海帶多糖對(duì)黃嘌呤氧化酶的抑制作用及對(duì)小鼠高尿酸血癥的調(diào)節(jié)*

焉翠蔚，李 晶，姜 柳，田友昊，常 寶

（中國(guó)海洋大學(xué)1.海洋生命學(xué)院；2.食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003）

近年來(lái)，中國(guó)高尿酸血癥患病率明顯上升，患者的發(fā)病年齡提前，呈年輕化趨勢(shì)。高尿酸血癥是一種因體內(nèi)嘌呤代謝紊亂引起的代謝性疾病，其發(fā)病原因主要是由于機(jī)體內(nèi)尿酸生成過(guò)多，排泄減少，或者二者同時(shí)作用［1］。高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化特征，據(jù)統(tǒng)計(jì)，大約有5%～12%的高尿酸血癥最終會(huì)發(fā)展成為痛風(fēng)［2］。持續(xù)性的高尿酸血癥會(huì)引起高血壓、高血脂、心血管疾病、慢性腎病等并發(fā)癥的發(fā)生［3－5］。

目前用于高尿酸血癥臨床治療的藥物主要有2類：（1）降尿酸藥物，代表藥物為別嘌呤醇，主要通過(guò)抑制嘌呤代謝關(guān)鍵酶黃嘌呤氧化酶（XOD）的活性，降低體內(nèi)尿酸的含量；（2）促尿酸排泄藥物，此類藥物主要有丙磺舒、苯磺唑酮、溴苯馬隆，能夠幫助腎臟排出體內(nèi)多余的尿酸［6］。別嘌呤醇是XOD的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，一直被作為一線藥物用于臨床高尿酸血癥和痛風(fēng)的治療。在臨床上，別嘌呤醇存在一些嚴(yán)重的毒副作用，在一定程度上限制了其安全使用。目前，利用化學(xué)合成與微生物發(fā)酵的方法得到的XOD抑制劑雖然在體外對(duì)XOD具有良好的抑制作用，但都未能成功應(yīng)用于高尿酸血癥的臨床治療。因此，從天然生物材料中尋找新型無(wú)毒高效的抗高尿酸血癥藥物已經(jīng)成為目前抗高尿酸血癥藥物研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

海帶多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗凝血、降血脂、降血糖、抗輻射、抗突變、抗體內(nèi)氧化和耐缺氧等多種生物學(xué)活性［7］，但有關(guān)其調(diào)節(jié)體內(nèi)XOD活性，降低血清尿酸水平的報(bào)道較少。本實(shí)驗(yàn)研究了海帶多糖體外對(duì)XOD的抑制作用，并通過(guò)腹腔注射氧嗪酸鉀建立小鼠高尿酸血癥模型，研究海帶多糖對(duì)高尿酸血癥小鼠的降尿酸效果。

1 材料與方法

1.1 材料

新鮮海帶采購(gòu)于青島市齊東路水產(chǎn)品市場(chǎng)，將清洗后的海帶用蒸餾水反復(fù)沖洗，烘干至恒重，粉碎，過(guò)60目篩，放入密封袋內(nèi)貯存?zhèn)溆谩?/p>

雄性昆明種小鼠60只，體重（33.0±2.2）g，購(gòu)于青島市藥品檢驗(yàn)檢疫所。

1.2 試劑和儀器

DEAE-52纖維素凝膠、Sephadex G-200葡聚糖凝膠為天津博迪化工股份有限公司產(chǎn)品；黃嘌呤（Xanthine）、黃嘌呤氧化酶（Xanthine Oxidase，X1875）為Sigma公司產(chǎn)品；別嘌呤醇（Allopurinol）為上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品；氧嗪酸鉀（Potassium Oxonate）、羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為北京華邁科生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其它實(shí)驗(yàn)試劑均采用國(guó)產(chǎn)分析純。

電子天平（FA1004型）；集熱式磁力攪拌機(jī)（DF-101S型）；高速冷凍離心機(jī)（HC-3018R型）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（N-1100型）；FT-IR紅外光譜儀（Nexus-470型）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-2800型）；全自動(dòng)血液生化分析儀（BS-200型）。

1.3 方法

1.3.1 海帶多糖的制備［8］稱取海帶干粉10g，以1∶40的料液比加入蒸餾水，70℃水浴浸提4.5h，離心，取上清；將上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空減壓濃縮，Sevag法除去蛋白質(zhì)［9］，加入95%乙醇4℃，靜置過(guò)夜，離心收集沉淀，分別用無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌沉淀，真空抽濾，冷凍干燥，得海帶粗多糖。采用DEAE-52纖維素離子交換柱和Sephadex G-200凝膠柱層析對(duì)海帶多糖進(jìn)行分離純化［10］，收集最大洗脫峰，冷凍干燥得純品，所得海帶多糖為淡黃色粉末，易溶于水，不溶于如乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑，苯酚－硫酸法［11］測(cè)定純化后海帶多糖的總糖含量為91.8%。參照文獻(xiàn)［1］方法，測(cè)得該多糖的相對(duì)分子量約為9.2×104。多糖酸性水解物經(jīng)紙層析檢查［13］，發(fā)現(xiàn)多糖中含有巖藻糖、葡萄糖、半乳糖和木糖。

1.3.2 海帶多糖紅外光譜測(cè)定［14］取純化后的多糖樣品5mg，KBr研磨壓片后，在4 000～500cm－1的波數(shù)范圍內(nèi)測(cè)定海帶多糖的紅外光譜圖。

1.3.3 體外海帶多糖對(duì)XOD活力的影響 XOD酶活力的測(cè)定原理是XOD能夠催化底物黃嘌呤產(chǎn)生尿酸，尿酸在波長(zhǎng)294nm處有特征吸收峰。參照文獻(xiàn)［15］的方法，反應(yīng)體系總體積為5mL，在試管中依次加入2.0mL底物黃嘌呤溶液，2.6mL磷酸緩沖液（0.2mol/L，pH＝7.5）和0.2mL海帶多糖溶液（濃度分別是0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL），25 ℃水浴10min，再加入25℃預(yù)溫的酶液（4μg/mL）0.2mL，充分混勻，反應(yīng)1min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定OD294值，每個(gè)樣品平行操作3次。以公式I（%）＝（1－B/A）×100%計(jì)算不同濃度海帶多糖對(duì)XOD的相對(duì)抑制率（I）。其中，A為不加抑制劑（海帶多糖）的XOD的活力，B為加入抑制劑后的XOD的活力。將海帶多糖濃度與抑制率進(jìn)行線性回歸得回歸方程，計(jì)算抑制率為50%的海帶多糖濃度，即半抑制濃度（IC50）。

1.3.4 海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合抑制作用采用等毒法［16］，將海帶多糖與別嘌呤醇單獨(dú)使用時(shí)對(duì)XOD的抑制率分別達(dá)到25%時(shí)所需的劑量混合，測(cè)定二者的混合物對(duì)XOD聯(lián)合抑制率的大?。▽?shí)測(cè)抑制率），預(yù)期抑制率為50%，根據(jù)下面的公式求出共毒系數(shù)，評(píng)價(jià)海帶多糖與別嘌呤醇的混合物對(duì)XOD的聯(lián)合抑制作用。

共毒系數(shù)＝（實(shí)測(cè)抑制率（預(yù)期抑制率）/預(yù)期抑制率）×100。

1.3.5 小鼠實(shí)驗(yàn)分組和給藥［17］實(shí)驗(yàn)小鼠購(gòu)回之后于動(dòng)物房中進(jìn)行適應(yīng)性喂養(yǎng)，室溫（23±2）℃，12∶12h明暗交替。小鼠自由攝食和飲水，7d后，將60只小鼠隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型對(duì)照組、別嘌呤醇組、海帶多糖高劑量組、海帶多糖中劑量組和海帶多糖低劑量組。

小鼠每天下午14：00灌胃給藥一次，正常組和模型對(duì)照組分別給等劑量的0.5%CMC-Na；別嘌呤醇作為陽(yáng)性對(duì)照組按10mg/kg·d給藥；海帶多糖高、中、低劑量組分別按照1 000、500、250mg/kg·d的劑量給藥，連續(xù)給藥7d。末次給藥1h前，除正常組外，其余各組小鼠按照300mg/kg的劑量腹腔注射氧嗪酸鉀，抑制尿酸酶的活性，提高小鼠的血清尿酸水平，建立高尿酸血癥模型。給藥1h后，各組小鼠摘眼球取血，血液在室溫凝結(jié)0.5h，2 500g離心10min，分離血清，4℃保存待測(cè)。

1.3.6 血清尿酸水平的測(cè)定 取血清，由中國(guó)海洋大學(xué)校醫(yī)院采用全自動(dòng)血液生化分析儀測(cè)定各組小鼠的血尿酸值，對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)進(jìn)行組間差異性比較。

1.3.7 肝臟XOD活性測(cè)定［18］解剖小鼠，取肝臟低溫冷凍，加入5倍體積80mmol/L冰冷的焦磷酸緩沖液（pH＝7.4）進(jìn)行組織勻漿。肝組織勻漿3 000g離心10min，去除脂層，剩余組織液繼續(xù)10 000g離心1h。取上清液用于檢測(cè)肝組織的XOD活力。

采用總體積為5.5mL的反應(yīng)體系，加入3.6mL濃度為50mmol/L的磷酸緩沖液、100μL肝臟提取液、100μL濃度為1mmol/L的氧嗪酸鉀，37℃下反應(yīng)15min。再加入1.2mL濃度為250μmol/L的黃嘌呤溶液，準(zhǔn)確反應(yīng)10min，最后加入0.5mL 0.58mol/L HCl溶液終止反應(yīng)。將反應(yīng)液3 000g離心5min，取上清液，在294nm下測(cè)定OD值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差（珡X±S）表示。采用單因素方差分析進(jìn)行各組樣本平均數(shù)的比較，P＜0.05說(shuō)明組間差異顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；P＜0.01說(shuō)明差異極顯著，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果及分析

2.1 海帶多糖紅外光譜測(cè)定結(jié)果

海帶多糖的紅外掃描圖譜見(jiàn)圖1，圖譜顯示海帶多糖具有多糖物質(zhì)的特征吸收峰，其中3 288cm－1是—OH的伸縮振動(dòng)，2 938cm－1是C—H 伸縮振動(dòng)，1 320～1 372cm－1是C—H變角振動(dòng)，1 261cm－1處是SO振動(dòng)引起的，表明多糖中存在硫酸基［19］，1 196cm－1為糖環(huán)內(nèi)C—O的伸縮振動(dòng)，1 019和1 082 cm－1是醇羥基—OH 的變角振動(dòng)［20］，883和927cm－1為β-吡喃環(huán)C—H變角振動(dòng)［21］，表明多糖中含有β－糖苷鍵。

2.2 體外海帶多糖對(duì)XOD活力的影響

不同濃度海帶多糖對(duì)XOD活力的影響結(jié)果見(jiàn)圖2，當(dāng)海帶多糖濃度處于0～0.6mg/mL范圍內(nèi)時(shí)，海帶多糖對(duì)XOD的抑制率隨著濃度的增大而迅速升高；而當(dāng)海帶多糖濃度≥0.6mg/mL時(shí)，隨著海帶多糖濃度的升高，抑制率的增長(zhǎng)趨于平緩。經(jīng)過(guò)計(jì)算，海帶多糖的半抑制濃度IC50為0.88mg/mL。

圖1 海帶多糖的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectroscopy of Laminaria japonica polysaccharides

圖2 不同濃度海帶多糖對(duì)XOD活力的影響Fig.2 Effects of Laminaria japonica polysaccharides on the activity of XOD

2.3 海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD的聯(lián)合抑制作用

將海帶多糖與別嘌呤醇單獨(dú)使用時(shí)對(duì)XOD抑制率分別達(dá)到25%時(shí)的劑量進(jìn)行混合。聯(lián)合抑制作用結(jié)果顯示，海帶多糖與別嘌呤醇的混合物對(duì)XOD的實(shí)測(cè)抑制率為（63.11±1.54）%，明顯高于預(yù)期抑制率（50%），其共毒系數(shù)為26.22±3.08，大于20，根據(jù)共毒系數(shù)理論，海帶多糖與別嘌呤醇的二元混合物對(duì)抑制XOD活性具有協(xié)同作用，說(shuō)明二者的聯(lián)合使用可以有效提高對(duì)XOD的抑制率。

2.4 海帶多糖對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響

不同劑量海帶多糖和別嘌呤醇灌胃7d后對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響結(jié)果見(jiàn)表1。氧嗪酸鉀腹腔注射小鼠預(yù)處理后，與正常組小鼠相比，模型對(duì)照組小鼠的血清尿酸水平顯著提高，達(dá)極顯著水平（P＜0.01），說(shuō)明高尿酸血癥小鼠建模成功。別嘌呤醇組血尿酸值比模型對(duì)照組低65.65%，比正常組低36.68%，均達(dá)極顯著水平（P＜0.01），證明別嘌呤醇具有明顯的降尿酸效果。海帶多糖高、中、低劑量組小鼠血尿酸值與模型對(duì)照組相比分別降低了43.03%、35.89%和27.72%，其中高、中劑量組降尿酸效果達(dá)極顯著水平（P＜0.01），可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)劑量的海帶多糖均可降低高尿酸血癥小鼠的血尿酸水平，并且呈現(xiàn)良好的劑量依賴關(guān)系。海帶多糖高、中劑量組的血尿酸值雖然仍高于正常組，但差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明海帶多糖對(duì)氧嗪酸鉀所致的高尿酸血癥具有明顯的改善作用。

表1 海帶多糖對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響Table 1 Effects of Laminaria japonica polysaccharides on serum urate levels in hyperuricemic mice

2.5 海帶多糖對(duì)小鼠肝臟XOD活力的影響

由表2可見(jiàn)，模型對(duì)照組小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀后肝臟中XOD的活性顯著高于正常組（P＜0.01）。別嘌呤醇對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟中的XOD具有極強(qiáng)的抑制作用（P＜0.01），XOD活性降低了46.15%，已經(jīng)低于正常組小鼠酶活水平。經(jīng)過(guò)不同劑量海帶多糖灌胃的高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性比模型對(duì)照組降低了8.73%～17.46%，其中海帶多糖高、中劑量組能夠顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性（P＜0.05），并且與正常組小鼠相比差異不顯著（P＞0.05）?？梢?jiàn)，不同劑量的海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性都存在抑制作用，但海帶多糖的抑制作用比別嘌呤醇溫和，可使高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性基本恢復(fù)正常。

表2 海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD活性的抑制作用Table 2 Inhibition of XOD activities in hyperuricaemic mice by administration of Laminaria japonica polysaccharides and allopurinol

3 討論

XOD是嘌呤代謝過(guò)程中的關(guān)鍵酶，主要分布在肝臟與小腸中，能夠催化機(jī)體內(nèi)的次黃嘌呤生成黃嘌呤，并進(jìn)一步氧化生成尿酸，體內(nèi)XOD活性的升高，與高尿酸血癥的形成有密切的聯(lián)系［22］。黃嘌呤氧化酶抑制劑可抑制XOD的活性，阻礙機(jī)體內(nèi)尿酸的合成，起到降尿酸的效果，用于治療高尿酸血癥。目前，已經(jīng)上市應(yīng)用最為廣泛的一類黃嘌呤氧化酶抑制劑是別嘌呤醇，別嘌呤醇是XOD的一種自殺性底物，與底物競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合XOD的活性位點(diǎn)Mo－pt，使XOD喪失催化活性，對(duì)XOD有極強(qiáng)的抑制作用，但在臨床治療中會(huì)產(chǎn)生很多毒副作用，如發(fā)熱、過(guò)敏性皮疹、腹瀉、肝功能損害、白細(xì)胞和血小板減少等副作用，限制了該藥的廣泛使用［23］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明海帶多糖在體外對(duì)XOD具有明顯的抑制作用，其抑制率隨著海帶多糖濃度的增大而升高，二者呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系，雖然對(duì)XOD的抑制作用比別嘌呤醇弱，但海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD表現(xiàn)為協(xié)同聯(lián)合抑制作用，其共毒系數(shù)＞20，說(shuō)明二者在對(duì)XOD的抑制作用過(guò)程中起到互相增強(qiáng)的效果，聯(lián)合使用海帶多糖和別嘌呤醇優(yōu)于二者單獨(dú)使用。

海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平的影響研究結(jié)果表明，別嘌呤醇能有效降低高尿酸血癥小鼠血清尿酸水平，但其過(guò)強(qiáng)的藥效使得血尿酸值低于正常水平。尿酸水平不僅是體內(nèi)嘌呤代謝穩(wěn)定的標(biāo)識(shí)，還可能具有其他的生物化學(xué)功能。Burkhardt［24］發(fā)現(xiàn)，尿酸具有抗氧化的作用，Singhet［25］發(fā)現(xiàn)，尿酸具有防止DNA損傷的功能。因此，過(guò)度降低體內(nèi)的尿酸水平可能會(huì)適得其反，造成機(jī)體的其他不良反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)中觀察到別嘌呤醇組多數(shù)小鼠毛色發(fā)暗，精神比較萎靡，尿量明顯增多。海帶多糖各實(shí)驗(yàn)劑量組與模型對(duì)照組相比都起到有效的降尿酸效果，并且呈現(xiàn)良好的劑量依賴效應(yīng)。其中海帶多糖高、中劑量組血清尿酸值與正常組小鼠相比無(wú)顯著差異，基本恢復(fù)至正常水平。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中海帶多糖各劑量組小鼠生長(zhǎng)狀況、精神狀態(tài)良好，與正常組小鼠相比均無(wú)明顯差異，體重增長(zhǎng)穩(wěn)定，無(wú)死亡現(xiàn)象，證明海帶多糖在飼喂過(guò)程中對(duì)小鼠的正常生長(zhǎng)未產(chǎn)生影響，海帶多糖在作為抗高尿酸血癥藥物方面是安全可靠的。同時(shí)，海帶多糖高、中劑量組能夠有效降低高尿酸血癥小鼠肝臟中XOD的活性，使其基本恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明海帶多糖可能通過(guò)抑制肝臟內(nèi)XOD的活性起到降尿酸的效果，其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究發(fā)現(xiàn)，海帶多糖在體外對(duì)XOD具有明顯的抑制作用，海帶多糖與別嘌呤醇對(duì)XOD表現(xiàn)為協(xié)同聯(lián)合抑制作用，盡管海帶多糖對(duì)XOD的抑制作用比別嘌呤醇弱，但海帶多糖對(duì)氧嗪酸鉀所致的小鼠高尿酸血癥有明顯的降尿酸效果，并對(duì)小鼠肝臟中XOD抑制作用顯著，同時(shí)安全無(wú)毒副作用，有望為今后抗高尿酸血癥藥物的開(kāi)發(fā)提供新的材料。

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