6 龍眼外果皮提取物粗黃酮含量的測定采用聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法［8］，以蘆丁標準品制作標準曲線，得線性回歸方程A=1.8429 C-0.0004，C為質(zhì)量濃度（mg· mL-1），A為510 nm吸光度值，線性范圍為0～0.5 mg，相關(guān)系數(shù)R2為0.9999。

1.7 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180肉瘤生長抑制作用昆明種小鼠80只，按0.2 mL·只-1在小鼠右肢腋部皮下接種濃度為1×107個·mL-1的S180細胞懸液，制成實體瘤模型［9］。接種后隨機分為8組，每組10只。模型組給生理鹽水；CTX組僅第一天腹腔注射CTX 20 mg· kg-1；龍眼外果皮粗黃酮提取物低、中、高劑量組分別給提取物100、200、300 mg·kg-1，灌胃，1·d-1，連續(xù)14 d；CTX+龍眼外果皮粗黃酮提取物低、中、高劑量組第一天腹腔注射CTX 20 mg·kg-1然后分別給提取物100、200、300 mg·kg-1，灌胃，1·d-1，連續(xù)14 d。14 d后頸椎脫臼處死荷瘤小鼠，稱體重，計算抑瘤率。抑瘤率（%）=（模型組瘤重-給藥組瘤重）/模型組瘤重×100%。

1.8 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響觀察荷瘤小鼠巨噬細胞吞噬功能的影響［10］，按上述方法觀察14 d后，將模型組、CTX組、CTX+龍眼外果皮粗黃酮提取物組小鼠腹腔注射體積分數(shù)為20%的新鮮雞紅細胞1 mL，30 min后處死小鼠，腹腔注入生理鹽水2 mL，用手擠壓腹部兩側(cè)，使生理鹽水與腹腔液充分混勻。吸出腹腔洗液1 mL，滴于載玻片上，移至37℃溫箱中孵育30 min，然后用生理鹽水漂洗，晾干。以甲醇、丙酮（體積比為1∶1）的混合液固定，40 mL·L-1Giensa-磷酸鹽緩沖液染色3 min，再用蒸餾水漂洗晾干。油鏡下數(shù)200個巨噬細胞，計算吞噬率和吞噬指數(shù)。吞噬百分率=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞（200個），吞噬指數(shù)=被吞噬的雞紅細胞數(shù)/計數(shù)的巨噬細胞數(shù)（200個）。處死動物取胸腺、脾臟稱重，按照下列公式分別計算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)：胸腺指數(shù)=胸腺重/體重，脾臟指數(shù)=脾臟重/體重［4］

1.9 ELISA法檢測荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白的表達按上述方法觀察14 d后，將模型組、CTX組、龍眼外果皮粗黃酮提取物組小鼠眼眶采血，0.5～1.0 mL，收集血液，于4℃，3 000 r/min，離心10 min取上清。按照小鼠TNF-αELISA試劑盒使用說明書進行操作，測定荷瘤鼠血清中TNF-α蛋白含量。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理SPSS13.0統(tǒng)計分析軟件分析，計量資料結(jié)果以（x±s）表示，行t檢驗及方差分析，P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 龍眼外果皮粗黃酮提取物定性檢驗結(jié)果1）濃氨水反應(yīng)：在紫外燈下觀察，濾紙上呈現(xiàn)出極明顯的灰褐色斑點，表明含有黃酮類化合物。2）三氧化鋁反應(yīng)：在可見光下濾紙上呈現(xiàn)出灰黃色斑點，在紫外光下濾紙上呈現(xiàn)出黃褐色熒光斑點，表明含有黃酮類化合物。3）鹽酸-鎂粉反應(yīng)：在泡沫處呈紫紅色，表明含有黃酮類化合物。

2.2 龍眼外果皮提取物粗黃酮含量經(jīng)聚酰胺吸附-硝酸鋁顯色法測定龍眼外果皮提取物粗黃酮含量為61.98%。

2.3 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180肉瘤的生長抑制作用龍眼外果皮粗黃酮提取物各組均可抑制S180肉瘤的生長，其低、中、高劑量組抑瘤率分別為28.24%、44.91%、60.65%，并體現(xiàn)一定的量效關(guān)系，與模型組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180肉瘤的抑制作用（x±s）

2.4 龍眼外果皮粗黃酮提取物提高CTX抑制S180肉瘤的作用表1顯示，龍眼外果皮粗黃酮提取物能提高CTX抑瘤效果，龍眼外果皮粗黃酮提取物（高）+CTX組、龍眼外果皮粗黃酮提取物（中）+CTX組、龍眼外果皮粗黃酮提取物（低）+CTX組抑瘤率分別為53.7%、65.74%、70.37%，高于CTX組47.69%，其中龍眼外果皮粗黃酮提取物（高）+CTX組、龍眼外果皮粗黃酮提取物（中）+CTX組抑瘤率和CTX組比較差異顯著（P＜0.05）。

2.5 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠免疫功能的影響荷瘤小鼠在注射CTX后胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均降低，與模型組比較差異顯著（P＜0.05），而合用了龍眼外果皮粗黃酮提取物后胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、巨噬細胞的吞噬率和吞噬指數(shù)均較CTX組增高，差異顯著（P＜0.05），其見表2。

表2 龍眼外果皮粗黃酮提取物對荷瘤小鼠免疫功能的影響（x±s）

2.6 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響與模型組比較，各組小鼠血清TNF-α水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表3。

表3 龍眼外果皮粗黃酮提取物對S180荷瘤小鼠血清中TNF-α含量的影響（x±s，n=10）

3 討論

黃酮類化合物是一大類天然產(chǎn)物，廣泛存在于植物界，是許多中草藥的有效成分，天然來源的生物黃酮分子量小，能被人體迅速吸收，黃酮類化合物具有抗氧化、抗衰老、抗輻射、抗腫瘤、抗炎鎮(zhèn)痛、免疫調(diào)節(jié)、抑菌抗病毒、抗心腦血管疾病、降血糖、治療骨質(zhì)疏松等作用［11-15］。本實驗從龍眼外果皮中提取了粗黃酮，以荷瘤小鼠為模型，對龍眼外果皮粗黃酮提取物進行了抗腫瘤作用體內(nèi)實驗研究，實驗結(jié)果顯示龍眼外果皮粗黃酮提取物低、中、高劑量組可明顯抑制S180腫瘤細胞的生長，抑瘤率分別為28.24%、44.91%、60.65%；實驗結(jié)果還顯示龍眼外果皮粗黃酮提取和CTX合用，可提高CTX療效，其中龍眼外果皮粗黃酮提取物高劑量+CTX組比單用CTX組的抑瘤率提高了22.68個百分點，并且龍眼外果皮粗黃酮提取物可增強小鼠機體免疫力，能夠?qū)够熕幬顲TX所致的免疫器官萎縮，免疫力的下降等不良反應(yīng)即降低CTX毒性。

TNF-α抗腫瘤機制包括在體外對惡性腫瘤具有直接溶解及抗增殖作用，在體內(nèi)引起腫瘤壞死；對毛細血管內(nèi)皮細胞有直接的細胞毒作用，可造成腫瘤組織的局部血流阻斷而發(fā)生出血、壞死；能增強炎癥部位單核巨嗜細胞系統(tǒng)活性，增強NK細胞的細胞毒作用［16］。本實驗結(jié)果表明龍眼外果皮粗黃酮提取物對荷瘤小鼠血清TNF-α的含量影響不明顯，說明龍眼外果皮粗黃酮提取物可能通過其他機制發(fā)揮抗腫瘤作用，其機制還有待于進一步研究。

由此可見龍眼外果皮粗黃酮提取物是一種具有顯著的抗腫瘤作用和增效減毒作用的天然藥物。但本實驗僅對龍眼外果皮粗黃酮提取物抗腫瘤作用進行了初步研究，其具體抗腫瘤機制尚未明確，因此尚需要對龍眼外果皮粗黃酮提取物抗腫瘤作用機制進行深入的研究。

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Research on Inhibition of S180 Sarcoma by Flavonoids Crude Extract from Exocarp of Longan

GUOQiulan
（Department of Pharmacy，LuoheMedicalCollege，HenanProvince，Luohe462002，China）

Objective To investigate the antitumor effects of flavonoids crude extract from exocarp of Longan on S180-bearing mice. Methods S180-bearing mice were given coarse flavones extract from exocarp of Longan and the tumor inhibitory rates of mice were detected in coarse flavones extract（100，200，300 mg·kg-1）groups and coarse flavones extract combined with CTX（20 mg·kg-1）groups.The thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were calculated in coarse flavones extract combined with CTX proups.ELISA method was used to detect the levels of serum TNF-α in coarse flavones extract groups.Results Coarse flavones extract from exocarp of Longan in different dose inhibited the growth of S180 sarcoma in mice and the tumor inhibitory rates were 28.24%，44.91%and 60.65%，respectively.However，the levels of serum TNF-α of mice didn't change.The tumor inhibitory rates of coarse flavones extract combined with CTX were 53.7%，65.74%and 70.37%，which were higher than those of CTX administration alone（47.69%）.Compared with those in CTX group，the thymus index，spleen index，macrophage phagocytic rate and phagocytic index were significantly elevated in all coarse flavones extract combined with CTX groups（P＜0.05）.Conclusion The flavonoids crude extract from exocarp of Longan has anti-tumor effect and can inhibit the growth of S180 tumor and has synergistic attenuation effect of CTX.

flavonoids crude extract from exocarp of Longan；S180-bearing mice；synergistic attenuation effect；experimental research

10.3969/j.issn.1672-2779.2015.16.070

1672-2779（2015）-16-0143-03

：張文娟本文校對：張文娟

2015-06-26）