海南島南藥根結(jié)線蟲種類鑒定

符美英, 曾向萍, 芮 凱, 陳綿才

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護研究所, 海南省植物病蟲害防控重點實驗室， 海口 571100)

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海南島南藥根結(jié)線蟲種類鑒定

符美英, 曾向萍, 芮 凱, 陳綿才*

(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)環(huán)境與植物保護研究所, 海南省植物病蟲害防控重點實驗室， ?？?571100)

運用比較形態(tài)學(xué)、同工酶和mtDNA-PCR對采自海南島9個市縣的南藥根結(jié)線蟲進行種類鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有南方根結(jié)線蟲、象耳豆根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲和西班牙根結(jié)線蟲等5種根結(jié)線蟲危害海南島南藥。5種根結(jié)線蟲均能在海巴戟上寄生與危害,而南方根結(jié)線蟲寄主非常廣泛,可危害大多數(shù)調(diào)查的藥用植物。

南藥植物; 根結(jié)線蟲; 鑒定; 線粒體DNA

南藥原指東南亞和非洲等地所產(chǎn)的藥材。我國部分地區(qū)由于氣候條件優(yōu)越,有南藥的異種、近緣種生長,蘊藏著豐富的藥材資源。海南島是我國兩大南藥生產(chǎn)基地之一,有藥用植物資源3 000多種,其中南藥30多種[1]。隨著南藥的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展,很多南藥植物得到了大規(guī)模種植,但是由于根結(jié)線蟲病的危害,對這些藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)均造成較大程度的影響。

根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)是一類種類多、分布廣、寄主廣泛和危害極大的植物寄生性線蟲。據(jù)有關(guān)資料報道,目前已描述的根結(jié)線蟲有90多個種,廣泛分布于世界各地,在35°S和35°N之間的地區(qū)分布最多[2]。在我國熱帶和亞熱帶地區(qū),根結(jié)線蟲病發(fā)生普遍,其種類大多是常見的4種根結(jié)線蟲:南方根結(jié)線蟲(Meloidogyneincognita)、花生根結(jié)線蟲(M.arenaria)、爪哇根結(jié)線蟲(M.javanica)和北方根結(jié)線蟲(M.hapla),據(jù)近幾年的調(diào)查,象耳豆根結(jié)線蟲(M.enterolobii)已上升為我國南方常見根結(jié)線蟲。根結(jié)線蟲涉及寄主超過3 000種植物,分屬于114個科。一般造成農(nóng)作物減產(chǎn)10%～20%,嚴重的達75% 以上。常見的4種根結(jié)線蟲最具有經(jīng)濟重要性,在根結(jié)線蟲所引起的整個栽培作物的損失中,它們造成的損失占90%以上[3]。根結(jié)線蟲對部分南藥的危害非常大,對南藥的產(chǎn)量和品質(zhì)造成較大程度的影響,如海巴戟,調(diào)查顯示?？?、萬寧、定安、儋州等地種植的海巴戟都嚴重感染根結(jié)線蟲病,植株發(fā)病率達90%以上。

根結(jié)線蟲在進入南藥植物根系后,能引起寄主植物的一系列病變,如使根部細胞過度分裂、膨大,使根部畸形、腫大,形成結(jié)狀物、瘤狀物;根結(jié)線蟲危害初期,南藥植物地上部癥狀不明顯,隨著根結(jié)線蟲的繁衍,受害的根系增多,地上部逐漸呈現(xiàn)出生長不良,長勢衰弱,葉片從下往上逐漸呈現(xiàn)黃化、無光澤,葉片稀少,受害嚴重時,植株葉片脫落,最終黃化枯死[4]。由于根結(jié)線蟲病的危害,南藥藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴重的影響,經(jīng)濟損失巨大,生產(chǎn)者的積極性受到挫傷。因此本研究對海南南藥進行調(diào)查采樣,并對根結(jié)線蟲進行種類鑒定,為南藥植物的育種和根結(jié)線蟲病的防治打下良好的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 根結(jié)線蟲病調(diào)查及樣本采集

在2013年2-7月,分4次分別從海南島的?？?、定安、萬寧等9個市縣的30個南藥產(chǎn)區(qū),用跳躍式的方法,采集南藥植物根系及根周圍5～20 cm深的耕作層土壤,涉及南藥寄主有海巴戟、益智、檳榔、胡椒、高良姜、沉香、丁香、長春花等8種。采集時用5點取樣法,樣品用塑料袋包裝并保濕,同時在標(biāo)簽和記錄本上簡要注明采集時間、地點、寄主名稱、土壤類型和前茬作物等。挖取植株側(cè)根,觀察根部癥狀,根據(jù)根結(jié)的有無判定植株是否發(fā)病,統(tǒng)計發(fā)病率;依據(jù)根結(jié)分級標(biāo)準(zhǔn)[5],記載田間植株的發(fā)病程度。根結(jié)分級標(biāo)準(zhǔn)為:0級,無根結(jié);Ⅰ級,有少數(shù)根結(jié);Ⅱ級,大部分根上有根結(jié);Ⅲ級,在根結(jié)上有再次根結(jié);Ⅳ級,根結(jié)互相連結(jié)成為根結(jié)團塊。

1.2 種群純化保存

在解剖鏡下,將田間采集的根結(jié)線蟲原始種群接種在空心菜嫩根上,產(chǎn)卵后選取色澤黃、大而飽滿的優(yōu)質(zhì)單卵塊,接種到預(yù)先培養(yǎng)在消毒土壤中的空心菜幼嫩根尖部,在大棚中培養(yǎng)約42～56 d,適當(dāng)澆水,注意保持土壤濕度,澆水時防止線蟲被水沖淋到土壤下層,每隔20～30 d施復(fù)合肥1次。

1.3 形態(tài)學(xué)鑒定

取所采線蟲種群的成熟雌蟲,置于透明硬塑料板的蒸餾水滴中,用手術(shù)刀切下會陰部角質(zhì)膜,用單根豬鬃制成的小毛筆將雜物清除干凈并修剪成小的方形,將其移到載玻片上,做成臨時標(biāo)本在光學(xué)顯微鏡下觀察會陰花紋特征并拍照,會陰花紋觀察比較參照劉維志[6]。每個種群觀察10～20頭。

1.4 同工酶分析

運用常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù),對根結(jié)線蟲純化種群雌蟲的酯酶進行電泳分析。電泳分析采用北京六一儀器廠生產(chǎn)的DYY-6B型電泳槽,7%分離膠和4%濃縮膠,膠厚1.0 mm,每孔加入10條純化培養(yǎng)的年輕雌蟲酶提取物,酯酶染色參照胡凱基[7]的方法。以已鑒定的爪哇根結(jié)線蟲樣本作為參照系。

1.5 分子生物學(xué)鑒定

1.5.1 DNA提取

參照萬新龍的方法[8]稍作改進,用挑針將單頭根結(jié)線蟲雌蟲從根結(jié)中挑出,放入200 μL的PCR管中;用槍吸取8 μL 的滅菌水置PCR管中,并用槍頭將線蟲蟲體戳破,內(nèi)含物溢出;再加入2 μL的5×裂解buffer(10×PCR buffer與1 000 μg/mL的蛋白酶K,按1∶1的體積比混合);將PCR管轉(zhuǎn)移到-70 ℃冰箱中,冷凍30 min;將冷凍后的PCR管放置到PCR儀中,65 ℃ 1 h,95 ℃ 10 min;掌上離心機瞬時離心,上清液用于PCR擴增或放置-20 ℃冰箱中備用。

1.5.2 PCR擴增

參考廖金鈴[9]的方法,采用引物#C2F3(5′-GGTCAATGTTCAGAAATTTGTGG-3′)和#1108(5′-TACCTTTGACCAATCACGCT-3′),分別擴增位于線粒體DNA中的COⅡ基因和lrRNA基因。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。對23個根結(jié)線蟲純化種群進行mtDNA-PCR擴增。采用25 μL反應(yīng)體系:引物各1.0 μL,dNTP混合物0.5 μL(每一核苷酸為10 mmol/L),Mg2+1.5 μL, 10×PCR緩沖液2.5 μL,Taq酶0.5 μL,模板DNA 2.0 μL,無菌水ddH2O 16 μL。反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性4 min,然后94 ℃變性1 min,55 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,反應(yīng)共35個循環(huán),72 ℃延伸10 min。

取10 μL PCR產(chǎn)物在濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠上檢測所擴增片段的大小,在凝膠成像系統(tǒng)照相和保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 根結(jié)線蟲危害情況和種群情況

從海南島?？凇⑽牟?、瓊海等9個市縣的南藥種植區(qū)調(diào)查并采集,涉及寄主8種,發(fā)現(xiàn)有些南藥植物如海巴戟、沉香和長春花嚴重感染根結(jié)線蟲病,其正常生長受到影響,產(chǎn)量降低,造成了一定的經(jīng)濟損失。所調(diào)查的30個南藥種植地塊中有23個地塊感染根結(jié)線蟲病,田塊發(fā)病率為76.7%。其中海巴戟受根結(jié)線蟲危害最嚴重,調(diào)查顯示所有的海巴戟種植地都嚴重感染根結(jié)線蟲病,植株發(fā)病率達90%以上,根結(jié)指數(shù)為Ⅱ級以上,見表1。

表1 南藥根結(jié)線蟲種類和種群危害情況

2.2 會陰花紋觀察

南方根結(jié)線蟲:會陰花紋變異較大,一般背弓高;花紋明顯呈橢圓形或方形,背弓頂部圓或平,有時呈梯形,背紋緊密,背面和側(cè)面的花紋從波浪形至鋸齒形,有時平滑,側(cè)區(qū)常不清楚,側(cè)紋常分叉。

爪哇根結(jié)線蟲:會陰花紋在群體內(nèi)變異很大,通常為橢圓形至圓形,形成一個套一個的同心圓,背弓低到高,線紋平滑、細密、連續(xù),有明顯的側(cè)線,很少有線紋通過側(cè)線,也有些種群的側(cè)線不明顯。

花生根結(jié)線蟲(酯酶為A2):會陰花紋變異較大,花紋明顯呈橢圓形,一般背弓扁平到圓形,大多時候弓上的線紋在側(cè)線處分叉,有明顯的側(cè)線,有線紋通過側(cè)線,背面和側(cè)面的花紋從波浪形至鋸齒形,側(cè)紋常分叉,有時紋斷續(xù)并分叉;有些種群沒有側(cè)線。

花生根結(jié)線蟲(酯酶為A1):會陰花紋較圓,一般背弓低到中等,圓形,線紋波浪狀明顯,有時候弓上的線紋在側(cè)線處分叉,有明顯的側(cè)線,有線紋通過側(cè)線,背面和側(cè)面的花紋從波浪形至鋸齒形,側(cè)紋常分叉。

西班牙根結(jié)線蟲:會陰花紋卵圓形至長方形,背弓通常較低,少數(shù)較高,背紋由纖細多波浪至平滑,腹面線紋通常細弱平滑,側(cè)線明顯多分叉,尾端和陰門區(qū)無線紋。

象耳豆根結(jié)線蟲:會陰花紋近卵圓形,一般背弓低到中高,線紋細,由平滑至波浪狀,尾尖區(qū)環(huán)紋不規(guī)則,側(cè)線不明顯,腹區(qū)環(huán)紋較平緩和細密。會陰花紋變化較大。

2.3 同工酶分析結(jié)果

對純化培養(yǎng)的23個根結(jié)線蟲種群的年輕雌蟲的酯酶進行電泳分析(見圖2)。經(jīng)同工酶的特異性染色后,23個種群中,有11個種群的酯酶譜型為I2型,與已報道的南方根結(jié)線蟲相同;有4個種群的酯酶譜型為J3型,與已報道的爪哇根結(jié)線蟲相同;有2個種群的酯酶譜型為A2型,1個種群的酯酶譜型為A1型,與已報道的花生根結(jié)線蟲的兩種譜型相同;有1個種群的酯酶譜型為S2-M1型,與已報道的西班牙根結(jié)線蟲相同;有4個種群的酯酶譜型為VS1-S1型,確定為象耳豆根結(jié)線蟲(見表2)。

圖1 南藥根結(jié)線蟲會陰花紋Fig.1 The perineal pattern of Meloidogyne spp.

圖2 南藥植物根結(jié)線蟲種群酯酶電泳圖Fig.2 Electrophoretogram of esterases (Est) in five Meloidogyne spp. on southern herbs

2.4 分子生物學(xué)分析

用引物#C2F3和#1108對純化培養(yǎng)的23個根結(jié)線蟲種群的COⅡ和lrRNA基因間序列進行擴增,結(jié)果見圖3。南方根結(jié)線蟲的11個種群的擴增片段為1.7 kb;爪哇根結(jié)線蟲的4個種群的擴增片段為1.7 kb;花生根結(jié)線蟲的2個種群(酯酶表型為A2)的擴增片段為1.1 kb,1個種群(酯酶表型為A1)的擴增片段為1.7 kb;西班牙根結(jié)線蟲的1個種群的擴增片段為1.7 kb;象耳豆根結(jié)線蟲的4個種群的擴增片段為0.7 kb。

3 結(jié)論與討論

本研究在30個南藥種植點調(diào)查了8種主要南藥植物根結(jié)線蟲病,采集樣本經(jīng)純化培養(yǎng)獲得23個根結(jié)線蟲純化種群。通過運用比較形態(tài)學(xué)、同工酶分析和分子生物學(xué)分析相結(jié)合的方法對海南島南藥植物上的23個根結(jié)線蟲純化種群進行鑒定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個種群為南方根結(jié)線蟲,4個種群為爪哇根結(jié)線蟲,2個種群為花生根結(jié)線蟲(酯酶表型為A2),1個種群為花生根結(jié)線蟲(酯酶表型為A1),1個種群為西班牙根結(jié)線蟲,4個種群為象耳豆根結(jié)線蟲,由此可見南方根結(jié)線蟲是海南島南藥植物優(yōu)勢根結(jié)線蟲;其次為爪哇根結(jié)線蟲和象耳豆根結(jié)線蟲。與1994年吳影梅[10]等人報道不同之處是多了象耳豆根結(jié)線蟲和花生根結(jié)線蟲。在最近幾年的跟蹤調(diào)查中,發(fā)現(xiàn)象耳豆根結(jié)線蟲在海南不僅危害南藥,還嚴重危害海南島的瓜菜類作物?；ㄉY(jié)線蟲(酯酶表型A1)在南藥植物上屬首次發(fā)現(xiàn),在我國其他作物上也比較少見,本次調(diào)查發(fā)現(xiàn)花生根結(jié)線蟲(酯酶表型A1)對海巴戟的危害非常嚴重,根結(jié)指數(shù)為Ⅲ級,嚴重影響海巴戟的生長。

圖3 南藥植物根結(jié)線蟲種群COⅡ和lrRNA基因間序列PCR擴增Fig.3 PCR amplified mtDNA of Meloidogyne spp. on southern herbs

在根結(jié)線蟲的形態(tài)分類中,會陰花紋的分類價值一直被認為是最高的[11],但同一種根結(jié)線蟲的不同種群的變異非常大,因此要求研究人員要有非常豐富的經(jīng)驗[12]。研究顯示,花生根結(jié)線蟲(酯酶表型A1)在中國非常罕見,其主要特征是酯酶為罕見的A1型,會陰花紋特征也非常明顯,會陰花紋的線紋波浪狀明顯和側(cè)線粗大等特征是其所特有的。同工酶特別是酯酶和蘋果酸脫氫酶是根結(jié)線蟲分類鑒定的一種重要手段,但是這一方法需要活力旺盛的雌蟲[13]。本研究也證實了酯酶作為分類鑒定的重要輔助手段的實用性和準(zhǔn)確性。我們采用酯酶成功地區(qū)分了以上幾種根結(jié)線蟲,它們所產(chǎn)生的譜帶都有所不同,南方根結(jié)線蟲的譜型為I2型,爪哇根結(jié)線蟲的譜型為J3型,花生根結(jié)線蟲的譜型為A2型和罕見的A1型,西班牙根結(jié)線蟲的譜型為S2-M1型,象耳豆根結(jié)線蟲的譜型為罕見的VS1-S1型。南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲、花生根結(jié)線蟲(A1)和西班牙根結(jié)線蟲的COⅡ和lrRNA基因間序列PCR擴增結(jié)果均為1.7 kb,所以單靠這種方法進行鑒定非常困難。因此,形態(tài)學(xué)、同工酶和分子生物學(xué)相結(jié)合的鑒定方法在根結(jié)線蟲分類鑒定中已經(jīng)得到國際上的公認[12]。

南藥植物受根結(jié)線蟲的危害非常嚴重,其中尤以海巴戟受害最重,以上5種根結(jié)線蟲均能危害海巴戟,發(fā)病率高達90%以上,根結(jié)指數(shù)Ⅱ級以上。由于根結(jié)線蟲病是一種隱蔽性強的植物病害,不易被及時發(fā)現(xiàn),所以病害的發(fā)生往往使南藥的產(chǎn)量和品質(zhì)受到重大影響。因此,應(yīng)當(dāng)進一步廣泛、深入地開展南藥植物根結(jié)線蟲病的研究,為南藥育種和南藥根結(jié)線蟲病防治提供技術(shù)支持。

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(責(zé)任編輯：王 音)

Species identification of the root-knot nematode on southern herbs in Hainan Province

Fu Meiying, Zeng Xiangping, Rui Kai, Chen Miancai

(Institute of Environment & Plant Protection, Hainan Academy of Agricultural Sciences, Hainan Key Laboratory for Control of Plant Diseases and Insect Pests, Haikou 571100, China)

The root-knot nematodes collected from southern herbs of nine cities in Hainan Province were identified by using morphological characteristics, isoenzyme technology and mtDNA-PCR method.Meloidogyneincognita,M.javanica,M.arenaria,M.hispanicaandM.enterolobiiwere found on southern herbs. These identified five root knot nematodes could parasitize onMorindaofficinalisand cause serious economic loss, whileM.incognitawas the predominant species and could be found on most investigated herbs.

southern herbs; root-knot nematode; identification; mitochondrial DNA

2014-07-03

2014-09-09

海南省中藥現(xiàn)代化專項(ZY201322)；海南省自然科學(xué)基金(312081)

S 435.67

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2015.04.033

* 通信作者 E-mail: chenmiancai@163.com