硫氯雙酚通過應(yīng)激活化蛋白激酶通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

JIBRILKhalif diriye，樓美清

硫氯雙酚通過應(yīng)激活化蛋白激酶通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡

JIBRILKhalif diriye，樓美清

同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院神經(jīng)外科，上海 200072

目的 探討抗寄生蟲藥物硫氯雙酚對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的作用及其機(jī)制。方法 應(yīng)用CCK 8法、流式細(xì)胞儀和Western blotting觀察不同濃度硫氯雙酚對(duì)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251的存活率、細(xì)胞凋亡、應(yīng)激活化蛋白激酶（c-Jun N-terninalkinase，JNK）及其磷酸化水平變化，以及JNK特異性抑制劑SP600125抑制JNK活性對(duì)硫氯雙酚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果 與對(duì)照組相比，硫氯雙酚作用U251細(xì)胞24 h后，U251細(xì)胞存活率明顯降低（P＜0.05），死亡率明顯升高（P＜0.05），且有劑量依賴性；凋亡相關(guān)Capspase3、DNA修復(fù)酶PARP（paly ADP-ribose polymerase，PARP）表達(dá)和JNK和其化水平均顯著升高（P＜0.05）；SP600125抑制JNK活性可顯著阻斷硫氯雙酚誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。結(jié)論 硫氯雙酚可誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡，其機(jī)制可能與激活JNK信號(hào)通路有關(guān)。

腦膠質(zhì)瘤；硫氯雙酚；凋亡；應(yīng)激活化蛋白激酶信號(hào)通路

腦神經(jīng)膠質(zhì)瘤起源于神經(jīng)外胚層，是目前最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤是神經(jīng)外科侵襲性最強(qiáng)和治療難度最大的腫瘤，具有增殖快、浸潤(rùn)生長(zhǎng)、術(shù)后易復(fù)發(fā)、惡性程度高、預(yù)后較差的特點(diǎn)[1]。目前治療包括手術(shù)、放療與化療三方面，但療效不甚理想。即使采取廣泛性外科切除聯(lián)合放、化療的綜合療法仍可再次復(fù)發(fā)；特別是高級(jí)別膠質(zhì)瘤由于呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)難以做到真正的腫瘤全切，難以治愈、復(fù)發(fā)率高，預(yù)后極差，患者生存改善有限。因此，如何提高膠質(zhì)瘤的療效是神經(jīng)外科醫(yī)師面臨的艱巨任務(wù)，也是當(dāng)今神經(jīng)腫瘤學(xué)的重要研究方向。新的腫瘤敏感的藥物研發(fā)雖然是老調(diào)重彈，但也尤為關(guān)鍵[2]。

我們團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，硫氯雙酚（2，2′-Sulfanediylbis （4，6-dichlorophenol），一種20世紀(jì)中后期美國(guó)FDA通過的上市廣譜口服抗寄生蟲藥物（主要是抗肺吸蟲及肝吸蟲），對(duì)腦膠質(zhì)瘤具有較好的抑制作用。國(guó)外報(bào)道，硫氯雙酚對(duì)黑色素瘤[3]、卵巢癌[4]、宮頸癌、乳腺癌有良好的臨床前抑制作用，而對(duì)非腫瘤患者的體內(nèi)毒性作用較??；而對(duì)自毒素（autotaxin）及NF-κB信號(hào)通路的抑制被認(rèn)為是其可能的主要抗腫瘤機(jī)制。本研究探索硫氯雙酚對(duì)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的體外作用及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料

U251細(xì)胞（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫(kù)）；硫氯雙酚（Sigma公司，美國(guó)）；DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國(guó)）；CCK8（同仁化學(xué)研究所，日本）；AnnexinⅤ/PI雙染色流式試劑盒（BD Pharm ingine公司，美國(guó)）；Caspase3、PARP、Bax、JNK、phospho-JNK抗體（Cell Signaling公司，美國(guó)）；辣根酶過氧化物標(biāo)記的二抗（Santa Cruz公司，美國(guó)）。SP600125 （Selleck公司，美國(guó)）。Hoechst33258購(gòu)自碧云天有限公司（上海，中國(guó)）。JNK特異性抑制劑SP600125購(gòu)自Selleck公司（美國(guó)）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

U251及U87人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于體積分?jǐn)?shù)為10％的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基中，置于37℃，體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每1～2 d換液1次。待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底90％后，胰酶消化，1∶1稀釋傳代。SP600125終濃度為10μmol/L，預(yù)處理細(xì)胞3 h后加入硫氯雙酚。硫氯雙酚溶于DMSO中，制成20mmol/L的儲(chǔ)液，4℃保存，使用時(shí)分別稀釋成所需要的濃度。

1.3 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖

以5×103孔U251及U87細(xì)胞接種于96孔板中，24 h后，將U251與U81細(xì)胞分別與濃度為0、50、100、150μmol/L的硫氯雙酚進(jìn)行孵育，時(shí)間分別為24 h、48 h、72 h，到達(dá)作用時(shí)間后。向每孔內(nèi)加入20μl CCK8達(dá)作用時(shí)間并孵育4 h，避光孵育30 m in并震蕩，酶標(biāo)儀檢測(cè)OD550 nm值。計(jì)算出光敏劑最佳孵育時(shí)間。存活率（％）=（實(shí)驗(yàn)組OD490 nm－調(diào)零孔OD490 nm）/（空白對(duì)照組OD490 nm－調(diào)零孔OD490 nm）/（最佳孵）。

1.4 AnnexinV-FITC/PI法檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞消化、離心和計(jì)數(shù)，以每皿2×105個(gè)均勻的接種于35mm2培養(yǎng)皿中，經(jīng)0、50、100μmol/L硫氯雙酚分別處理24 h后，離心并用PBS洗2次，先加入5μl Annexin V，37℃孵育30m in后加入5μl PI，輕輕混勻，避光室溫反應(yīng)15m in，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.5 Hoechst33258檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡

應(yīng)用熒光染料Hoechst33258進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測(cè)。以2×105/孔U251細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中，采用0、50、100μmol/L濃度硫氯雙酚處理細(xì)胞24 h，收集細(xì)胞，PBS洗3次并加入1m l Hoechst33258染液37℃避光孵育15m in，用PBS輕柔沖洗一次，激光共聚焦顯微鏡下觀察并照相。

1.6 Western-blot蛋白定量分析

采用0、50、100μmol/L濃度硫氯雙酚處理細(xì)胞U251細(xì)胞24 h后棄去培養(yǎng)液，PBS洗2次，把PBS液吸取干凈后加入細(xì)胞裂解液，冰上至少孵育15m in，用細(xì)胞刮匙將細(xì)胞刮下收集到1.5m l的EP管中，4℃，12 000 r/m in離心15m in，吸取上清液至一干凈的EP管。用BCA（標(biāo)準(zhǔn)曲線）定量蛋白濃度后，100℃煮沸10m in，置－20℃冰箱保存?zhèn)溆?。各組樣品采取25總蛋白量上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜后封閉，加一抗過夜，次日加入辣根酶過氧化物標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，加入 ECL底物，暗室中X線膠片曝光。B-actin設(shè)為內(nèi)參。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0（SPSS公司，美國(guó)）統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)采用（±s表示，兩組間存活率、凋亡率、蛋白表達(dá)量與空白組比較均采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 硫氯雙酚抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87存活

如圖1CCK8結(jié)果所示，相比于對(duì)照組，50、100μmol/L硫氯雙酚作用于腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251、U87 24～72 h均能明顯殺傷細(xì)胞，對(duì)U251細(xì)胞的24 h、48 h的IC50分別為55.0μmol/L、50μmol/L，對(duì)U87細(xì)胞24 h、48 h的IC50為50.0μmol/L、62μmol/ L；且均有明顯的劑量-時(shí)間依賴性（P＜0.05）。

2.2 硫氯雙酚誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡

為探討硫氯雙酚影響腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞存活的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)用Annexin VFITC/PI雙染法和Hoechst33258檢測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡。應(yīng)用0、50、100μmol/L硫氯雙酚作用12 h后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表明，隨硫氯雙酚濃度增加，PI陽(yáng)性率（壞死細(xì)胞）逐漸增加（P＜0.05），呈濃度-時(shí)間依賴性；50μmol/L濃度作用的U251細(xì)胞總凋亡率為37.4％，而100μmol/L率為濃度則達(dá)47.9％（圖2）；Hoechst33258檢測(cè)顯示U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞呈高藍(lán)光、核變形分裂、核固縮的典型凋亡改變（圖3）。表明，50、100μmol/L亡改變硫氯雙酚均可誘導(dǎo)U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

圖1 CCK 8檢測(cè)硫氯雙酚對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及U87存活率的影響A:U251 cellsproliferation is inhibited after processing by 0～150μmol/L bithionol:bithionolsignificantly inhibit the proliferation of U251 cells,depending on the concentration-time table;B:U87 cellsproliferation is inhibited after processing by 0～150μmol/L bithionol:bithionolsignificantly inhibit the proliferation of U87 cells,depending on te concentration-time tableFig.1 Cellproliferation assay by CCK 8 in bithionol treated cell

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)硫氯雙酚誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡A：Flow cytometry instrument（FCM）to detectapoptosis of U251 cellswhich w ere processed by 0～100μmol/L bithionol.Bithionol induced apoptosisof U251 cells,depending on the concentration;B:Quantitative analysisof apoptosisby(FCM)detection.Fig.2 Flow cytom etry for U251 apop tosis induced by bithionol

硫氯雙酚作用U251細(xì)胞24 h后，Hoechst33324染色共聚焦激光顯微鏡觀察顯示U251細(xì)胞核變小分裂、核固縮，呈濃度依賴性。

圖3 Hoechst33258檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡Fig.3 Hoechst33258 assay for U251 apoptosis image

2.3 硫氯雙酚對(duì)U251凋亡蛋白及信號(hào)通路蛋白的影響

經(jīng)硫氯雙酚作用U251細(xì)胞24 h后收集總蛋白，Western檢測(cè)顯示，相比于空白對(duì)照組（0.1％），50、100μmol/L比于硫氯雙酚處理組凋亡蛋白Cleaved-caspase3、Cleaved-PARP、Bax表達(dá)明顯增高，且呈劑量依賴性；磷酸化JNK表達(dá)量亦明顯提高，P＜0.05（圖4）。

2.4 JNK抑制劑SP600125對(duì)硫氯雙酚誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)顯示，單用10μmol/LJNK抑制劑SP600125處理U251細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率與空白DMSO對(duì)照組（0.1％）無差異；單用50μmol/L硫氯雙酚組細(xì)胞存活率59.2％；SP600125+硫氯雙酚組（用10μmol/LSP600125預(yù)處理6 h后再行50μmol/L硫氯雙酚處理U251細(xì)胞）細(xì)胞存活率89.2％，細(xì)胞凋亡較少（圖5）。

圖5 JNK抑制劑對(duì)BT誘導(dǎo)的U251細(xì)胞凋亡的抑制作用Fig.5 JNK specific inhibitor SP600125 attenuate the apoptosiseffect induced by bithionol

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是腦原發(fā)惡性腫瘤，其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者平均生存期不超過一年[5]。雖神經(jīng)外科手術(shù)技術(shù)不斷發(fā)展，化療藥物層出不斷，但膠質(zhì)瘤患者的生存率及中位生存期等預(yù)后指標(biāo)在近20年幾無改善。

圖4 Western檢測(cè)硫氯雙酚處理后U251凋亡蛋白及信號(hào)通路蛋白改變

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞自我保護(hù)更新的一個(gè)重要機(jī)制。腫瘤細(xì)胞凋亡則是抗腫瘤治療的重要方面[6]，許多抗腫瘤藥物即通過誘導(dǎo)或調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡進(jìn)行腫瘤殺傷。本研究提示，硫氯雙酚對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251及U87具有較強(qiáng)的濃度-時(shí)間依賴的抑制作用，硫氯雙酚能顯著誘導(dǎo)U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。目前認(rèn)為，凋亡是遺傳調(diào)節(jié)下的總的細(xì)胞現(xiàn)象；在凋亡基因中，BCL-2家族基因（包括抗凋亡基因BCL-2及促凋亡基因BAX）是調(diào)節(jié)凋亡的重要核心基因，促凋亡和抗凋亡基因的平衡調(diào)節(jié)著腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲[7]；Caspase家族基因在細(xì)胞周期和增殖中起重要調(diào)節(jié)作用，Caspase 3作為凋亡的最終執(zhí)行者，其活性常受BAX及BAL-2調(diào)節(jié)；JNK信號(hào)通路在細(xì)胞周期、生殖、凋亡和細(xì)胞應(yīng)激等多種生理和病理過程中起重要作用[8]。JNK表達(dá)提高可調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，JNK活化常以JNK磷酸化作為標(biāo)志，故P-JNK表達(dá)與細(xì)胞凋亡明確相關(guān)。本研究U251細(xì)胞經(jīng)硫氯雙酚處理后，BAX表達(dá)增高，BCL-2下調(diào)，Caspase3、JNK磷酸化水平提高，而總JNK水平無變化，提示抗寄生蟲藥物硫氯雙酚可能通過上調(diào)BAX、Caspase3、PARP、P-JNK表達(dá)，下調(diào)BCL-2表達(dá)誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251凋亡。而JNK特異性抑制劑SP600125可逆轉(zhuǎn)其誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡提示，該細(xì)胞凋亡機(jī)制可能受JNK信號(hào)同路調(diào)節(jié)。因此，作為傳統(tǒng)的抗寄生蟲藥物硫氯雙酚，可能是潛在的抗腦膠質(zhì)瘤藥物。

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Bithionol inhibits p roliferation and inducesapop tosis in gliom a cellU251 in vitro

JIBRILKhalifdiriye，LOUMeiqing Department of Neurosurgery，ShanghaiTenth People's Hospital，TongjiUniversity Schoolof Medicine，Shanghai 200072，China

Objective To observe the anti-tumor activity of anti-parasite drug Bithionol and its possible mechanism in vitro.M ethods The viability of glioma cells was measured by CCK8 assay.The cell apoptosis was assayed by flow cytometry and Hoechst33258.Apoptosis-related protein expressions of Caspase 3/Cleaved caspase 3，PARP/Cleaved PARP were determ ined by Western blotting.The level of JNK-P-JNK induced by Bithionol was measured by Western blotting with or without the treatment of JNK specific inhibitor SP600125.Resu lts A fter treatment of Bithionol for 24 hours，the grow th of glioma cells U251 and U87 were significantly inhibited in dosedependentmanner（P＜0.05）；and U251 cell apoptosis also increased in dose-dependentmanner（P＜0.05）.Compared with the control group，the levels of Caspase 3/Cleaved caspase 3，PARP/Cleaved PARPwere significantly increased in Bithinol group（P＜0.05）.JNK was activated in the U251 cells exposed to Bithinol and phosphorylation of JNK also increased.This activation of apoptosis could be reversed by the pre-treatment of SP600125.Conclusion Bithinolmay induce apoptosis in glioma cells in vitro by the activation of JNK-P-JNK signaling pathway.

Glioma cell；Bithionol；Apoptosis；c-Jun N-terninal kinase signaling pathw ay

R739.41

A

2095-378X（2015）03-0158-05

10.3969/j.issn.2095-378X.2015.03.005

JIBRILKhalifdiriye（1986—），男，索馬里人，碩士研究生

樓美清，電子信箱：loumeiqing@sina.com