三嗪類農(nóng)藥類特異性分子印跡聚合物的合成及其應(yīng)用

杜欣蔚，佘永新*，李騰飛，張艷欣，劉廣洋，王 靜*，王珊珊，金 芬，金茂俊，邵 華，鄭鷺飛，曹維強(qiáng)

(1．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081;2．廣東惠州出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢測中心，廣東 惠州 516000)

三嗪類農(nóng)藥是全世界范圍內(nèi)廣泛使用的一類除草劑，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮著重要作用。但該類除草劑具有一定的“致癌、致畸、致突變”作用，美國環(huán)保署將莠去津、西瑪津等原藥及其代謝物列入優(yōu)先控制污染物名單［1］。莠去津等三嗪類除草劑可轉(zhuǎn)化為多種降解產(chǎn)物，主要有脫乙基莠去津(DEA)、脫異丙基莠去津(DIA)、羥基化莠去津(HYA)和脫乙基脫異丙基莠去津(DEDIA)等［2］，另外，草凈津(Cyanazine)和西瑪津(Simazine)可降解生成DIA，撲滅津(Propazine)可降解生成DEA［3］。上述代謝物具有類似于原藥或高于原藥的毒性［4］，由于其在樣品基質(zhì)中多以結(jié)合狀態(tài)存在，很難用一種前處理技術(shù)快速提取、分離與富集，致使其樣品前處理過程較為繁瑣。目前報道的三嗪類農(nóng)藥的樣品前處理方法主要有基質(zhì)固相分散萃?。?－6］、凝膠滲透色譜［7］、固相萃?。?－11］等，其中固相萃取技術(shù)研究較多，但通用型的固相萃取柱缺乏選擇性，凈化效果不理想，常會發(fā)生雜質(zhì)共萃取基質(zhì)效應(yīng)［8］，從而影響后期的儀器分析結(jié)果，因此探索一種選擇性好、凈化富集能力強(qiáng)的前處理技術(shù)十分必要。

分子印跡聚合物(Molecularly imprinted polymers，MIPs)是一種具有較強(qiáng)分子識別能力的新型高分子仿生材料，具有“類抗體”的特異性、高選擇性、高強(qiáng)度等優(yōu)點(diǎn)，而且制備簡單、成本低、可重復(fù)利用，非常適合作為固相萃取柱的填料。與傳統(tǒng)的固相萃取技術(shù)相比，分子印跡固相萃取技術(shù)克服了樣品基質(zhì)復(fù)雜、預(yù)處理繁瑣等不利因素，有效提高了分析準(zhǔn)確性和靈敏度，更適用于痕量分析。目前分子印跡技術(shù)在樣品前處理中的應(yīng)用，多數(shù)僅以單一成分作為目標(biāo)物，常需要分批合成幾種分子印跡聚合物來富集多種目標(biāo)物，增加了對目標(biāo)物的提取次數(shù)和成本，不能滿足當(dāng)前多殘留檢測技術(shù)的要求。已有學(xué)者將分子印跡固相萃取應(yīng)用于蔬果［12－15］、水［16－18］、土壤［19－20］、大豆［21－22］、小米［21］、玉米［23－24］、草藥植物［25］等基質(zhì)中三嗪類除草劑的殘留量檢測，但這些方法均不能實(shí)現(xiàn)對DEA，DIA和DEDIA 3種主要代謝物的同時檢測。

本研究合成了三嗪類農(nóng)藥類特異性分子印跡聚合物，研究了聚合物的吸附性能，并將其作為填料制備分子印跡固相萃取(MIP－SPE)柱，建立了5種三嗪類農(nóng)藥(環(huán)丙津、西瑪津、特丁津、撲滅津、莠去津)及其3種主要代謝物(DEDIA，DIA，DEA)的分子印跡固相萃?。合嗌V－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法。與已有文獻(xiàn)相比，本文建立的MIP－SPE/HPLC－MS/MS方法在檢測氯代三嗪類農(nóng)藥基礎(chǔ)上，還能檢測其3種代謝物;與市售的Oasis HLB固相萃取柱相比，MIP－SPE柱對脫異丙基莠去津的回收率明顯提高，且試劑用量更少。該方法可應(yīng)用于玉米、小麥及棉花樣品中三嗪類除草劑及其代謝物的殘留檢測。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

安捷倫系列1100高效液相色譜儀，API2000串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB公司);Agilent ZORBAX RX－C8色譜柱(150 mm×2.1 mm，5 μm，安捷倫公司);Oasis HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，Waters公司);HITACHI S－4800掃描電鏡(日本日立公司);Tecnai G2 F30場發(fā)射透射電子顯微鏡(美國FEI公司)。

環(huán)丙津、西瑪津、特丁津、撲滅津、脫乙基脫異丙基莠去津、脫異丙基莠去津、脫乙基莠去津、莠去津標(biāo)準(zhǔn)品(德國Dr.Ehrenstorfer公司);三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)、乙腈、甲醇、乙酸(色譜純，Aldrich公司);甲基丙烯酸(MAA)、偶氮二異丁腈(AIBN)及其它試劑(分析純，北京百匯佳興科技有限公司);實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 模板分子與功能單體相互作用的紫外光譜

選擇甲基丙烯酸作為功能單體，在乙腈溶液中固定莠去津的濃度，加入不同體積的甲基丙烯酸，使模板與功能單體的比例分別為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，將模板與功能單體的混合液于室溫下振蕩30 min，通過紫外光譜法觀察混合溶液最大吸收波長的變化，研究模板與功能單體的相互作用機(jī)制，確定兩者之間的最佳配比。

1.3 類特異性分子印跡聚合物的合成

將模板分子莠去津溶于一定量乙腈中，加入功能單體甲基丙烯酸(與模板分子的摩爾比為1∶4)，振蕩30 min后，加入交聯(lián)劑三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(與功能單體的摩爾比為1∶1)和一定量的引發(fā)劑偶氮二異丁腈，超聲5 min，通N2除氧5 min，密封后放入60℃水浴鍋中反應(yīng)24 h。反應(yīng)完成后取出聚合物，研磨后過篩(200目)，在索氏提取裝置中用10%的乙酸甲醇洗去模板，直至用高效液相色譜法檢測不到提取液中的模板分子。

非印跡聚合物(NIPs)的制備過程與印跡聚合物(MIPs)相同，只是不加入模板分子莠去津。

1.4 印跡聚合物的吸附性能研究

分別稱取MIPs和NIPs 10 mg置于10 mL離心管中，加入3 mL不同濃度的莠去津乙腈溶液，恒溫振蕩2 h，離心取上清液，HPLC測定其濃度。根據(jù)式(1)計算 MIPs和 NIPs對不同濃度莠去津的吸附量Q(μg/g)，并繪制等溫吸附曲線。根據(jù)式(2)(Scatchard方程)計算印跡聚合物的結(jié)合常數(shù)及最大吸附量。

式中，Q為平衡時聚合物對分析物的吸附量(μg/g)，Qmax為最大表觀吸附量(μg/g)，C0為莠去津的初始濃度(mg/kg)，C為平衡時上清液中的莠去津濃度(mg/kg)，V為加入莠去津溶液的體積，M為加入聚合物的質(zhì)量，KD為平衡離解常數(shù)。

1.5 色譜－質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 安捷倫系列1100高效液相色譜儀;色譜柱:150 mm×2.1 mm×5 μm(ZORBAX RX－C8柱，Agilent);流動相A為0.1%甲酸溶液，流動相B為乙腈;梯度洗脫程序:0～2 min，25%～60%B;2～3 min，60%B;3～6 min，60%～40%B;6～7 min，40%～60%B;7～13 min，60%B;13～13.5 min，60%～25%B;13.5～20 min，25%B;流速:200 μL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:5 μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 API 2000質(zhì)譜儀(AB公司);離子源:電噴霧電離(ESI);離子源溫度:450℃;掃描方式:正離子掃描;檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;霧化氣(Gas1)壓力:30 psi;加熱輔助氣(Gas2)壓力:30 psi;氣簾氣壓力:35 psi;噴霧電壓:5.5 kV;8種三嗪類農(nóng)藥的m/z及其碰撞能量見表1。

表1 8種三嗪類除草劑的質(zhì)荷比(m/z)及其碰撞能量Table 1 m/z ratios and ion collision energies of 8 kinds of triazine herbicides

1.6 分子印跡固相萃取方法及其性能研究

稱取50 mg分子印跡聚合物，用濕法裝柱方式填裝到固相萃取空柱中，獲得分子印跡固相萃取(MIP－SPE)柱?；罨?3 mL乙腈活化，并保證乙腈在柱中未完全流干;上樣:取1 mL 8種三嗪類除草劑的乙腈溶液作為上樣液，緩慢過柱(約0.3 mL/min);淋洗:1 mL乙腈淋洗，流干;洗脫:依次用3次×1 mL甲醇和2次×1 mL乙酸－甲醇溶液(1∶9，體積比)洗脫固相萃取柱，收集洗脫液，N2吹干，1 mL乙腈再次溶解，高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測洗脫液中8種三嗪類農(nóng)藥的含量。

1.7 分子印跡固相萃取柱與Oasis HLB固相萃取柱性能的對比

參照文獻(xiàn)［8］，用Oasis HLB固相萃取柱對8種三嗪類農(nóng)藥進(jìn)行富集，8種三嗪類農(nóng)藥用甲醇－水溶液(1∶9)配制，濃度分別為10，50，100 μg/kg?；罨?5 mL甲醇和5 mL水;上樣:1 mL 8種三嗪類農(nóng)藥的甲醇－水溶液;淋洗:5 mL水，減壓抽干;洗脫:10 mL乙腈。收集洗脫液，N2吹干，1 mL甲醇－水溶液(1∶9)再次溶解，高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法檢測洗脫液中8種三嗪類農(nóng)藥的含量。

1.8 分子印跡固相萃取柱應(yīng)用于實(shí)際樣品

稱取2 g加入8種三嗪類農(nóng)藥混標(biāo)的玉米(或小麥、棉花)樣品置于50 mL具塞離心管中，加入20 mL乙腈，旋渦2 min，振蕩30 min，離心5 min(5 000 r/min)，重復(fù)提取兩次，合并上清液，再加入20 mL正己烷乙腈飽和溶液，棄去正己烷層，乙腈層用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至干后，用2 mL乙腈溶解，取1 mL待凈化。其凈化過程參照“1.6”的固相萃取方法，用LC－MS/MS進(jìn)行檢測。

圖1 莠去津和MAA相互作用的紫外光譜圖Fig.1 UV spectra of interaction between atrazine(ATR)and methacrylic acid(MAA)

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡聚合物的表征

2.1.1 模板分子與功能單體相互作用的紫外光譜分析 由于莠去津的分子結(jié)構(gòu)為三嗪環(huán)上連有2個氨基取代基及1個氯取代基，因此理論上選擇帶有羧基官能團(tuán)的甲基丙烯酸(MAA)比較合適［19，26］。從紫外光譜(圖1)可以看出，向莠去津溶液中加入功能單體甲基丙烯酸后，混合溶液的最大吸收波長位置發(fā)生了變化，說明兩者產(chǎn)生了相互作用。隨著MAA量的增加，最大吸收波長發(fā)生了藍(lán)移且藍(lán)移量亦增大;當(dāng)莠去津與MAA的摩爾比為1∶4時藍(lán)移量最大(220 nm移至211 nm)，隨著MAA的繼續(xù)增加，混合液的最大波長幾乎不變，說明更多的MAA不會增加兩者的相互作用，因此模板與功能單體的最優(yōu)比例選為1∶4。

2.1.2 印跡聚合物的形態(tài)分析 圖2為MIP和NIP的掃描電鏡(SEM)和透射電鏡(TEM)圖。由SEM圖可以看出印跡聚合物具有一定的孔穴結(jié)構(gòu)，而非印跡聚合物(NIP)的表面較光滑(圖2A，B)，這是印跡聚合物具有特異性吸附的原因;由TEM圖可以看出，本體聚合法合成的印跡聚合物和非印跡聚合物均為連接的塊狀結(jié)構(gòu)(圖2C，D)。

圖2 印跡聚合物和非印跡聚合物的掃描電鏡圖(A，B)及透射電鏡圖(C，D)Fig.2 SEM(A，B)and TEM(C，D)photographs of MIP and NIPA，C:MIP;B，D:NIP

2.2 分子印跡聚合物的吸附性能研究

2.2.1 印跡聚合物的特異性分析 圖3為莠去津MIP和NIP的等溫吸附曲線，可以看出隨著莠去津濃度的增加，MIP對莠去津的吸附量明顯高于NIP，說明MIP對莠去津是特異性吸附。

2.2.2 印跡聚合物的Scatchard方程分析 由莠去津分子印跡聚合物的Scatchard分析曲線(圖4)可見，Q/C對Q明顯呈非線性關(guān)系，這表明MIP對莠去津的結(jié)合位點(diǎn)是非均一的，但在圖的兩端均具有較好的線性關(guān)系。據(jù)此判斷，在不同的濃度范圍內(nèi)，存在著兩類不同親和性的結(jié)合位點(diǎn)。這可能是由于功能單體和印跡分子之間存在多種相互作用，可以形成多種不同組成的復(fù)合物，不同類型的復(fù)合物在聚合之后形成了具有不同性質(zhì)的作用位點(diǎn)。由兩個方程可以計算得出第一類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)KD1=2.63，理論最大吸附量Qmax1=532.49 μg/g;第二類結(jié)合位點(diǎn)的結(jié)合常數(shù)KD2=142.857，理論最大吸附量 Qmax2=6 228.85 μg/g。

圖3 莠去津MIP與NIP的等溫吸附曲線Fig.3 Isothermal adsorption curves of MIP and NIP

2.3 分子印跡固相萃取條件的優(yōu)化

為保證分子印跡聚合物空間結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)的高效識別性，選擇固相萃取過程的上樣液為莠去津乙腈溶液，進(jìn)一步研究了MIP－SPE柱的萃取條件，篩選和優(yōu)化了活化、淋洗和洗脫過程的溶劑，其結(jié)果見圖5。

圖4 莠去津分子印跡聚合物的Scatchard分析曲線Fig.4 Scatchard curve for atrazine molecualrly imprinted polymer

分別選擇乙腈、二氯甲烷和甲醇3種溶劑作為活化液，以莠去津?yàn)槿侯愞r(nóng)藥類似結(jié)構(gòu)的代表物，考察其在MIP－SPE柱上的保留效果。結(jié)果表明，當(dāng)活化液為乙腈時固相萃取柱對莠去津乙腈溶液的吸附效果最好，二氯甲烷次之，這與MIP合成溶劑為乙腈有關(guān)。進(jìn)一步考察了乙腈、二氯甲烷和水3種溶劑作為淋洗液時的洗脫效果，結(jié)果表明，乙腈不能將莠去津洗脫，而二氯甲烷和水均會不同程度地將莠去津淋洗下來，這是因?yàn)樗投燃淄榈募尤肫茐牧溯ソ蚺cMIP之間的作用力。同時考察了甲醇、10%乙酸甲醇和兩者共同作為洗脫液的洗脫效果，結(jié)果表明，3 mL甲醇可以洗脫89%莠去津，而3 mL 10%乙酸甲醇可以洗脫66%莠去津，因此最終選擇甲醇和10%乙酸甲醇共同作為洗脫液，可以洗脫97%莠去津。

圖5 莠去津分子印跡固相萃取柱萃取條件的優(yōu)化Fig.5 Optimizing extraction conditions of MIP－SPE for atrazine

2.4 MIP－SPE類特異性研究

選擇三嗪類除草劑及其代謝物混合乙腈溶液為上樣液，在上述MIP－SPE條件下進(jìn)行類特異性富集性能研究(表2)。結(jié)果表明，MIP－SPE柱對莠去津的結(jié)構(gòu)類似物氯代三嗪類農(nóng)藥及3種代謝物均有吸附，回收率均高于70%，具有較好的類特異性。

2.5 分子印跡固相萃取柱與Oasis HLB固相萃取柱性能的對比

分別選擇自制的MIP－SPE小柱與Oasis HLB柱對樣品中8種三嗪類農(nóng)藥的萃取效果進(jìn)行比對研究(結(jié)果見表2)。由表可知，在最佳的萃取條件下，Oasis HLB柱對脫異丙基莠去津的吸附效果差，對其他7種三嗪類農(nóng)藥的回收率均高于63.6%，而MIP－SPE柱是以莠去津分子印跡聚合物為填料，對莠去津及其結(jié)構(gòu)類似的氯代三嗪類農(nóng)藥表現(xiàn)出選擇性吸附性能，具有較好的萃取效果，對結(jié)構(gòu)不相似的氯代三嗪類農(nóng)藥氰草津的回收率小于20.0%(表2未列出)。同時，MIP－SPE柱萃取過程中使用的有機(jī)溶劑較少，具有較好的環(huán)保效應(yīng)。因此，本文選擇MIP－SPE柱作為檢測復(fù)雜基質(zhì)中8種氯代三嗪類農(nóng)藥及其代謝物的固相萃取柱。

表2 不同萃取柱對8種三嗪類農(nóng)藥的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 Recoveries and RSDs of 8 kinds of triazine herbicides on different extraction columns /%

2.6 回收率與精密度

分別以玉米、小麥和棉花為樣品基質(zhì)，8種三嗪類農(nóng)藥的加標(biāo)水平為10，50，100 μg/kg，采用MIP－SPE柱進(jìn)行凈化、富集，并用液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行測定，結(jié)果見表3。測得方法的回收率為61.1%～107.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=3)為2.0%～10.7%。該方法用時短，試劑用量少，回收率高，凈化效果好，可用于玉米、小麥及棉花樣品中三嗪類除草劑及代謝物的殘留檢測。

表3 實(shí)際樣品的加標(biāo)回收結(jié)果Table 3 Recoveries of 8 kinds of triazine herbicides in real samples /%

2.7 線性范圍與檢出限

將玉米空白樣品按照MIP－SPE方法凈化后進(jìn)行基質(zhì)配標(biāo)，配制濃度分別為10，25，50，100，200 μg/kg的8種三嗪類農(nóng)藥溶液，在優(yōu)化條件下進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，在10～200 μg/kg線性范圍內(nèi)8種三嗪類農(nóng)藥的濃度與其相應(yīng)的峰面積具有良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.998 1。根據(jù)最小濃度響應(yīng)的信噪比(S/N=3)計算得方法的檢出限(LOD)分別為:環(huán)丙津2.3 μg/kg、西瑪津3.3 μg/kg、特丁津2.1 μg/kg、撲滅津3.8 μg/kg、脫乙基脫異丙基莠去津8.1 μg/kg、脫異丙基莠去津3.0 μg/kg、脫乙基莠去津 1.9 μg/kg、莠去津 0.4 μg/kg。

3 結(jié)論

本文以莠去津?yàn)槟０?，甲基丙烯酸為功能單體，三羥甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯(lián)劑，采用本體聚合法制備了三嗪類農(nóng)藥及其代謝物的類特異性分子印跡聚合物。該印跡聚合物對莠去津的結(jié)構(gòu)類似物及代謝產(chǎn)物均具有良好的選擇性和吸附性。以該聚合物作為固相萃取填料制備了MIP－SPE柱，建立了8種三嗪類農(nóng)藥的分子印跡固相萃取/液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，并應(yīng)用于玉米、小麥和棉花樣品中痕量三嗪類農(nóng)藥的殘留檢測。

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