一例野豬感染豬瘟病例的實驗室診斷

華瑩 王慧 李濤 王開功 文明 周碧君 程振濤

（1，貴州省動物疫病預防控制中心 550008；2，貴州大學動物科學學院 550025；3，貴州省動物疫病研究室 550025）

一例野豬感染豬瘟病例的實驗室診斷

華瑩1王慧1李濤1王開功2，3文明2，3周碧君2，3程振濤2，3

（1，貴州省動物疫病預防控制中心 550008；2，貴州大學動物科學學院 550025；3，貴州省動物疫病研究室 550025）

采集兩頭臨床癥狀疑似豬瘟的病死野豬內臟組織，應用分子生物學和細菌學方法進行實驗室診斷。經細菌分離鑒定，未發(fā)現典型致病菌感染；經PCR和熒光定量RT-PCR檢測，確診該病例為豬瘟病毒感染所致。

野豬；豬瘟；實驗室診斷；PCR；熒光定量RTPCR

豬瘟（Classical swine fever，CSF） 是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種急性、熱性和高度接觸性傳染病，被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1-3]。該病在世界各地均有不同程度流行，典型特征為發(fā)病急、高熱稽留，全身廣泛性出血，腸紐扣狀潰瘍，脾臟邊緣梗死和腎密集點狀出血[4，5]。

2014年11月，貴州省某養(yǎng)豬場所飼野豬陸續(xù)出現死亡病例。病豬出現精神沉郁、厭食、消瘦，結膜潮紅，耳、四肢及腹下皮膚呈現不同程度的紫紅色。解剖病死野豬，可見全身性出血，肺臟水腫淤血，脾臟邊緣有出血性梗死灶，腎臟腫大出血及全身淋巴結腫大出血。為確診病因，對兩頭病死野豬內臟組織進行了分子生物學和細菌學檢測，最終確診為豬瘟病毒感染?，F將病例診斷情況介紹如下，以期為預控疫病流行暴發(fā)提供技術支持和診斷參考。

1 材料與方法

1.1 材料

病料采自貴州省某養(yǎng)豬場兩頭病死野豬病變內臟組織（脾臟、腎臟及淋巴結）；豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和豬瘟病毒（CSFV）RNA提取試劑盒及普通RTPCR、熒光RT-PCR擴增試劑盒，均購自北京世紀元亨有限公司；細菌分離培養(yǎng)基為實驗室制備保存。

1.2 細菌檢測

無菌采取病死野豬肝臟、脾臟、心臟進行涂片、染色、鏡檢。同時無菌操作劃線接種血清瓊脂平板培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后觀察其特征。

1.3 PRRSV、CSFV核酸檢測

1.3.1 總RNA提取

取病死野豬的脾臟、腎臟及淋巴結無菌研磨成組織勻漿液，以13000rpm離心3min。取上清液，按照世紀元亨試劑盒說明書提取病料總RNA。以針對PRRSV和CSFV的世紀元亨普通RT-PCR和熒光RT-PCR擴增試劑盒進行定性和實時定量擴增。

1.3.2 PRRSV、CSFV特異性擴增

取提取的病料總RNA，分別以針對PRRSV和CSFV的世紀元亨普通RT-PCR擴增試劑盒進行特異性擴增，擴增產物進行凝膠電泳鑒定。

1.3.3 CSFV實時定量擴增

取提取的病料總RNA，以針對CSFV的世紀元亨熒光RT-PCR擴增試劑盒進行實時定量擴增。

2 結果

2.1 細菌分離培養(yǎng)結果

無菌采取病死野豬肝臟、脾臟、心臟制成涂片，經瑞氏染色鏡檢，未見典型的致病菌。

2.2 PRRSV、CSFV特異性擴增結果

以世紀元亨PRRSV和CSFV普通RT-PCR核酸檢測試劑盒對提取的病料總RNA進行特異性擴增，擴增產物進行凝膠電泳鑒定，結果見圖1、圖2：

圖1 PRRSV特異性RT-PCR擴增結果

由圖1可知，從病死野豬組織所提基因組RNA中均未出現PRRSV特異性擴增條帶；由圖2可知，從病死野豬組織所提基因組RNA中有5份出現大小為235bp左右的CFSV特異性擴增條帶。初步表明病死野豬感染了CSF，而未感染PRRS。

圖2 CSFV特異性RT-PCR擴增結果

2.3 CSFV實時定量檢測結果

以世紀元亨CSFV通用熒光RT-PCR核酸檢測試劑盒對提取的病料總RNA進行實時定量擴增，結果見圖3。

圖3 CSF實時熒光RT-PCR擴增結果

由圖3可知，從病死豬組織所提基因組RNA中有5份出現特異性擴增曲線。

圖4 CSFV實時定量檢測結果

從圖4中可見，CT值在21.4415～26.9073范圍內。根據說明書結果判定CT值＜30且出現特異性擴增曲線，為CSF陽性，初步判定該病死豬為PRRS感染所致。

3 討論

豬瘟是我國四大動物疫病之一，至今已流行80多年，是發(fā)生最多、危害最大、流行最廣的傳染病[6-8]。據資料統(tǒng)計，近年來我國因病死亡的豬占飼養(yǎng)總數的8～10%，其中約30%是由豬瘟致死[9]，而且豬瘟的流行與發(fā)病特點發(fā)生了很大變化，在臨床表現上也更加復雜，在病理剖檢上也常常不同于典型豬瘟的病理變化，給豬瘟的臨床診斷帶來了很大困難[10]。同時CSF剖檢病變與PRRS等疾病極其相似，這給CSF的臨床診斷造成了較大困難[11]。而試驗證明應用熒光RT-PCR方法進行CSFV檢測，同時結合臨床癥狀可作出快速診斷[12，13]。熒光定量PCR具有操作簡單、結果直觀、敏感性高、特異性強、重復性好等優(yōu)點，通過此方法能夠實現定量，通過定量可以對感染狀況進行初步判斷，因而得到廣泛應用[14-16]。在國內外該技術也已用于豬瘟病毒的定量檢測[17-19]。

本實驗采用分子生物學和細菌學方法對臨床表現精神沉郁、消瘦、四肢及腹下皮膚呈現不同程度的紫紅色等癥狀病死野豬進行了病因確定性診斷。本次診斷依照農業(yè)部有關規(guī)定，對臨床疑似CSF病例進行了實施RT-PCR及熒光RTPCR雙重檢測實驗室診斷，最終確診該病例為CSF感染所致。

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華瑩（1982-），女，漢族，貴州省貴陽市人，甘肅農業(yè)大學預防獸醫(yī)學在讀博士，主要從事動物疫病病原學研究。