細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞治療惡性腫瘤安全性分析①

侯俊杰 劉 多 倪志強(qiáng) 周 穎 楊 影 方艷秋 譚 巖

(吉林省人民醫(yī)院腫瘤生物治療中心，長(zhǎng)春 130021)

腫瘤的免疫治療現(xiàn)已成為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種全新的治療模式，隨著腫瘤臨床治療的發(fā)展，腫瘤免疫治療方法受到廣泛的關(guān)注，被Science雜志評(píng)選為2013年10項(xiàng)重大突破性成果之首［1］。細(xì)胞免疫治療為腫瘤免疫治療的一種，目的是通過調(diào)動(dòng)機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境抗腫瘤免疫力，從而控制和殺傷腫瘤細(xì)胞。細(xì)胞免疫治療可有效防治惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)腫瘤患者生存時(shí)間、提高生活質(zhì)量，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，是無法進(jìn)行手術(shù)及放化療的中晚期腫瘤患者首選治療方案［2］。CIK細(xì)胞是一種經(jīng)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)形成的具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性的NK樣T細(xì)胞，其克服了淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞 (LAK)、腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞(TIL)等細(xì)胞增殖能力差、對(duì)腫瘤細(xì)胞毒性低的缺點(diǎn)，能滿足臨床治療的要求，因此臨床上得到了廣泛應(yīng)用［3］。但針對(duì)CIK細(xì)胞治療相關(guān)不良反應(yīng)的系統(tǒng)報(bào)道較少。本文對(duì)1 240例自體CIK細(xì)胞治療的患者進(jìn)行回顧性分析，結(jié)果顯示此方法耐受性良好，但仍有患者出現(xiàn)輕重不一的不良反應(yīng)，亦存在潛在的醫(yī)療風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)此報(bào)告如下

1 資料與方法

1.1 臨床資料 回顧2013年5月～2015年9月我院腫瘤生物治療研究中心收治的1 240例惡性實(shí)體腫瘤患者，男性 679例，女性 561例，年齡 16～95歲，平均68歲。均經(jīng)病理診斷確診為惡性腫瘤，并除外自身免疫性疾病的患者，其中肺癌287例，胃癌153例，結(jié)直腸癌145例，肝癌134例，乳腺癌90例，其他腫瘤430例?；颊咝蠧IK治療前經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)通過，并簽定治療知情同意書，細(xì)胞單采前患者行全身評(píng)估，包括基本生命體征記錄(體溫、呼吸、脈搏、血壓)，常規(guī)指標(biāo)檢查:血常規(guī)、肝腎功能、血凝、心電圖。

1.2 CIK細(xì)胞的制備 采集外周血單個(gè)核細(xì)胞、經(jīng)Ficoll淋巴分離液梯度離心(2 000 r/min×30 min)，取白膜層的單個(gè)核細(xì)胞，0.9%NaCl注射液洗滌3次后懸浮在RPMI1640(Gibco?，Invitrogen公司，美國(guó))中，5%CO2、37℃孵箱中放置2 h，調(diào)整非貼壁細(xì)胞密度為2×106ml－1，用含10%胎牛血清(EXCE LL?生物公司，上海)的初始培養(yǎng)基在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，并在培養(yǎng)基中添加IFN-γ 1 000 U/ml和rhIL-2 1 000 U/ml(均購(gòu)自北京雙鷺?biāo)帢I(yè)有限公司，北京)以及50 ng/ml抗人CD3單克隆抗體(T＆L生物公司，北京)。每2 d按照細(xì)胞濃度添加新鮮培養(yǎng)基及rhIL-2(1 000 U/ml)，培養(yǎng)至7 d后收集細(xì)胞，細(xì)胞存活率在95%以上。在符合GLP標(biāo)準(zhǔn)的無菌實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)配制成CIK細(xì)胞懸液，采血后培養(yǎng)每天抽取培養(yǎng)上清，檢測(cè)細(xì)菌、真菌、支原體、解脲及內(nèi)毒素等，所有樣本檢測(cè)結(jié)果為陰性。

1.3 CIK細(xì)胞的回輸 均采用患者自身的外周血細(xì)胞經(jīng)體外擴(kuò)增后回輸，對(duì)CIK細(xì)胞上清液進(jìn)行了病原微生物及細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，檢測(cè)合格后，以靜脈輸液的方法連續(xù)6次回輸治療，總量達(dá)到至少10×1010個(gè)細(xì)胞，每次回輸后均需應(yīng)用生理鹽水沖洗瓶壁及輸液管壁，避免瓶壁殘留，保證細(xì)胞足數(shù)量回輸。

1.4 不良反應(yīng)觀察 觀察并記錄CIK細(xì)胞治療前后及治療過程中患者有無發(fā)熱、寒戰(zhàn)、惡心、嘔吐、皮疹、嗜睡、乏力、血壓變化、呼吸困難、關(guān)節(jié)疼痛、胸悶等不良反應(yīng);記錄心電圖變化;記錄肝腎功能、心功能、自身抗體等變化。對(duì)有不良反應(yīng)者，給予相應(yīng)對(duì)癥處理。高熱患者均行血常規(guī)及血培養(yǎng)檢查，除外感染因素。

2 結(jié)果

2.1 CIK治療不良反應(yīng)發(fā)生及外周血免疫指標(biāo)情況 其中362(29.2%)例出現(xiàn)不良反應(yīng)，其中肺癌78例，胃癌41例，結(jié)直腸癌38例，肝癌41例，乳腺癌31例，其他腫瘤133例，不良反應(yīng)發(fā)生率的高低腫瘤發(fā)病率之間未見顯著相關(guān)性，見表1。常見乏力、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、關(guān)節(jié)疼痛、全`身炎性反應(yīng)綜合征，少見消化道癥狀、急性過敏樣反應(yīng)、皮疹、心絞痛等，未見腫瘤溶解綜合征及感染，其中部分患者可同時(shí)具有乏力、發(fā)熱、寒戰(zhàn)、關(guān)節(jié)痛等復(fù)合癥狀，具體見表2、3。治療后外周血淋巴細(xì)胞免疫表型分析:CD3+、CD3+CD4+表達(dá)上調(diào)，CD3+CD8+表達(dá)下調(diào)，CD4+/CD8+及NK(%)表達(dá)上調(diào)，見表4。

2.2 CIK治療常見不良反應(yīng)發(fā)生 (1)乏力:乏力為最常見癥狀，具有主觀性，伴隨整個(gè)療程，不影響日常生活，一般于治療結(jié)束后24～48 h內(nèi)自然恢復(fù)，無需特殊處置。(2)發(fā)熱:發(fā)熱是CIK細(xì)胞治療中常見且突出的不良反應(yīng)，發(fā)生率為7.25%，一般在CIK細(xì)胞回輸后2～12 h出現(xiàn)體溫升高(37.3～41.7℃)，多數(shù)可自行緩解，持續(xù)大約 2～8 h，少數(shù)患者需服用解熱藥物緩解高熱癥狀。低熱患者應(yīng)多飲水，物理降溫為主，如外用退熱貼，同時(shí)查血常規(guī)，除外感染可能;持續(xù)高熱者(＞38.5℃)，給予藥物降溫聯(lián)合退熱藥物，如口服布洛芬或肛塞消炎痛栓等，并查血常規(guī)、血培養(yǎng)等，待除外感染。本回顧分析:首次輸注CIK細(xì)胞至第6療程結(jié)束患者發(fā)熱例數(shù)(百分比，n=1 240)分別為 90(7.25%)、101(8.10%)、110(8.90%)、182(14.70%)、186(15.00%)、186(15.00%)，發(fā)現(xiàn)第4療程時(shí)發(fā)熱患者比例顯著升高，4～6療程患者發(fā)熱數(shù)進(jìn)入平臺(tái)期，見圖1。(3)關(guān)節(jié)疼痛:多與發(fā)熱、寒戰(zhàn)癥狀同時(shí)出現(xiàn)，一般在輸注后第2天誘發(fā)關(guān)節(jié)疼痛，可伴發(fā)于治療全程，治療結(jié)束后24～48 h自然消退，癥狀明顯者應(yīng)用非甾體類抗炎藥可緩解，如阿司匹林腸溶片。(4)消化道不適:12例患者回輸CIK細(xì)胞過程中出現(xiàn)上消化道不適癥狀，主要表現(xiàn)為食欲下降、腹脹、輕度腹瀉，無明顯腹痛，CIK細(xì)胞輸注結(jié)束2～3 d后可自行緩解，無需特殊處置。(5)全身炎癥反應(yīng)綜合征樣反應(yīng):一般在回輸后1～2 h內(nèi)相繼出現(xiàn)寒戰(zhàn)、高熱，本分析測(cè)得腋下溫度在38.0～40.3℃之間，多數(shù)體溫在39.0℃以內(nèi)，心率 ＞90次/min，呼吸 ＞20次/min，四肢末端皮溫相對(duì)低。查血培養(yǎng)陰性，血常規(guī):白細(xì)胞、中性粒細(xì)胞升高，淋巴細(xì)胞數(shù)下降。腎功能:尿素氮和或肌酐升高，C-反應(yīng)蛋白升高。電解質(zhì):血清鈣、磷下降。經(jīng)過補(bǔ)液、抗過敏、抗炎等對(duì)癥處理，36例患者于30～90 min內(nèi)緩解，1例120 min后癥狀緩解。37例患者于再次輸注CIK細(xì)胞治療前30 min行預(yù)處理(如應(yīng)用抗過敏、抗炎等藥物)，可有效預(yù)防上述癥狀，CIK細(xì)胞輸注結(jié)束48～72 h復(fù)查上述指標(biāo)均恢復(fù)正常。

表1 腫瘤類型與CIK治療不良反應(yīng)發(fā)生的相關(guān)性Tab.1 Correlation between tumor type and incidence of adverse reactions of CIK therapy

表2 CIK治療的常見不良反應(yīng)Tab.2 Common adverse reactions of CIK therapy

表3 CIK治療的少見不良反應(yīng)Tab.3 Rare adverse reactions of CIK therapy

表4 CIK治療前后外周血免疫指標(biāo)變化(%)Tab.4 Changes of immune parameters in peripheral blood of CIK therapy(%)

圖1 發(fā)熱與療程數(shù)的相關(guān)性Fig.1 Association of fever and therapeutic courses

2.3 CIK治療的少見不良反應(yīng) (1)皮疹:發(fā)生1例，于回輸后第2天出現(xiàn)，為扁平蕁麻樣皮疹，壓之褪色，呈散在片狀分布，軀干四肢均可見，無皮損發(fā)生，給予撲爾敏抗組胺藥物治療后2 h皮疹消失。(2)急性過敏樣反應(yīng):本統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)1例，在輸注CIK細(xì)胞輸注過程中出現(xiàn)高熱、寒戰(zhàn)、顏面浮腫、呼吸急促、聲音嘶啞、心悸。查體:血壓無明顯下降，眼瞼浮腫，口唇及四肢端發(fā)紺，咽部充血，第一心音亢進(jìn)，雙肺滿布哮鳴音，呼氣相延長(zhǎng)，四肢端厥冷。給予緊急吸氧、多功能監(jiān)護(hù)、抗過敏(腎上腺素、地塞米松)、補(bǔ)液等對(duì)癥治療后約2 h后緩解，24 h后恢復(fù)正常，終止CIK細(xì)胞生物治療。(3)心絞痛:本分析出現(xiàn)發(fā)熱伴心絞痛1例，表現(xiàn)為左心前區(qū)不適，放射至左肩胛部，有發(fā)悶感，心電圖:心率96次/min，V1～V6導(dǎo)聯(lián)ST-T壓低，心肌酶正常，舌下含服硝酸甘油2 min后上述癥狀緩解，心電圖恢復(fù)正常。之后CIK細(xì)胞治療過程中，行預(yù)處理發(fā)熱、舌下含服硝酸甘油、口服丹參滴丸治療，未再發(fā)心絞痛，規(guī)范完成CIK細(xì)胞生物治療。

3 討論

據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，目前全世界每年約有新發(fā)惡性腫瘤病例1 000萬，其中每年約600～700萬人死亡，而在我國(guó)，根據(jù)國(guó)家癌癥登記中心《2012年中國(guó)腫瘤登記年報(bào)》公布的信息顯示:中國(guó)每年新增癌癥患者312萬左右，日確診病例數(shù)8 550人，即每分鐘有6人被診斷為惡性腫瘤，而且該數(shù)字在持續(xù)激增，并呈現(xiàn)年輕化，發(fā)病率及死亡率呈走高趨勢(shì)，惡性腫瘤成為威脅人們生命的頭號(hào)殺手。傳統(tǒng)的腫瘤治療方案，如手術(shù)、放療及化療等，均因存在治療禁忌、復(fù)發(fā)耐藥、多器官組織毒性等多因素限制了傳統(tǒng)方案的臨床應(yīng)用，且嚴(yán)重影響了患者生活質(zhì)量，不能滿足患者臨床需求［4］;靶向治療藥物的異軍突起，為腫瘤治療帶來了新的曙光，然而分子靶向藥物靶點(diǎn)單一，療效維持時(shí)間較短，最終均因耐藥無效而復(fù)發(fā)，少數(shù)患者則因無法耐受靶向治療藥物的毒性被迫終止治療，亦使疾病未控而進(jìn)展，即靶向治療存在一定局限性。因此，亟待開發(fā)出一種耐受性良好、療效顯著且可維持治的抗腫瘤方法。腫瘤過繼免疫療法中的CIK細(xì)胞生物治療，具有清除微小腫瘤殘留病灶、降低腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率、提高放化療療效及降低其不良反應(yīng)、改善患者生活質(zhì)量、延長(zhǎng)生存期等，無療程及總劑量限制，是傳統(tǒng)治療方案的強(qiáng)有力補(bǔ)充，在腫瘤綜合治療中起著重要的作用［5］，臨床小樣本統(tǒng)計(jì)顯示該治療方法安全［6］，但缺乏大樣本回顧性分析。

本中心回顧性分析顯示，乏力為最常見癥狀，主觀性較強(qiáng)，不影響日常生活及完成治療。乏力原因?yàn)榧?xì)胞因子等炎癥介質(zhì)所致，無需特殊處置。CIK細(xì)胞生物治療中常見且突出的副作用為發(fā)熱、寒戰(zhàn)，機(jī)體發(fā)熱為外源性致熱源及內(nèi)源性致熱源所致，在CIK制備過程中及回輸前我們均進(jìn)行了外源微生物的檢測(cè)，排除了污染的可能，出現(xiàn)發(fā)熱后及時(shí)對(duì)剩余的細(xì)胞行細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)，亦除外了感染因素，所以，內(nèi)源性致熱源為導(dǎo)致該發(fā)熱直接因素。分析出現(xiàn)發(fā)熱的可能原因?yàn)榛剌數(shù)腃IK細(xì)胞可分泌大量的炎癥介質(zhì)，如 IL-2、IL-6、IFN-γ、腫瘤壞死因子(TNF)、粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)等，這些因子恰是內(nèi)源性致熱源，其通過血腦屏障，直接作用于下丘腦體溫調(diào)節(jié)中樞，將溫度調(diào)定點(diǎn)上移，引起體溫升高，導(dǎo)致發(fā)熱，甚至寒戰(zhàn)，由于首次輸注CIK細(xì)胞時(shí)，炎癥介質(zhì)量少，機(jī)體可將其自然代謝，所以可以解釋首次輸注CIK細(xì)胞后并不是所有的患者都發(fā)熱，且多數(shù)發(fā)熱可自行緩解，無需特殊處置。機(jī)體在致熱源不清除情況下，體溫調(diào)定點(diǎn)不下移，熱不能自然退去［7］，所以隨著CIK細(xì)胞輸注療程增加發(fā)熱比例上升。一般情況下，患者需要連續(xù)輸注CIK細(xì)胞4～6療程，所以表現(xiàn)為4～6療程時(shí)發(fā)熱患者比例升高，與本統(tǒng)計(jì)結(jié)果相符。CIK細(xì)胞分泌的大量炎癥介質(zhì)，既是內(nèi)源性致熱源，又是其發(fā)揮抗腫瘤作用及調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)必不可少的細(xì)胞因子［8，9］，所以目前發(fā)熱、寒戰(zhàn)癥狀根本上是不可避免的，必要時(shí)可以給予解熱鎮(zhèn)痛藥對(duì)癥處置。

生理狀態(tài)下細(xì)胞因子在人體液中的濃度較低，但大量產(chǎn)生和分泌會(huì)使機(jī)體的免疫反應(yīng)增強(qiáng)，病例中出現(xiàn)的發(fā)熱、皮疹、關(guān)節(jié)疼痛、消化道不適、全身反應(yīng)綜合征樣反應(yīng)等癥狀均與靜脈回輸CIK細(xì)胞后體內(nèi)細(xì)胞因子上調(diào)密切相關(guān)［10］，是出現(xiàn)復(fù)合癥狀的直接因素。此外，某些細(xì)胞因子，尤其是TNF-α，是導(dǎo)致炎性介質(zhì)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的始發(fā)因子，具有核心作用，能介導(dǎo)其他細(xì)胞因子如IL-6、IL-4等的釋放，呈級(jí)聯(lián)樣激活，介導(dǎo)細(xì)胞炎性反應(yīng)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞的活化、聚集，出現(xiàn)多組織器官損傷。如果TNF-α的劑量過大可引發(fā)典型的全身炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)，有可能進(jìn)展為多器官功能障礙綜合征［11］。我們觀察的病例中有10例出現(xiàn)類SIRS樣反應(yīng)，未進(jìn)展至多器官功能障礙綜合征，經(jīng)積極補(bǔ)液、抗過敏、抗炎等對(duì)癥處理，患者72 h內(nèi)基本恢復(fù)正常。其中12例患者回輸過程中出現(xiàn)上消化道不適癥狀，主要表現(xiàn)為食欲下降、飽脹感，偶伴輕度腹瀉，持續(xù)2～3 d，CIK細(xì)胞輸注結(jié)束2～3 d后可自行緩解，無需特殊處置，上述癥狀與CIK細(xì)胞輸注具有相關(guān)性，但具體機(jī)制仍不明確。同時(shí)細(xì)胞因子分泌失衡在皮疹的病理及生理過程中發(fā)揮重要的作用［12］，所以皮疹可為CIK細(xì)胞輸注后少見不良癥狀之一。

CIK細(xì)胞輸注后出現(xiàn)的急性過敏樣反應(yīng)可歸因于T細(xì)胞、激肽系統(tǒng)、補(bǔ)體系統(tǒng)的激活，本研究中首次輸注CIK細(xì)胞發(fā)生急性過敏樣反應(yīng)1例，由于再次接觸過敏源可導(dǎo)致過敏激發(fā)，存在誘發(fā)效應(yīng)器官功能衰竭的可能，故終止治療。

本研究發(fā)現(xiàn)發(fā)熱伴心絞痛患者1例，給予舌下含服硝酸甘油處置后2 min癥狀緩解，心電圖恢復(fù)正常。之后CIK細(xì)胞治療過程中，行預(yù)處理發(fā)熱、舌下含服硝酸甘油、口服丹參滴丸治療，未再發(fā)心絞痛，規(guī)范完成CIK細(xì)胞生物治療?；颊甙l(fā)熱時(shí)心率增快，心輸出力量增大，增加了心臟做功及耗氧量，誘發(fā)了心絞痛發(fā)生，存在發(fā)生心肌梗死的風(fēng)險(xiǎn)。腫瘤患者通常不會(huì)因?yàn)樾穆试龈叨霈F(xiàn)心絞痛，多見于同時(shí)存在心臟基礎(chǔ)疾病者，如冠狀動(dòng)脈粥樣硬化、缺血性心肌病者，因此在輸注CIK細(xì)胞生物治療前需對(duì)患者行相關(guān)心臟疾病篩查，對(duì)高?；颊咝谐案深A(yù)，以便完成治療。

綜上所述，CIK細(xì)胞回輸后出現(xiàn)的不良反應(yīng)，其中全身炎癥反應(yīng)綜合征、急性過敏樣反應(yīng)、心絞痛等少見的不良反應(yīng)需要緊急對(duì)癥處理，其余無需特殊治療，除急性過敏樣反應(yīng)以外，其余不良反應(yīng)并不影響患者的后續(xù)治療，不良反應(yīng)發(fā)生率遠(yuǎn)低于放化療治療，說明此療法較安全，但是亦存在少見的潛在風(fēng)險(xiǎn);本回顧性分析未發(fā)生腫瘤溶解綜合征、感染等不良反應(yīng)，但不能除外無該不良反應(yīng)發(fā)生的可能;本文提及的CIK細(xì)胞治療后出現(xiàn)的不良反應(yīng)及處理方法可供參考;為降低常見不良反應(yīng)的發(fā)生，在CIK細(xì)胞單采前對(duì)患者行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，在CIK細(xì)胞回輸時(shí)可給予個(gè)體化的預(yù)防措施，使廣大患者群獲益。

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