基于微流控芯片的尿酸和抗壞血酸并行電化學(xué)檢測研究*

徐 征，陸佳慶，Morimoto Ryo，劉軍山，胡帥龍

（大連理工大學(xué)遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024）

基于微流控芯片的尿酸和抗壞血酸并行
電化學(xué)檢測研究*

徐 征*，陸佳慶，Morimoto Ryo，劉軍山，胡帥龍

（大連理工大學(xué)遼寧省微納米技術(shù)及系統(tǒng)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧大連116024）

尿樣和血樣中的尿酸水平是診斷痛風(fēng)等疾病的重要指標(biāo)，傳統(tǒng)檢測方法存在時(shí)間長、需要其他輔助試劑等不足，開展了在微流控芯片上對(duì)尿酸進(jìn)行電化學(xué)檢測的研究：以碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極片為檢測單元，構(gòu)建了PDMS微流控芯片。以微流控芯片為平臺(tái)，采用微分脈沖伏安法（DPV）對(duì)尿酸和抗壞血酸分別進(jìn)行檢測，確定其原始峰值電位。最后，實(shí)驗(yàn)測試和分析比較了不同濃度尿酸和抗壞血酸對(duì)電化學(xué)檢測信號(hào)的影響。研究結(jié)果表明：用DPV法分別檢測尿酸和抗壞血酸，測得峰電流與樣品濃度均有較好的線性度；從并行檢測信號(hào)中能夠分辨出尿酸和抗壞血酸的氧化峰位；尿酸和抗壞血酸對(duì)彼此的DPV峰位無明顯影響，但對(duì)DPV電流峰值有一定抑制作用。

微流控芯片，電化學(xué)檢測，微分脈沖伏安法，尿酸

尿酸（Uric aAcid，UA）是嘌呤代謝的產(chǎn)物，正常人體尿酸約1 200 mg，負(fù)責(zé)體內(nèi)羥基自由基和單態(tài)氧的還原。但當(dāng)代謝異常等引起體內(nèi)尿酸濃度升高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致尿結(jié)石、痛風(fēng)等疾病，尿酸水平已成為診斷痛風(fēng)的重要指標(biāo)［1-3］。目前臨床上采用酶促反應(yīng)和吸收光度法測量尿酸濃度，其不足是需要多種輔助試劑和檢測時(shí)間較長［4］。電化學(xué)方法通過測定電化學(xué)氧化還原反應(yīng)中電荷傳遞來確定物質(zhì)種類和濃度，具有靈敏度高、響應(yīng)速度快等特點(diǎn)，不需要使用透鏡等光學(xué)元件［5-6］。但由于血樣和尿樣中往往存在與尿酸化學(xué)特性相近的多種抗氧化物，會(huì)對(duì)尿酸檢測信號(hào)有干擾。近年來，人們針對(duì)電化學(xué)檢測尿酸的靈敏度和特異性開展研究，發(fā)現(xiàn)利用納米材料改性電極能夠有效從樣品中測得尿酸含量。例如：Sun等通過循環(huán)伏安法并行檢測尿酸等，發(fā)現(xiàn)石墨烯/Pt復(fù)合修飾的電極在檢測特異性和線性方面優(yōu)于裸碳電極［7］。Sheng等使應(yīng)用微分脈沖伏安法（Differential pulse voltammetry，DPV）同時(shí)測試尿酸等物質(zhì)，其尿酸檢測靈敏限可達(dá)5.0 μmol·L-1［8］。

微流控技術(shù)是指在平方厘米大小的基片上集成多種功能單元，形成微流控芯片。將電化學(xué)檢測方法與微流控技術(shù)相融合，能夠減少樣品量、縮小儀器體積、提高檢測速度［9］，常用的制造微流控芯片材料包括玻璃以及各種聚合物，其中聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）在微流控芯片制造中使用最為廣泛，具有制造簡單、耐腐蝕、無毒性等優(yōu)點(diǎn)。然而，制造電化學(xué)檢測芯片需要在芯片上集成微細(xì)電極，但PDMS比表面能低（表面張力20.6 mN·m-1［10］），其熱膨脹系數(shù)也與金屬差異大（PDMS：3.1×10-6m·K-1，Pt：8.8×10-4m·K-1［11］）。這樣，通過濺射、沉積等MEMS工藝在PDMS表面制作電極極易出現(xiàn)斷裂和褶皺現(xiàn)象，器件成品率低。Qiu等研制了一種用于尿酸等電化學(xué)檢測的PDMS微流控芯片，首先對(duì)微溝道內(nèi)的樣品進(jìn)行電泳分離，然后在微溝道出口處進(jìn)行電化學(xué)檢測，對(duì)尿酸和抗壞血酸的檢測靈敏度分別為20 μmol·L-1和3.6 μmol·L-1，但芯片中的三電極體系是利用碳纖維和金屬絲構(gòu)建的，組裝復(fù)雜，電極一致性難以保證［12］。另一種解決途徑是在玻璃或其他熱塑性聚合物表面制造電極圖形，然后與具有微溝道結(jié)構(gòu)的PDMS片組合形成復(fù)合微流控芯片［13-14］，但由于電極薄膜具有百納米級(jí)的凸起厚度，這會(huì)導(dǎo)致在電極區(qū)域附近出現(xiàn)密封不完全等問題，在使用中容易產(chǎn)生氣泡和漏液。

本文針對(duì)上述問題，提出了一種利用碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極片構(gòu)建PDMS微流控芯片的新方法，通過增加中間膠合層解決了電極區(qū)域的密封問題，降低了芯片制造難度。采用DPV法在芯片中對(duì)尿酸和抗壞血酸進(jìn)行了并行測試，最后分析了抗壞血酸含量對(duì)尿酸檢測信號(hào)的影響。

1 實(shí)驗(yàn)設(shè)備及檢測方法

1.1 微流控芯片設(shè)計(jì)與制作

圖1 芯片

如圖1（a）所示，芯片由具有微溝道結(jié)構(gòu)的蓋片、含電化學(xué)檢測電極的基片和中間膠合層組成，其中微溝道寬度500 μm，反應(yīng)區(qū)寬5 mm、長1 cm，采用PDMS材料制備。采用碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極片（110CNT-GNP，Dropsens）作為電化學(xué)檢測電極，其工作電極表面修飾有碳納米管材料，起增強(qiáng)電荷傳導(dǎo)和擴(kuò)大接觸面積的作用，如圖1（a）所示，工作電極的直徑為4 mm。對(duì)電極是與工作電極間隔0.75 mm的一段圓環(huán)，它的材料是碳，參考電極為銀電極。為避免電極表面高出基片表面引起的鍵合不完全問題，本文選擇了膠合法封接芯片，膠合層采用聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（Polyethylene terephthalate，PET）雙面膠。芯片制造步驟如下：

①基片模具制造?；＞呤抢肧U8膠光刻固化成型制造的，過程如下：在拋光玻璃片上甩80 μm厚的SU8膠；前烘60分鐘（80℃）；曝光30 s（MA/BA6，SUSS MicroTec）；后烘45分鐘（80℃）；顯影去膠，得到微溝道的反模結(jié)構(gòu)?；尚危簩⒒旌暇鶆?、除氣充分的PDMS原液（Sylgard184，Dow Corning）傾倒于基片模具上，固化80分鐘（70℃），手工脫模和打儲(chǔ)液池孔，獲得基片。

②蓋片成形。將電極片相同尺寸的金屬片粘接在拋光玻璃片上形成蓋片模具，澆注PDMS原液，固化脫模，獲得蓋片。

③中間膠合層加工。利用開模工具在PET雙面膠開與檢測區(qū)域相近的通孔。

④封接。將上述部件在顯微鏡下對(duì)準(zhǔn)和加壓封接，獲得芯片，如圖1（b）所示。

1.2 電化學(xué)檢測設(shè)備與材料

尿酸在電位適宜的條件下會(huì)被氧化成尿囊素，該反應(yīng)一般看作不可逆反應(yīng)。對(duì)于抗壞血酸，它與其氧化產(chǎn)物脫氫抗壞血酸有平衡關(guān)系。然而，由于脫氫抗壞血酸和水結(jié)合后分解，會(huì)生成二酮古洛糖酸，而二酮古洛糖酸是難以還原的物質(zhì)，這樣抗壞血酸的氧化反應(yīng)也是近似不可逆的［15，16］。由于二者的電化學(xué)反應(yīng)均不可逆，采用伏安循環(huán)法并不能測到還原峰，因此本文選擇微分脈沖伏安法檢測尿酸和抗壞血酸。檢測儀器是CHI650E電化學(xué)分析儀（上海辰華），掃描電壓范圍為0.05 V～0.8 V，掃描增量為0.005 V，掃描周期為0.5 s，掃描脈沖寬度為0.05 s，掃描靈敏度為1 μA/V。樣品溶液是在PBS緩沖液基礎(chǔ)上配置的，PBS緩沖液采用磷酸二氫鈉和磷酸氫二鈉配置，pH值為3，配置溶液所用尿酸和抗壞血酸從大連美侖生物公司購買。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1 抗壞血酸和尿酸電化學(xué)特性的DPV測試

本文利用同一芯片和相同的檢測參數(shù)，分別對(duì)不同濃度的尿酸和抗壞血酸進(jìn)行檢測，首先將待測溶液注入芯片，待樣品分布基本穩(wěn)定后開始電化學(xué)掃描。

圖2是對(duì)于不同濃度的尿酸掃描檢測結(jié)果，尿酸濃度范圍為0.1 mmol·L-1～0.4 mmol·L-1?？芍耗蛩岬母叻咫娢换九c尿酸濃度無關(guān)，均保持在0.35 V左右，變化范圍在0.01 V內(nèi)。圖2顯示了是不同濃度的尿酸與氧化峰電流絕對(duì)值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，擬合可得到Ipa=4.14CUA+0.35，R=0.996（相關(guān)系數(shù)）。

圖2 不同濃度的尿酸檢測結(jié)果

圖3是對(duì)于不同濃度的抗壞血酸掃描檢測結(jié)果，抗壞血酸濃度范圍為0.01 mmol·L-1～1.00 mmol·L-1。當(dāng)濃度低于0.025 mmol·L-1時(shí)，無法分辨出有效氧化峰；抗壞血酸的高峰電位與其濃度無關(guān)，保持在0.2 V左右，變化范圍在0.04 V之內(nèi)。圖3給出了不同濃度的抗壞血酸與氧化峰電流對(duì)應(yīng)關(guān)系，擬合可得到Ipa=1.91CAA+0.63，R=0.994（相關(guān)系數(shù)）。

圖3 不同濃度的抗血壞酸檢測結(jié)果

2.2 抗壞血酸和尿酸的DPV法并行檢測

DPV法能夠檢測到不同濃度尿酸和抗壞血酸的電化學(xué)響應(yīng)，本節(jié)在兩種溶液混合條件下對(duì)其電化學(xué)特性進(jìn)行檢測。實(shí)驗(yàn)分別對(duì)不同濃度的尿酸和抗壞血酸的混合溶液檢測，將待測溶液注入芯片，在樣品分布基本穩(wěn)定后開始電化學(xué)掃描。本文對(duì)于檢測溶液調(diào)配固定尿酸濃度分別為0.1 mmol·L-1、0.2 mmol·L-1、0.3 mmol·L-1、0.4 mmol·L-1，在同種濃度尿酸溶液中改變抗壞血酸的濃度，分別從0.025 mmol·L-1到0.1 mmol·L-1不等。

從圖4可以觀察到在不同濃度的尿酸溶液中檢測中，在檢測電壓范圍內(nèi)都存在兩個(gè)明顯的峰值，且兩個(gè)峰沒有重疊。尿酸的高峰電位為0.35 V，不同濃度下高峰電位的差異在0.05 V以內(nèi)；抗壞血酸的高峰電位在0.2 V左右，隨著抗壞血酸濃度的增加，高峰電位有所增加，變化也在0.05 V之內(nèi)。與尿酸和抗壞血酸單獨(dú)檢測的結(jié)果對(duì)比，兩者的高峰電位基本不變，這說明抗壞血酸的加入對(duì)尿酸的高峰電位沒有影響，反之亦然。

并行檢測時(shí)尿酸和抗壞血酸的高峰電流差值如表1所示。對(duì)比分別對(duì)尿酸和抗壞血酸的獨(dú)立檢測的結(jié)果，尿酸的高峰電流差值從分別檢測時(shí)的1.2 μA降低到0.94 μA；抗壞血酸的高峰電流差值從分別檢測時(shí)的0.3 μA降低到0.14 μA。說明在并行檢測尿酸和抗壞血酸時(shí)，兩者的檢測信號(hào)是存在相互干擾的。尿酸的存在對(duì)抗壞血酸的檢測信號(hào)有抑制作用，在尿酸濃度為0.3 mmol·L-1時(shí)抑制效果最明顯，此外抗壞血酸的存在對(duì)尿酸的檢測信號(hào)也有抑制作用，這種作用在抗壞血酸濃度為0.075 mmol·L-1時(shí)最明顯。

圖4 尿酸和抗壞血酸并行檢測的結(jié)果

表1 尿酸和抗壞血酸的高峰電流差值

進(jìn)一步比較尿酸和抗壞血酸同時(shí)檢測時(shí)兩者高峰電流與濃度的關(guān)系，如圖5所示。

圖5

尿酸濃度與高峰電流之間呈現(xiàn)了函數(shù)關(guān)系，在各濃度抗壞血酸中，尿酸濃度與高峰電流的線性相關(guān)系數(shù)R分別為0.933、0.918、0.938、0.926，均小于0.99，表明抗壞血酸的加入對(duì)于尿酸濃度與高峰電流值之間的線性關(guān)系是有影響，當(dāng)尿酸濃度為0.1 mmol·L-1時(shí)對(duì)線性關(guān)系的影響最大。這是由于在并行檢測尿酸和抗壞血酸時(shí)，由低到高依次掃描的，而抗壞血酸的反應(yīng)電位低于尿酸，所以抗壞血酸會(huì)先反應(yīng)，其產(chǎn)物吸附于電極表面，從而部分抑制了尿酸的反應(yīng)。抗壞血酸濃度與其高峰電流值在不同濃度尿酸檢測條件下仍呈近似線性關(guān)系，不同尿酸濃度下，相關(guān)系數(shù)R都接近于1，分別為0.997、0.994、0.995、0.998，與單獨(dú)檢測抗壞血酸時(shí)的現(xiàn)象相似。但是，與單獨(dú)檢測相比，曲線的擬合斜率有波動(dòng)，從1.91分別變?yōu)?.95、4.6、1.65、2.26。

3 結(jié)論

①以碳納米管修飾的絲網(wǎng)印刷電極片為檢測單元，構(gòu)建了PDMS微流控芯片，通過增加中間膠合層解決了電極區(qū)域的密封問題。

②以微流控芯片為平臺(tái)，采用DPV法對(duì)尿酸和抗壞血酸分別進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)尿酸的氧化峰出現(xiàn)在0.35 V，而抗壞血酸的氧化峰出現(xiàn)在0.2 V。對(duì)兩種物質(zhì)，氧化峰的電位均與樣品濃度無關(guān)，而高峰電流值與樣品濃度呈現(xiàn)線性相關(guān)性。

③研究了并行檢測中尿酸和抗壞血酸的相互干擾作用，發(fā)現(xiàn)能夠從DPV掃描信號(hào)中分辨出尿酸和抗壞血酸的氧化峰位；尿酸和抗壞血酸對(duì)彼此的DPV峰位無明顯影響，但對(duì)DPV電流峰值有一定抑制作用。

本文為尿酸等人體抗氧化物質(zhì)的快速和低成本檢測提供了一種可行的方法。

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徐 征（1973-），男，河南鄭州人，博士，副研究員，1997年于吉林工業(yè)大學(xué)獲得學(xué)士學(xué)位，2000年于吉林工業(yè)大學(xué)獲得碩士學(xué)位，2004年于大連理工大學(xué)獲得博士學(xué)位，主要從事微納制造和微納流體等研究工作，xuzheng@dlut.edu.cn；

陸佳慶（1989-），女，碩士，研究方向?yàn)槲C(jī)電系統(tǒng)。

Simultaneous Electrochemical Detection of Uric Acid and Ascorbic Acid with Microfluidic Chips*

XU Zheng*，LU Jiaqing，Morimoto Ryo，LIU Junshan，HU Shuailong
（Key Laboratory for Micro/Nano Technology and System of Liaoning Province，Dalian University of Technology，Dalian Liaoning 116024，China）

Uric acid（UA）level in urine and blood serum can be used to diagnose several diseases such as gout.However conventional methods based on enzymatic reaction and colorimetric techniques require a long time and a great amount of cost for other reagents.Electrochemical detection of uric acid with microfluidic chips was developed：A PDMS microfluidic chip with a screen-printed electrode plate modified by carbon nano-tubes was fabricated.With the chip，UA and ascorbic acid（AA）were detected using differential pulse voltammetry（DPV）method.The effect of UA and AA on the electrochemical responses was experimentally investigated and analyzed.The results showed that：The oxidation peak current was proportional to the concentration of UA and AA over the detection range respectively.For simultaneous detection of UA and AA，two well-separated voltammetric peaks could be obtained in various levels of concentration.Both UA and AA had no significant effect on the position of voltammetric peak，but restrained each other’s peak currents.

microfluidic chip；electrochemical detection；differential pulse voltammetry；uric acid

O657.1；R318.08

A

1004-1699（2015）08-1103-05

??2575；7320T

10.3969/j.issn.1004-1699.2015.08.001

項(xiàng)目來源：遼寧省教育廳重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（NO.LZ2014005）中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（NO.DUT14LAB07）

2015-03-14 修改日期：2015-05-16