利用雙外流持續(xù)發(fā)酵系統(tǒng)研究植物精油對(duì)瘤胃發(fā)酵和甲烷生成的影響

金恩望 卜登攀 王加啟 姜雅慧 包萬(wàn)華 史浩亭 沈維軍 李發(fā)弟

(1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193;2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，蘭州 730070)

瘤胃是反芻動(dòng)物消化系統(tǒng)中最重要的器官。瘤胃中合成的微生物蛋白和揮發(fā)性脂肪酸(VFA)為反芻動(dòng)物提供了其所需要的大部分蛋白質(zhì)和能量［1］。然而，瘤胃發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的甲烷(CH4)和部分氨態(tài)氮(NH3-N)以直接或間接的方式排出體外，降低了反芻動(dòng)物對(duì)能量和蛋白質(zhì)的利用效率［2］。因此，通過(guò)調(diào)控瘤胃微生物發(fā)酵，提高飼糧纖維成分降解率，減少CH4生成和氮的排泄，對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和降低環(huán)境污染具有重大意義。很長(zhǎng)時(shí)間以來(lái)，抗生素作為反芻動(dòng)物飼料添加劑可有效調(diào)控瘤胃微生物菌群，降低瘤胃中能量和蛋白質(zhì)的損失［3］。但是抗生素的添加所產(chǎn)生的抗藥性以及其在肉和乳中的殘留等問(wèn)題給食品安全帶來(lái)了很大挑戰(zhàn)。目前，許多國(guó)家已經(jīng)禁止或限制在反芻動(dòng)物飼料中添加抗生素等添加劑。因此，尋找天然的瘤胃調(diào)控劑對(duì)提高反芻動(dòng)物生產(chǎn)性能和保護(hù)環(huán)境具有重要的基礎(chǔ)和現(xiàn)實(shí)意義。

植物精油是植物次生代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗氧化和提高免疫力等功能［4］。在反芻動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)中，植物精油能通過(guò)選擇性地抑制某些特定的微生物菌群來(lái)調(diào)控瘤胃微生物發(fā)酵［5］，降低瘤胃中CH4的產(chǎn)生和調(diào)控瘤胃氮代謝。Jahani-Azizabadi等［6］用批次培養(yǎng)法研究了植物精油對(duì)瘤胃發(fā)酵特性的影響，表明添加20μL/L的蒔蘿油、牛至油和肉桂油等能顯著降低NH3-N濃度和CH4生成。Evans等［7］的體外試驗(yàn)表明，添加400 mg/L的百里香酚顯著降低了CH4生成，但同時(shí)也降低了瘤胃液中的乙酸和丙酸濃度。Borchers等［8］報(bào)道，瘤胃液中添加1 000 mg/L的百里香導(dǎo)致瘤胃液中氨基酸積累和NH3-N濃度降低，從而改變瘤胃微生物氮代謝。Castillejos等［5］通過(guò)持續(xù)培養(yǎng)試驗(yàn)指出，添加1 500 mg/L的混合植物精油能提高發(fā)酵液中總揮發(fā)性脂肪酸(TVFA)濃度，但是對(duì)有機(jī)物質(zhì)降解率沒(méi)有顯著影響。而B(niǎo)usquet等［9］報(bào)道，一些植物精油(肉桂油、茶樹(shù)油、丁香油和大蒜油)及其主要成分(肉桂醛、丁子香酚等)的添加濃度為3 000 mg/L時(shí)顯著抑制了瘤胃微生物發(fā)酵，300 mg/L的添加濃度為影響瘤胃氮代謝的臨界水平，而添加3 mg/L的這些植物精油及其主要成分對(duì)瘤胃微生物發(fā)酵均未產(chǎn)生顯著影響。植物精油的種類繁多，不同研究者研究植物精油不同添加水平對(duì)瘤胃發(fā)酵和CH4生成影響的結(jié)論不盡一致。而且，植物精油對(duì)瘤胃發(fā)酵影響的試驗(yàn)大多采用短期的批次培養(yǎng)法。對(duì)于瘤胃微生物菌群對(duì)植物精油適應(yīng)性的認(rèn)識(shí)缺乏，植物精油對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)瘤胃發(fā)酵的影響效果還不夠全面。本試驗(yàn)旨在采用雙外流人工瘤胃法研究不同添加水平的肉桂油和留蘭香油對(duì)瘤胃體外發(fā)酵模式、瘤胃氮代謝和CH4生成的影響，篩選有利于瘤胃發(fā)酵的植物精油種類和添加水平，為開(kāi)發(fā)天然瘤胃調(diào)控劑提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 供體動(dòng)物飼養(yǎng)及瘤胃液的采集

試驗(yàn)動(dòng)物為3頭安裝永久性瘤胃瘺管的泌乳期［(136±37)d］健康荷斯坦奶牛，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所昌平動(dòng)物試驗(yàn)基地提供。每天于07:00和19:00飼喂全混合日糧，全天自由飲水。于晨飼前1 h采集3頭供體奶牛的瘤胃液，混合均勻后用4層紗布快速過(guò)濾(同時(shí)充入二氧化碳)，放入保溫瓶迅速帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 植物精油和飼料樣品制備

肉桂油和留蘭香油購(gòu)自吉安市海瑞天然植物有限公司。發(fā)酵所用飼料與供體動(dòng)物所飼喂的飼糧一致，飼料原料粉碎并過(guò)2 mm篩，按配方制成顆粒料，風(fēng)干后備用。飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見(jiàn)表1。

表1 飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of the diet(DM basis) %

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將每種植物精油(肉桂油和留蘭香油)的4種添加水平(0、100、500和1 500 mg/L)作為處理因素。將3臺(tái)瘤胃模系統(tǒng)(見(jiàn)1.4)上的12個(gè)相同的雙層不銹鋼發(fā)酵罐隨機(jī)分為4處理，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)試驗(yàn)周期為6 d，包括適應(yīng)期3 d和采樣期3 d。每種植物精油在1個(gè)月內(nèi)重復(fù)2期試驗(yàn)。

1.4 瘤胃模擬系統(tǒng)及體外發(fā)酵

體外發(fā)酵裝置采用中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所研制的“新型固液氣分流式瘤胃模擬系統(tǒng)［10］”。該發(fā)酵系統(tǒng)實(shí)時(shí)監(jiān)控并記錄發(fā)酵罐內(nèi)溫度、pH和產(chǎn)氣量，并能按照設(shè)定液體稀釋率持續(xù)向發(fā)酵罐中注入人工唾液以及隨時(shí)可以按照指令向發(fā)酵罐中持續(xù)沖入氮?dú)?N2)以維持發(fā)酵罐內(nèi)的厭氧環(huán)境。開(kāi)始發(fā)酵時(shí)向每個(gè)發(fā)酵罐(有效體積1 L)中加入20 g飼糧、670 mL新鮮瘤胃液和330 mL人工唾液進(jìn)行發(fā)酵，人工唾液采用Mc Dougall等［11］設(shè)計(jì)的配方配制。設(shè)定好各種試驗(yàn)條件:溫度39℃;轉(zhuǎn)速15 r/min;液體稀釋率8%/h;固體稀釋率4%/h;人工唾液中加入0.4 g/L尿素，以模仿瘤胃氮循環(huán)。每天09:00和21:00從排固口抽出100 mL發(fā)酵過(guò)食糜，然后從加料口向每個(gè)發(fā)酵罐中加入20 g飼糧(補(bǔ)料)和100 mL人工唾液。補(bǔ)料時(shí)向每個(gè)發(fā)酵罐加入相應(yīng)種類和水平的植物精油，同時(shí)向發(fā)酵罐中持續(xù)充入N2，以維持罐內(nèi)厭氧環(huán)境。

1.5 樣品采集

每天(整個(gè)試驗(yàn)期)補(bǔ)料前從發(fā)酵罐中部的排液口采集發(fā)酵液5 mL用于原蟲(chóng)數(shù)量的測(cè)定，從發(fā)酵罐底部的排泄口收集消化后過(guò)篩網(wǎng)的食糜于尼龍袋中用于食糜的干物質(zhì)(DM)、粗蛋白質(zhì)(CP)、中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的測(cè)定。以天為單位計(jì)算粗蛋白質(zhì)降解率(dCP)、中性洗滌纖維降解率(dNDF)和酸性洗滌纖維降解率(dADF)，以研究植物精油對(duì)瘤胃微生物降解活性影響的趨勢(shì)。因?yàn)檠a(bǔ)料3 h后發(fā)酵系統(tǒng)和瘤胃微生物發(fā)酵都處于相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，因此，整個(gè)試驗(yàn)期的每天09:00補(bǔ)料后3 h時(shí)采集發(fā)酵液4 mL用于NH3-N和VFA濃度的測(cè)定，以研究瘤胃微生物對(duì)植物精油的適應(yīng)情況。采樣期(第4～6天)每天09:00補(bǔ)料后6、9和12 h均采集發(fā)酵液2 mL用于VFA濃度的測(cè)定，以研究植物精油對(duì)每個(gè)補(bǔ)料周期內(nèi)VFA濃度的變化情況。通過(guò)安裝在罐內(nèi)的pH電極自動(dòng)檢測(cè)發(fā)酵液pH，并自動(dòng)錄入計(jì)算機(jī)。因?yàn)槊看窝a(bǔ)料間隔(12 h)內(nèi)的pH變化規(guī)律一致，即以12 h為單位提取數(shù)據(jù)，研究植物精油對(duì)發(fā)酵液中pH變化規(guī)律的影響。采樣期每個(gè)發(fā)酵罐外接一個(gè)標(biāo)號(hào)氣袋收集09:00補(bǔ)料后12 h內(nèi)發(fā)酵所產(chǎn)生的氣體，用于CH4體積分?jǐn)?shù)的測(cè)定。

1.6 樣本分析

采集的樣品按10∶1比例加入25%的偏磷酸處理后用氣相色譜(Agilent-6890 NGC system，Agilent，America)法測(cè)定VFA濃度。所采集的溢流液樣品按3∶1比例加入25%的偏磷酸，搖勻后在12 000×g下離心20 min，取上清液采用靛酚比色法進(jìn)行NH3-N濃度的測(cè)定。將從發(fā)酵罐中部取得的5 mL溢流液加入10 mL甲基綠染色液，搖勻靜置過(guò)夜，采用Sedgewick-Rafter(ARTHUR Thomas NO.9851-C20)原蟲(chóng)計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)［12］。氣體中CH4體積分?jǐn)?shù)利用氣相色譜(Agilent-6890 NGC system)測(cè)定。NDF和 ADF含量按照 Van Soest等［13］的方法測(cè)定。DM 含量參照GB 6435—86測(cè)定，根據(jù)發(fā)酵前后的DM質(zhì)量關(guān)系計(jì)算體外干物質(zhì)降解率。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)各項(xiàng)指標(biāo)的數(shù)據(jù)用Excel 2007進(jìn)行初步整理后，采用SAS 9.0中MIXED模型進(jìn)行方差分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05為顯著水平，并采用Tukey方法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物精油添加水平對(duì)發(fā)酵液p H的影響

由表2可知，各組pH在發(fā)酵初期均呈現(xiàn)較快地增加，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，增加速度逐漸放緩，肉桂油各添加組在發(fā)酵36 h以后pH基本穩(wěn)定在6.6～6.8之間，留蘭香油各添加組在發(fā)酵48 h以后pH基本穩(wěn)定在6.7～6.8之間。與對(duì)照組相比，添加100、500 mg/L的肉桂油和留蘭香油均不同程度地提高了pH(P＞0.05)，添加1 500 mg/L的肉桂油在發(fā)酵108 h時(shí)pH顯著降低(P＜0.05)，而在其余時(shí)間點(diǎn)未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。

2.2 植物精油添加水平對(duì)營(yíng)養(yǎng)成分降解率的影響

由表3可知，添加100、500 mg/L的肉桂油和所有劑量的留蘭香油對(duì)dCP、dNDF和dADF均未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。添加1 500 mg/L的肉桂油在發(fā)酵第5、6天 dNDF和 dADF顯著降低(P＜0.05)，在發(fā)酵第 2、4、5和 6天 dCP顯著降低(P＜0.05)，其余各時(shí)間這3種營(yíng)養(yǎng)成分的降解率與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

表2 植物精油添加水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間pH的影響Table 2 Effects of essential oil supplemental level on pH at different fermentation time

表3 植物精油添加水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間營(yíng)養(yǎng)成分降解率的影響Table 3 Effects of essential oil supplemental level on nutrient degradation rate at different fermentation time %

續(xù)表3

2.3 植物精油添加水平對(duì)VFA濃度的影響

從表4可知，在發(fā)酵初期(3 h)時(shí)添加肉桂油和留蘭香油對(duì)TVFA、乙酸、丙酸濃度和乙酸/丙酸(A/P)均未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。從發(fā)酵27 h開(kāi)始，1 500 mg/L肉桂油添加組的TVFA、乙酸和丙酸濃度顯著下降(P＜0.05)，A/P顯著升高(P＜0.05)。1 500 mg/L留蘭香油添加組TVFA在發(fā)酵123 h時(shí)顯著下降(P＜0.05)，在發(fā)酵27、99和123 h時(shí)丙酸濃度顯著下降(P＜0.05)，A/P從發(fā)酵27 h開(kāi)始顯著升高(P＜0.05)。500 mg/L肉桂油添加組TVFA、乙酸和丙酸濃度在發(fā)酵27和99 h時(shí)顯著降低(P＜0.05)，而在其余發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組差異不顯著(P＞0.05)。100 mg/L的肉桂油、留蘭香油和500 mg/L的留蘭香油添加組對(duì)各發(fā)酵時(shí)間點(diǎn)的VFA濃度均未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，0、100和500 mg/L肉桂油添加組TVFA、乙酸、丙酸濃度和A/P無(wú)顯著變化(P＞0.05)，而1 500 mg/L肉桂油添加組TVFA、乙酸和丙酸濃度顯著下降(P＜0.05)，A/P顯著升高(P＜0.05)。

由表5可知，1 500 mg/L肉桂油添加組在發(fā)酵的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均顯著降低了TVFA、乙酸和丙酸濃度(P＜0.05)，提高了 A/P(P＜0.05)。1 500 mg/L留蘭香油添加組顯著降低了丙酸濃度(P＜0.05)，顯著提高了 A/P(P＜0.05)，而對(duì)TVFA和乙酸濃度無(wú)顯著影響(P＞0.05)。除了500 mg/L肉桂油添加組在補(bǔ)料后9 h時(shí)顯著降低了乙酸濃度(P＜0.05)，在其余時(shí)間點(diǎn)100和500 mg/L肉桂油和留蘭香油添加組對(duì)TVFA和乙酸濃度均未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。在1個(gè)補(bǔ)料周期(12 h)內(nèi)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，各留蘭香油添加組TVFA、乙酸和丙酸濃度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但均未達(dá)到顯著水平(P＞0.05)。

表4 植物精油添加水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間VFA濃度的影響Table 4 Effects of essential oil supplemental level on VFA concentration at different fermentation time mmol/L

表5 植物精油添加水平對(duì)補(bǔ)料后12 h內(nèi)VFA濃度的影響Table 5 Effects of essential oil supplemental level on VFA concentration within 12 h after feeding mmol/L

2.4 植物精油添加水平對(duì)NH3-N濃度的影響

由表6可知，添加100和500 mg/L肉桂油和留蘭香油對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)中NH3-N濃度均未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。添加1 500 mg/L肉桂油和留蘭香油在發(fā)酵初期(27 h以內(nèi))對(duì)NH3-N濃度影響較小，從發(fā)酵27 h開(kāi)始，1 500 mg/L肉桂油添加組NH3-N濃度顯著降低(P＜0.05)，1 500 mg/L留蘭香油添加組從發(fā)酵51 h時(shí)開(kāi)始顯著降低NH3-N濃度(P＜0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，0、100和500 mg/L的肉桂油和留蘭香油添加組NH3-N濃度呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，而1 500 mg/L肉桂油添加組NH3-N濃度則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

表6 植物精油添加水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間氨態(tài)氮濃度的影響Table 6 Effects of essential oil supplemental level on NH3-N concentration at different fermentation time mg/dL

2.5 植物精油添加水平對(duì)原蟲(chóng)數(shù)量的影響

由表7可知，各肉桂油添加組在發(fā)酵第1天對(duì)原蟲(chóng)數(shù)量未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)，從第2天開(kāi)始，添加500和1 500 mg/L肉桂油顯著降低了原蟲(chóng)數(shù)量(P＜0.05)，而添加100 mg/L肉桂油對(duì)發(fā)酵液原蟲(chóng)數(shù)量無(wú)顯著影響(P＞0.05)。除在發(fā)酵第3天500 mg/L留蘭香油添加組與對(duì)照組無(wú)顯著差異(P＞0.05)外，其余時(shí)間添加 500和1 500 mg/L的留蘭香油均顯著降低了原蟲(chóng)數(shù)量(P＜0.05)。

表7 植物精油添加水平對(duì)不同發(fā)酵時(shí)間原蟲(chóng)數(shù)量的影響Table 7 Effects of essential oil supplemental level on the number of protozoa at different fermentation timelog/mL

2.6 植物精油添加水平對(duì)CH4體積分?jǐn)?shù)的影響

由表8可知，添加100、500和1 500 mg/L肉桂油分別降低CH4體積分?jǐn)?shù)的23.13%、38.28%和 50.40%(P＜0.05)。添加100、500和1500 mg/L留蘭香油分別降低CH4體積分?jǐn)?shù)的17.63%、28.24%和35.14%(P＜0.05)。添加肉桂油和留蘭香油降低CH4體積分?jǐn)?shù)的程度與添加劑量呈線性正相關(guān)(R2分別為0.91和0.87)。

3 討論

3.1 植物精油添加水平對(duì)發(fā)酵液pH和飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率的影響

瘤胃pH的波動(dòng)能反映瘤胃的綜合發(fā)酵水平，它受飼糧性質(zhì)、有機(jī)酸積聚和唾液分泌量的影響。本試驗(yàn)中所有試驗(yàn)組pH在發(fā)酵48 h內(nèi)達(dá)到平衡狀態(tài)，說(shuō)明了發(fā)酵系統(tǒng)整體運(yùn)行穩(wěn)定。本試驗(yàn)中，添加不高于500 mg/L的2種植物精油均不同程度地增加了發(fā)酵液pH。Castillejos等［14］通過(guò)體外培養(yǎng)試驗(yàn)表明，添加500 mg/L幾種植物精油的主要成分均增加了瘤胃液pH，這與本試驗(yàn)結(jié)果 一致。

表8 植物精油添加水平對(duì)甲烷體積分?jǐn)?shù)的影響Table 8 Effects of essential oil supplemental level on CH4volume fraction

反芻動(dòng)物依靠瘤胃纖維降解菌分泌的纖維素酶來(lái)分解利用飼料中的纖維物質(zhì)，溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃中的主要纖維降解菌［15］。纖維降解菌對(duì)低pH非常敏感，pH降低將對(duì)纖維降解產(chǎn)生負(fù)面影響［5］。本試驗(yàn)中只有添加最高劑量的肉桂油在發(fā)酵后期顯著降低了纖維降解率，因此，可以推斷出纖維降解率的降低是由pH降低造成的。Calsamiglia等［16］報(bào)道，在補(bǔ)充相同飼糧的情況下，纖維降解率在pH為5.7時(shí)顯著低于pH為6.4時(shí)的纖維降解率，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

3.2 植物精油添加水平對(duì)VFA和NH3-N濃度的影響

反芻動(dòng)物飼糧中的碳水化合物進(jìn)入瘤胃后可被瘤胃微生物細(xì)胞內(nèi)酶水解成單糖，最終發(fā)酵生成VFA，其生成量代表著反芻動(dòng)物能量代謝情況。植物精油對(duì)于瘤胃內(nèi)VFA濃度及比例的影響，因植物精油的種類、劑量、主要成分含量與發(fā)酵底物精粗比的不同而有所區(qū)別，也與pH具有很高相關(guān)性［17］。

Busquet等［9］通過(guò)體外試驗(yàn)表明，高水平(3 000 mg/L)肉桂油、茶樹(shù)油和丁香油的添加水平能顯降顯著降低TVFA濃度，而低水平(3和30 mg/L)的添加則對(duì)TVFA濃度無(wú)顯著影響。與該報(bào)道一致，本試驗(yàn)中添加500和1 500 mg/L的肉桂油均顯著降低了TVFA和丙酸濃度，而100 mg/L肉桂油和留蘭香油的添加對(duì)TVFA、乙酸和丙酸濃度無(wú)顯著影響。Cardozo等［18］研究表明，添加300 mg/L的肉桂油顯著降低了瘤胃液TVFA和支鏈脂肪酸濃度，而添加30 mg/L的肉桂油對(duì)TVFA和乙酸濃度無(wú)影響。這些結(jié)果共同說(shuō)明了添加低水平肉桂油對(duì)體外發(fā)酵VFA濃度沒(méi)有影響，高水平時(shí)降低VFA濃度，有效的臨界劑量在100～300 mg/L之間。

肉桂醛是肉桂油的主要成分，一般占90%以上。研究表明，肉桂醛對(duì)特定的微生物菌群有抗菌作用，其作用機(jī)制與其分子結(jié)構(gòu)中的羰基有關(guān)［19］。本試驗(yàn)中，0、100 和 500 mg/L 肉桂油添加組VFA濃度和比例隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)無(wú)顯著變化，從而說(shuō)明在本發(fā)酵系統(tǒng)中，在1個(gè)發(fā)酵周期(6 d)內(nèi)發(fā)酵性能比較穩(wěn)定。而1 500 mg/L肉桂油添加組隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)VFA濃度顯著下降，A/P比例顯著升高，這種變化可能是由于添加高水平肉桂油時(shí)肉桂醛抑制了某些微生物菌群，改變了瘤胃發(fā)酵模式造成的。

蛋白質(zhì)降解包括蛋白質(zhì)水解、肽水解和脫氨基等一系列復(fù)雜過(guò)程。瘤胃液中的NH3-N濃度是衡量瘤胃氮代謝的一個(gè)重要指標(biāo)，能間接反映出瘤胃微生物利用NH3-N合成微生物菌體蛋白和微生物分解飼料蛋白生成NH3-N的平衡情況［20］。植物精油可以通過(guò)抑制高活性氨基酸發(fā)酵菌活性和影響氨基酸的降解程度，從而影響瘤胃蛋白質(zhì)代謝［21］。體外培養(yǎng)試驗(yàn)中添加留蘭香油對(duì)發(fā)酵液中的NH3-N濃度的影響不盡一致［22］。Castillejos等［5］報(bào)道，在連續(xù)培養(yǎng)系統(tǒng)中添加混合植物精油對(duì)瘤胃細(xì)菌的氮代謝沒(méi)有調(diào)節(jié)作用。本試驗(yàn)中只有2種精油的最高添加水平組NH3-N濃度顯著降低。Cardozo等［23］的體外試驗(yàn)結(jié)果表明，肉桂醛(3 000 mg/L)可以通過(guò)抑制脫氨的作用而降低瘤胃液NH3-N濃度;Chaves等［24］報(bào)道，體外培養(yǎng)試驗(yàn)中添加留蘭香油(1 500 mg/L)降低NH3-N濃度是由于其抑制了微生物蛋白的水解活性，與本試驗(yàn)結(jié)果一致。

隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，這2種植物精油的非最高添加劑量組和對(duì)照組NH3-N濃度均呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，說(shuō)明在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)瘤胃微生物不斷降解飼糧粗蛋白質(zhì)生成NH3-N，并且生成NH3-N的速度大于瘤胃微生物利用NH3-N合成微生物蛋白的速度。而1 500 mg/L肉桂油添加組隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)NH3-N濃度則呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，可能是高劑量肉桂油的添加抑制了具有脫氨基作用的細(xì)菌活性，從而導(dǎo)致NH3-N的生成速度小于瘤胃微生物利用NH3-N合成微生物蛋白的速度。

3.3 植物精油添加水平對(duì)發(fā)酵液中原蟲(chóng)數(shù)量和CH4體積分?jǐn)?shù)的影響

瘤胃原蟲(chóng)是瘤胃微生物的重要組成部分，其在瘤胃內(nèi)數(shù)量的變化可作為衡量瘤胃環(huán)境變化的指標(biāo)。Kongmun等［25］報(bào)道，體外培養(yǎng)試驗(yàn)中添加椰子油和大蒜粉使原蟲(chóng)數(shù)量降低了68.4%～75.9%，從而調(diào)控瘤胃微生物菌群。本試驗(yàn)中添加500和1 500 mg/L植物精油顯著降低了發(fā)酵液中的原蟲(chóng)數(shù)量。原蟲(chóng)數(shù)量的降低可能是由于細(xì)胞膜滲透性降低所導(dǎo)致，Talebzadeh等［26］報(bào)道，植物精油抗原蟲(chóng)機(jī)制可能是其主要成分中的酚基，其能導(dǎo)致對(duì)于細(xì)胞代謝至關(guān)重要的細(xì)胞膜破裂、酶失活和金屬離子流失等［27］。

CH4是反芻動(dòng)物消化過(guò)程中的產(chǎn)物，降低CH4排放既能提高反芻動(dòng)物能量利用效率，又能降低溫室效應(yīng)。植物精油可以抑制產(chǎn)CH4菌活性或通過(guò)降低瘤胃液中原蟲(chóng)數(shù)量從而間接減少產(chǎn)CH4菌數(shù)量［28］，金恩望等［29］通過(guò)體外產(chǎn)氣試驗(yàn)表明，添加50～1 000 mg/L的肉桂油降低了CH4體積分?jǐn)?shù)的 26.9% ～67.8%。Macheboeuf等［30］報(bào)道，體外發(fā)酵試驗(yàn)中添加500 mg/L的肉桂油能抑制瘤胃CH4菌活性，并降低了CH4產(chǎn)量的26%。與這些報(bào)道一致，本試驗(yàn)中添加這2種植物精油的各組均顯著降低了CH4體積分?jǐn)?shù)，并且降低CH4的程度與添加劑量均呈正相關(guān)。在瘤胃發(fā)酵體系中，產(chǎn)CH4菌附著在原蟲(chóng)表面與原蟲(chóng)形成內(nèi)外共生關(guān)系［15］。原蟲(chóng)細(xì)胞膜內(nèi)壁有多種脫氫酶，催化反應(yīng)產(chǎn)生的氫分子通過(guò)種間氫轉(zhuǎn)移被產(chǎn)CH4菌用于合成CH4［31］。因此，本試驗(yàn)中添加 500和1 000 mg/L的這2種植物精油組原蟲(chóng)數(shù)量的降低可能是導(dǎo)致CH4體積分?jǐn)?shù)減少的重要原因。Pellikaan等［32］報(bào)道，體外發(fā)酵試驗(yàn)中添加肉桂醛能顯著降低CH4生成，說(shuō)明肉桂油降低CH4主要與其主要成分肉桂醛有關(guān)。肉桂醛的抗菌機(jī)制是破壞細(xì)菌的細(xì)胞質(zhì)膜，從而導(dǎo)致細(xì)胞ATP消耗和影響葡萄糖運(yùn)輸［33］。

4 結(jié)論

①發(fā)酵體系中添加1 500 mg/L的肉桂油和留蘭香油以及500 mg/L的肉桂油能降低發(fā)酵液中的NH3-N濃度、原蟲(chóng)數(shù)量和CH4體積分?jǐn)?shù)，但同時(shí)也降低了發(fā)酵液中VFA濃度和飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率。其中添加1 500 mg/L肉桂油嚴(yán)重抑制了瘤胃微生物正常發(fā)酵。

②發(fā)酵體系中添加100 mg/L的肉桂油和留蘭香油能顯著降低CH4體積分?jǐn)?shù)，同時(shí)對(duì)VFA的生成和飼糧營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)降解率沒(méi)有負(fù)面影響。

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