白血病抑制因子通過(guò)乙?；疭TAT3抑制腎間質(zhì)纖維化的研究

余 瑩， 余 晨

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院腎臟內(nèi)科，上海 200065)

?

·基礎(chǔ)研究·

白血病抑制因子通過(guò)乙?；疭TAT3抑制腎間質(zhì)纖維化的研究

余 瑩， 余 晨

(同濟(jì)大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院腎臟內(nèi)科，上海 200065)

目的 研究白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用及其機(jī)制。方法 TGF-β和(或)LIF和(或)TSA刺激腎臟成纖維細(xì)胞(NRK-49F)；TGF-β和(或)LIF刺激Stat3基因敲除細(xì)胞(MEF-Stat3-KO)；用KM小鼠建立單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction, UUO)模型，腹腔內(nèi)注射LIF后收集腎臟；用Western Blot方法檢測(cè)纖維化相關(guān)性蛋白(Col3和FN1)和乙?；疭tat3的表達(dá)，用RT-PCR方法檢測(cè)Col3和FN1的mRNA表達(dá)，用免疫組化方法檢測(cè)腎臟組織的Col3、FN1和LIFR、Stat3的沉積。結(jié)果 在NRK-49F細(xì)胞中，LIF降低TGF-β誘導(dǎo)的Col3和FN1的表達(dá)；在Stat3-KO細(xì)胞中，LIF對(duì)Col3和FN1的表達(dá)無(wú)作用。UUO腎臟中，LIFR和Stat3的表達(dá)較假手術(shù)組明顯減少，LIF注射后Col3和FN1的沉積減少。LIF刺激NRK-49F細(xì)胞15min后，乙?；疭tat3明顯增多；TSA刺激細(xì)胞后，Col3和FN1的表達(dá)降低更加明顯。結(jié)論 LIF抑制體內(nèi)外腎間質(zhì)纖維化，依賴于Stat3，其機(jī)制可能包括乙?；揎?。

白血病抑制因子; 腎間質(zhì)纖維化; 信號(hào)傳導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子3; 大鼠

白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)屬白介素-6細(xì)胞因子家族，除了具有調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)、維持胚胎干細(xì)胞多能性等作用外[1-2]，還參與調(diào)節(jié)臟器纖維化[3]。研究發(fā)現(xiàn)，LIF可降低心肌細(xì)胞的纖維化程度[4]。研究發(fā)現(xiàn)LIF可抑制血管緊張素(Angiotensin II, AngII)誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并探索了其機(jī)制可能是通過(guò)磷酸化途徑[5]，那么LIF對(duì)其他刺激誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化是否也存在抑制作用，作用機(jī)制如何，本研究將進(jìn)一步證明LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的抵抗作用，以及乙?；揎椩谄渲械淖饔?。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠腎成纖維細(xì)胞NRK-49F由美國(guó)布朗大學(xué)莊守綱教授饋贈(zèng)，小鼠胚胎成纖維細(xì)胞Stat3敲除型(MEF-Stat3-KO)由中國(guó)科學(xué)院健康所腫瘤與干細(xì)胞研究課題組秦樾教授饋贈(zèng)；細(xì)胞用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，刺激前0.5%FBS饑餓12～24h。TGF-β(2ng/ml)、LIF(2000U/L)、TSA(100nmol/L)刺激細(xì)胞后收集蛋白和RNA。

1.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

接種適當(dāng)數(shù)量的細(xì)胞于培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度能夠達(dá)到30%～50%；對(duì)于每個(gè)轉(zhuǎn)染樣品，按Lipo 2000的說(shuō)明書(shū)操作，準(zhǔn)備siRNA轉(zhuǎn)染液，6h后換正常完全培養(yǎng)液，24～48h后收集以進(jìn)行下一步檢測(cè)。

1.3 UUO模型

健康雄性清潔級(jí)昆明小鼠： 4～6周齡，約25g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分為四組： 假手術(shù)組、UUO模型組、UUO+LIF組、UUO+ 生理鹽水組，每組各6只。UUO模型建立方法參見(jiàn)[5]。LIF給予方法： 術(shù)后第1天開(kāi)始，UUO+LIF組和UUO+生理鹽水組予腹腔注射LIF(每日25mg·kg-1)或相同體積生理鹽水，共6d。手術(shù)后第7天處死小鼠，取腎組織供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)用。

1.4 Western Blot

細(xì)胞用PBS洗后裂解；腎組織剪碎后，加裂解液，用玻璃勻漿器勻漿，離心取上清上樣。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜(三明治法)，室溫封閉1h，一抗孵育(Col3： santacruz；FN1： sigma；β-actin： millpore； Stat3、ac-Stat3： CST)4℃過(guò)夜；孵育二抗，顯影，Quantity One分析灰度值，3次以上結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

Trizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，參照TOYOBO SYBR說(shuō)明書(shū)設(shè)計(jì)反應(yīng)體系，進(jìn)行PCR反應(yīng)，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，凝膠成象儀成象。

1.6 免疫組織化學(xué)

腎臟組織經(jīng)固定、脫水、透明及浸蠟處理后切為厚度為3～5mm的石蠟切片。切片經(jīng)脫蠟水化、抗原修復(fù)、去內(nèi)源性過(guò)氧化酶、封閉、孵育一抗(Col3、FN1： abcam；Stat3： CST)，生物素標(biāo)記二抗孵育，辣根過(guò)氧化物標(biāo)記的三抗孵育，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水及透明，中性樹(shù)膠封片，光鏡觀察。

1.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié) 果

2.1 LIF抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)

細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)沉積被認(rèn)為是腎間質(zhì)纖維化的主要病理改變，選用產(chǎn)生ECM的最主要細(xì)胞-大鼠成纖維細(xì)胞系-NRK-49F，選取ECM的主要成分—3型膠原蛋白(Collagen 3， Col3)和纖連蛋白(Fibronectin， FN1)作為研究指標(biāo)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β, TGF-β)是公認(rèn)的促纖維化因子[6]。在NRK-49F細(xì)胞中，TGF-β促進(jìn)Col3的蛋白表達(dá)，而同時(shí)給予LIF刺激后，Col3的蛋白表達(dá)受到抑制(圖1A、1B)；FN1(圖1A、1B)的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)相同的趨勢(shì)。TGF-β明顯上調(diào)FN1在mRNA水平的表達(dá)，而LIF可抑制這種作用(圖1C、1D)。

圖1 LIF抑制TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的表達(dá)Fig.1 LIF inhibited of TGF-β induced expression of extracellular matrix proteins予NRK-49F細(xì)胞TGF-β和(或)LIF刺激后Col3和FN1(A)的蛋白表達(dá)，以及灰度統(tǒng)計(jì)值(B)；TGF-β和(或)LIF刺激后FN1的mRNA水平的表達(dá)(C)以及半定量統(tǒng)計(jì)值(B)。n≥3，*P<0.05 vs. 對(duì)照組，#P<0.05 vs. TGF-β刺激組

2.2 UUO模型中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白增加，LIF受體減少

選擇單側(cè)輸尿管梗阻(Unilateral ureteral obstruction， UUO)的小鼠作為體內(nèi)腎間質(zhì)纖維化的模型。免疫組化染色可見(jiàn)Col3和FN1的沉積明顯增加(圖2A)，同時(shí)，LIF的受體LIFR(leukemia inhibitory factor receptor)和其下游轉(zhuǎn)錄因子Stat3的表達(dá)明顯減少(圖2B)。

2.3 LIF抑制小鼠UUO模型的腎間質(zhì)纖維化

為了研究LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用，予UUO小鼠腹腔注射LIF?？梢?jiàn)： LIF干預(yù)明顯下調(diào)UUO導(dǎo)致的Col3和FN1(圖3A)在腎小管間質(zhì)中的沉積。而LIF注射對(duì)其他臟器(心臟、肝臟、脾臟、肺臟)的形態(tài)無(wú)明顯影響(圖3B)。這些結(jié)果說(shuō)明LIF在體內(nèi)外均可抑制腎間質(zhì)纖維化。

2.4 LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用依賴核轉(zhuǎn)錄因子Stat3

研究發(fā)現(xiàn)LIF對(duì)AngII誘導(dǎo)的腎間質(zhì)纖維化的抵抗作用依賴于其下游核轉(zhuǎn)錄因子Stat3(signal conduction and activation of transcription 3)，使用TGF-β刺激，進(jìn)一步確定Stat3在LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化中的作用。首先，在Stat3敲除的MEF細(xì)胞(Stat3-/-)中觀察到TGF-β仍可誘導(dǎo)Col3和FN1的表達(dá)，而LIF的抑制作用消失(圖4A、B)。進(jìn)一步，在NRK-49F細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-Stat3，觀察到Stat3的表達(dá)明顯下調(diào)(圖4C、D)，再給予細(xì)胞TGF-β和(或)LIF刺激后，如同MEF細(xì)胞中觀察到的一樣，TGF-β對(duì)Col3和FN1的誘導(dǎo)作用存在，而LIF的抑制作用則消失了(圖4E、F)。這部分結(jié)果進(jìn)一步證明了Stat3在LIF對(duì)抗腎間質(zhì)纖維化作用的信號(hào)通路中的關(guān)鍵作用。

圖2 UUO模型中細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、LIF受體和Stat3表達(dá)情況Fig.2 The expression of extracellular matrix proteins, LIF receptor and Stat3 in UUO modelA： 特異性抗Col3和FN1免疫組化染色(400x)；B： 特異性抗LIFR和Stat3免疫組化染色(400x)

圖3 LIF對(duì)UUO模型的作用Fig.3 The effect of LIF in UUO modelA： 特異性抗Col3和FN1的免疫組化染色；B： LIF處理前后UUO模型的心臟、肝臟、脾臟和肺臟的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)(H-E)

圖4 LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用依賴核轉(zhuǎn)錄因子Stat3Fig.4 The effect of LIF on renal interstitial fibrosis was dependent on the nuclear transcription factors-Stat3Stat3基因敲除的MEF細(xì)胞經(jīng)TGF-β和/或LIF刺激后，Col3的蛋白表達(dá)水平(A)，以及灰度值統(tǒng)計(jì)分析(B)。NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染對(duì)照si-RNA(si-control)或Stat3的siRNA(si-Stat3)后檢測(cè)Stat3的蛋白表達(dá)(C)，并做灰度值統(tǒng)計(jì)分析(D)。NRK-49F細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-Stat3后，予TGF-β和/或LIF刺激后，Col3和FN1的蛋白表達(dá)水平(E)，以及灰度值統(tǒng)計(jì)分析(F)。 n≥3，*P<0.05 vs. 對(duì)照組

2.5 LIF誘導(dǎo)Stat3乙?；?/p>

除了磷酸化修飾，乙?；揎椩谛盘?hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中也發(fā)揮重要的作用。觀察到： LIF刺激細(xì)胞后，核轉(zhuǎn)錄因子Stat3發(fā)生乙酰化修飾(圖3)： 在NRK-49F細(xì)胞中，給予LIF刺激5min，15min，30min，60min，120min 后，觀察到在LIF刺激15min 和30min時(shí)出現(xiàn)明顯的乙?；疭tat3條帶，60min和120min時(shí)稍微減弱，但仍較無(wú)刺激組條帶明顯(圖5)。

2.6 乙?；揎梾⑴cLIF抑制腎間質(zhì)纖維化作用

組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶(histone acetylation transferase, HATs)和組蛋白去乙?；?histone acetylation enzyme, HDACs)之間的平衡調(diào)節(jié)蛋白的乙酰化狀態(tài)。使用HDAC特異性抑制劑-TSA(Trichostation A)刺激細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)： TSA+TGF- β-+LIF組的Col3和FN1的表達(dá)較TGF-β-+LIF組的更加減少(圖6)，說(shuō)明TSA可加強(qiáng)LIF對(duì)TGF-β-誘導(dǎo)的ECM的抑制作用。

圖5 LIF誘導(dǎo)Stat3乙?；疐ig.5 LIF induced the acetylation of Stat3NRK-49F細(xì)胞中，LIF刺激不同時(shí)間后Stat3的685位點(diǎn)賴氨酸的乙酰 化化變化(A)以及灰度分析(B)，n≥3，*P<0.05 vs. 0min 組

圖6 TSA加強(qiáng)LIF對(duì)TGF-β誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)的抑制作用Fig.6 TSA strengthened the inhibition of LIF on TGF-β-induced of extracellular matrix expression予NRK-49F細(xì)胞TGF-β和(或)LIF刺激后，或同時(shí)加TSA刺激，檢測(cè)Col3和FN1的蛋白表達(dá)水平(A)以及FN1的mRNA表達(dá)(C)，并做灰度值統(tǒng)計(jì)分析(B、D). TGF-β刺激組*P<0.05，TGF-β+LIF刺激組#P<0.05

3 討 論

LIF具有維持胚胎干細(xì)胞的多能性、促進(jìn)子宮內(nèi)膜蛻膜化、調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)等多種生物功能[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)LIF可調(diào)節(jié)臟器纖維化。LIF可促進(jìn)心肌成纖維細(xì)胞增殖，明顯減少膠原蛋白表達(dá)，同時(shí)抑制成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞[9]。實(shí)驗(yàn)觀察到LIF抑制AngII誘導(dǎo)的ECM表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)選擇促纖維化因子TGF-β處理細(xì)胞，觀察到LIF對(duì)TGF-β導(dǎo)致的ECM表達(dá)亦存在抑制作用，說(shuō)明LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用是廣泛的，而非AngII特異性的。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)方面，在UUO模型的腎臟組織中觀察到LIFR表達(dá)明顯增多，提示LIF通過(guò)其受體LIFR參與調(diào)節(jié)腎間質(zhì)纖維化的形成；進(jìn)一步，UUO小鼠注射LIF后，腎間質(zhì)纖維化的程度減輕，而不影響其他重要臟器的形態(tài)。

之前的實(shí)驗(yàn)[5]認(rèn)為L(zhǎng)IF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的作用主要通過(guò)Stat3，但是Stat3為AngII和LIF的共同下游核轉(zhuǎn)錄因子，不能排除LIF是通過(guò)AngII而作用于Stat3的，選擇下游為主要為非Stat3的TGF-β進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)中，Stat3表達(dá)缺失或下調(diào)后，TGF-β的作用仍存在，而LIF的作用消失，這更加證明LIF對(duì)抗腎間質(zhì)纖維化的作用是依賴Stat3的。

近年來(lái),文獻(xiàn)報(bào)道稱，乙?；揎椩谀I間質(zhì)纖維化形成過(guò)程中占有重要的地位。在較早以前，乙?；揎椞刂附M蛋白的乙?；揎棧瑢儆诒碛^遺傳修飾的一種，但是越來(lái)越多的研究表明，除了組蛋白外，其他蛋白質(zhì)也可以發(fā)生乙?；揎?。Eugene Chin教授等[10-11]首次發(fā)現(xiàn)報(bào)道了： 細(xì)胞膜的細(xì)胞因子受體與細(xì)胞漿內(nèi)STATs，不僅發(fā)生磷酸化，還發(fā)生乙酰化修飾。發(fā)現(xiàn)Stat3 685位點(diǎn)賴氨酸是重要的乙酰化位點(diǎn)，在調(diào)節(jié)腫瘤生長(zhǎng)中具有重要的作用。

本實(shí)驗(yàn)觀察到， LIF刺激可誘導(dǎo)其下游Stat3發(fā)生乙酰化修飾；在給予TGF-β+LIF刺激的同時(shí)給予TSA刺激后觀察到ECM蛋白水平下降較TGF-β+ LIF組更加明顯。TSA是HDAC的抑制劑，可增加細(xì)胞乙酰化修飾的水平。TSA增加了LIF抗腎間質(zhì)纖維化的作用，即提示乙酰化修飾參與LIF的作用。文獻(xiàn)報(bào)道，TSA可抑制肺臟、肝臟、心臟等的纖維化[12-13]，說(shuō)明乙?；揎棇?duì)纖維化的重要作用。結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道相符合： HDAC抑制劑可明顯減輕腎間質(zhì)纖維化的程度[14-15]。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)觀察到LIF抑制TGF-β誘導(dǎo)的ECM蛋白表達(dá)，LIF抑制UUO模型中的ECM沉積；Stat3表達(dá)下調(diào)后，LIF的作用消失；LIF誘導(dǎo)Stat3發(fā)生乙?；揎?，而乙?；降纳险{(diào)增強(qiáng)LIF的作用。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了LIF對(duì)腎間質(zhì)纖維化的抑制作用，至少部分是通過(guò)乙?；疭tat3完成的。

[1] 李明堂，付玉，閆東君. LIF： 一種多功能的細(xì)胞因子[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué),2007,11(7)： 987-990.

[2] Suman P, Malhotra SS, Gupta SK. LIF-STAT signaling and trophoblast biology[J]. J Stat, 2013,2(4)： e25155.

[3] Berry MF, Pirolli TJ, Jayasankar V, et al. Targeted overexpression of leukemia inhibitory factor to preserve myocardium in a rat model of postinfarction heart failure[J].J Thorac Cardiovasc Surg, 2004,128(6)： 866-875.

[4] Masato K, Toshio N, Toshinao T, et al. Leukemia inhibitory factor enhances endogenous cardiomyocyte regeneration after myocardial infarction[J]. Plos One, 2016,11(5)： e0156562.

[5] Yu Y, Wang Y, Niu Y, et al. Leukemia inhibitory factor attenuates renal fibrosis through Stat3-miR-29c[J]. Am J Physiol Renal Physiol, 2015,309(7)： F595-603.

[6] 芮煒瑋,易祥華.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1及相關(guān)細(xì)胞因子在肺纖維化發(fā)生中的作用[J]，同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)： 醫(yī)學(xué)版,2010,31(3)： 133-136.

[7] Salleh N, Giribabu N. Leukemia inhibitory factor： roles in embryo implantation and in nonhormonal-contraception[J]. The Scientific World J, 2014,2014： 201514.

[8] Yue X, Wu L, Hu W. The regulation of leukemia inhibitory factor[J]. Cancer Cell Microenviron, 2015,2(3)： e877.

[9] Wang F, Trial J, Diwan A, et al. Regulation of cardic fibroblast cellular function by leukemia inhibitory factor[J]. J Mol Cell Cardiol, 2002,34(10)： 1309-1316.

[10] Tang X, Gao JS, Guan YJ, et al. Acetylation-dependent signal transduction for type I interferon receptor[J]. Cell, 2007,131, 93-105.

[11] Yuan ZL, Guan YJ, Chatterjee D, et al. Stat3 dimerization regulated by reversible acetylation of a single lysine residue[J].Science, 2005,307(5707)： 269-273.

[12] Sanders YY, Tollefsbol TO, Varisco BM, et al. Epigenetic regulation of thy-1 by histone deacetylase inhibitor in rat lung fibroblasts[J].Am J Respir Cell Mol Biol, 2011,45(1)： 16-23.

[13] Dai Q, Liu J, Du Y, et al. Histone deacetylase inhibitors attenuate P-aIgA1-induced cell proliferation and extracellular matrix synthesis in human renal mesangial cells in vitro[J]. Acta Pharmacol Sin, 2016,37(2)： 228-234.

[14] Yoshikawa M, Hishikawa K, Marumo T, et al. Inhibition of histone deacetylase activity suppresses epithelial-to-mesenchymal transition induced by TGF-beta1 in human renal epithelial cells[J]. J Am Soc Nephrol, 2007,18： 58-65.

[15] Imai N, Hishikawa K, Marumo T, et al. Inhibition of histone deacetylase activates side population cells in kidney and partially reverses chronic renal injury[J]. Stem Cells, 2007,25： 2469-2475.

Inhibitory of renal interstitial fibrosis by acetylation of STAT3 with white cell inhibitor

YUYing,YUChen

(Dept. of Nephrology, Tongji Hospital, Tongji University, Shanghai 200065, China)

Objective To investigate the effect of leukemia inhibitory factor(LIF) on renal interstitial fibrosis and its mechanism. Methods Renal fibroblasts(NRK-49F) were stimulated with TGF-beta and/or LIF, and/or TSA. Stat3 gene knockout cells(MEF-Stat3-KO) were stimulated with TGF-beta and/or LIF. Unilateral ureteral obstruction(UUO) was induced in KM mice and kidneys were collected after intraperitoneal injection of LIF. Western Blot method was used to detect protein expression of collagen 3, fibronectin and acetylated Stat3. RT-PCR method was used to detect mRNA expression of collagen 3 and Fibronectin, and immunohistochemical method was used to detect protein deposition of collagen 3, fibronectin, LIFR and Stat3 in kidney tissue. Results In NRK- 49F cells, LIF inhibited TGF-beta-induced Col3 and FN1 expression. In Stat3-KO cells, LIF had no effect on the expression of Col3 and FN1. In UUO kidney, the expression of LIFR and Stat3 decreased significantly compared with that in the control group; after injection of LIF, the deposition of Col3 and FN1 reduced. After stimulation with LIF for 15min, acetylated Stat3 in NRK-49F cells increased significantly. TSA stimulation reduced the expression of Col3 and FN1 more markedly. Conclusion LIF can inhibit renal interstitial fibrosis bothinvitroandinvivo, which may be associated with the acetylation of Stat3.

Leukemia inhibitory factor; renal interstitial fibrosis; signal conduction and activation of transcription 3; rat

10.16118/j.1008-0392.2016.06.009

2016-08-05

國(guó)家自然科學(xué)基金(81370790、81600523)

余 瑩(1986—)，女，住院醫(yī)師，碩士研究生.E-mail： tongjiyuying@126.com

余 晨.E-mail： yuchen@#edu.cn

R 692.5

A

1008-0392(2016)06-0047-07