戊型肝炎病毒Ch-S-1株全長體外轉(zhuǎn)錄載體的構(gòu)建及表達(dá)初步研究

朱光澤 李一權(quán) 蘭 添 范園園 張諾娜 胡寧寧 邢 彬 尹秀英 李 霄 金寧一

(長春中藥大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，長春 130021)

病毒性肝炎是一個全球性的健康問題，尤其是HEV引起的戊型肝炎[1,2]。戊型肝炎病毒(HEV)為單鏈RNA，無包膜病毒，屬于肝炎病毒屬肝炎病毒科[3-6]。以往的研究提出了四種HEV的傳播途徑，分別為糞-口傳播，食源性傳播，輸血和母嬰垂直傳播[7]。戊型肝炎病毒感染可導(dǎo)致長期的凝血和膽汁淤滯并且還與孕婦死亡有關(guān)[8-10]。雖然孕婦的死亡率很高[5]，但值得一提的是在男性和非妊娠婦女也觀察到了死亡率[11]。在孕婦中的高死亡率原因尚不明確，也沒有具體的治療方法。利用肝炎病毒(HEV)促進(jìn)疾病進(jìn)展的細(xì)胞蛋白質(zhì)和途徑仍然不明。這些都?xì)w根于HEV難以分離及純化，同時缺乏穩(wěn)健的戊型肝炎病毒(HEV)細(xì)胞感染培養(yǎng)系統(tǒng)，阻礙了對HEV生物學(xué)的理解。

有研究表明，在HepG2等傳代細(xì)胞系中轉(zhuǎn)染HEV RNA能使其進(jìn)行復(fù)制并組裝成擁有感染力的子代病毒，但缺乏有效感染這些細(xì)胞系的能力[12]。還有研究表明，采用天然病毒SAR55株感染HepG2等細(xì)胞系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HepG2細(xì)胞能低效感染病毒，并可作為病毒中和試驗(yàn)細(xì)胞模型[13]。但是HepG2 并不能用來獲得大量純化的戊肝病毒。這些因素都限制了HEV感染機(jī)制的研究。

對于研究病毒分子結(jié)構(gòu)及功能最有效的方法是反向遺傳技術(shù)。該技術(shù)主要包含兩個關(guān)鍵點(diǎn)：首先是全長cDNA的構(gòu)建及分子操作；其次是cDNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及特性鑒定。目前，對于HEV的宿主尚不清楚，實(shí)驗(yàn)室僅有少數(shù)原代細(xì)胞及傳代細(xì)胞系對其較為敏感，同時用細(xì)胞培養(yǎng)該病毒時不產(chǎn)生病變。因而需要進(jìn)行對HEV與其全長cDNA敏感細(xì)胞的篩選，探索病毒的培養(yǎng)條件和增殖及表達(dá)規(guī)律，并建立適宜的分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測方法。

本研究中所使用的HEV Ch-S-1株是我們從吉林地區(qū)某豬屠宰場分離得到的基因Ⅳ型HEV毒株，并已完成對其全基因組序列測定并登錄GenBank(登錄號：EF077630)。本研究根據(jù)已測定的全序列建立了擴(kuò)增HEV長片段cDNA的重疊PCR方法，同時，利用反向遺傳技術(shù)，進(jìn)一步構(gòu)建出了HEV-Ch-S-1株的全長cDNA克隆，并轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞對其表達(dá)進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1菌種、載體和試劑 HEV Ch-S-1株由本實(shí)驗(yàn)室分離并保存。HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存。所用載體pGEM-T Easy Vector購自Promega公司。pBluescript SK+載體為本室保存。TaKaRa LA PCRTM Kit Ver.2.1(PCR擴(kuò)增試劑盒)購自TaKaRa公司，TRlzol Reagent Total RNA Isolation Reagent購自Invitrogen公司， Lipofecta mineTM2000 Transfection Reagent購自 Invitrogen 公司。體外轉(zhuǎn)錄采用Promega公司的T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System-T7試劑盒。

1.2重疊PCR獲得HEV全長PCR產(chǎn)物 根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已測定的HEV全序列，及已擴(kuò)增純化的ORF1和ORF2 PCR產(chǎn)物[15]，設(shè)計(jì)重疊PCR引物，用重疊PCR方法拼接獲得HEV 全基因組cDNA。其中在全長擴(kuò)增的上游引物5′RU中加入BamHⅠ酶切位點(diǎn)、一個鳥嘌呤以增加轉(zhuǎn)錄后RNA的穩(wěn)定性和感染性，5′RU、5′RD及ORF1之間有35和26 bp的序列互補(bǔ)重疊，ORF1和ORF2有53 bp互補(bǔ)重疊序列，下游引物3′R中加入一個EcoR V酶切位點(diǎn)。引物具體序列見表1。

表1 基因組重疊PCR引物

表2 基因組RNA的體外轉(zhuǎn)錄鑒定引物

1.3HEV基因組全長cDNA體外轉(zhuǎn)錄載體pKS-HEV的構(gòu)建 將上述獲得的PCR產(chǎn)物連接到pMD 18-T載體上測序。測序正確后，使用BamHⅠ-EcoR V雙酶切，回收片段，插入到pKS載體的BamHⅠ-EcoR V多克隆位點(diǎn)之間，最終獲得pKS-HEV。具體過程如圖1。

1.4基因組RNA的體外轉(zhuǎn)錄及其鑒定 使用T7 RiboMAXTM Express Large Scale RNA Production System試劑盒進(jìn)行基因組RNA的體外轉(zhuǎn)錄?；蚪MRNA的體外轉(zhuǎn)錄后使用已設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行RT-PCR鑒定。體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物不經(jīng)反轉(zhuǎn)錄而直接用ORF2片段的套式引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增作對照，確定DNA模板是否完全降解，以排除DNA污染的可能(引物見表2)。

1.5基因組RNA的細(xì)胞轉(zhuǎn)染及傳代 HEV 基因組RNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞采用脂質(zhì)體法：HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在6孔板中(3×105個/ml)，24 h后，將混勻及孵育好的脂質(zhì)體與基因組RNA加入到細(xì)胞板內(nèi)。10%FCS 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)72 h，然后更換2% FCS 1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)72 h，之后按1∶1比例重復(fù)傳代細(xì)胞。

1.6多聯(lián)免疫捕獲RT-nPCR和套式PCR鑒定 傳代3、5、8次以后，用同批次對照組和試驗(yàn)組細(xì)胞進(jìn)行PCR鑒定，對照設(shè)兩組陰性對照，包括同批未轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA的RT-nPCR陰性對照及轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA的直接PCR陰性對照(用于排除DNA污染的可能性)。試驗(yàn)組進(jìn)行轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA的RT-PCR鑒定及M引物多聯(lián)免疫捕獲RT-nPCR鑒定。

圖1 HEV基因組全長cDNA體外轉(zhuǎn)錄載體pKS-HEV的構(gòu)建Fig.1 Construction of in vitro tHEV full length cDNA

1.7間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA) 將3、5、8代轉(zhuǎn)染基因組RNA的細(xì)胞傳至玻片上培養(yǎng)。取出玻片，用PBS液沖洗三次，100%冷丙酮固定10～30 min，再用PBS液洗滌三次；用含有3% BSA的PBS封閉2 h，沖洗三次，每次5 min；加入一抗(豬抗HEV血清)，37℃作用2 h后，沖洗3次；加入二抗(異硫氰熒光素標(biāo)記羊抗豬IgG，含0.05%的伊文斯藍(lán))，室溫避光作用1h，沖洗3次；吸干，滴加50%甘油水溶液，倒置于載玻片上，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1HEV ORF1 和ORF2片段的PCR擴(kuò)增 獲得了136-5035位和4982-7175位的末端有54 bp重疊的兩個目的片段(圖2～4)。

2.2重疊PCR擴(kuò)增結(jié)果 如圖5所示，獲得了7278bp目的條帶。

2.3pMD18-T-HEV重組子的引物HE-2和HE-6擴(kuò)增鑒定 如圖6所示，出現(xiàn)了大小為7 040 bp的正向陽性重組子。

圖2 覆蓋基因組2個cDNA重疊片段Fig.2 Two overlaping cDNA fragments covering genome

圖3 ORF1引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 RT-nPCR resultes for Ch-S-1 of ORF1 segmentsNote: 1.DL2000 DNA marker；2.λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA marker;3.RT-nPCR product amplified with set ORF1 primers;4.Negative control.

圖4 ORF2引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 RT-nPCR result for Ch-S-1 of ORF2 segmentsNote: 1.DL2000 DNA marker;2.RT-nPCR product amplified with set ORF2 primers;3.Negative control.

圖5 HEV ch-S-1株的重疊PCR引物擴(kuò)增結(jié)果Fig.5 Genome splicing overlap extension PCR resulte for Ch-S-1 strainNote: 1.λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA marker;2.DL2000 DNA marker;3.ORF1 PCR product;4.Genome splicing overlap extension PCR product;5.ORF2 PCR product.

圖6 pMD18-T-HEV重組子PCR鑒定結(jié)果Fig.6 PCR verification results for Plasmid pMD18-T-HEVNote: 1.DL2000 DNA marker;2.Negative control;3.PCR product by HE-2 and HE-6;4.λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA marker.

2.4基因組RNA的體外轉(zhuǎn)錄、模板去除、純化后RT-PCR和PCR鑒定結(jié)果 見圖7。

2.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA RT-nPCR和套式PCR鑒定結(jié)果 見圖8。

2.6染細(xì)胞的間接免疫染色鑒定結(jié)果 如圖9所示，試驗(yàn)組熒光照片中可以清楚地看到細(xì)胞和細(xì)胞核的形態(tài)(第八代時沒有用伊文斯藍(lán)對細(xì)胞核染色所以只能看到細(xì)胞輪廓)，在細(xì)胞漿及核周圍呈兩綠色熒光。陰性對照組僅看到了經(jīng)伊文斯藍(lán)染色成暗紅色的細(xì)胞核，個別非典型著色點(diǎn)，而無法看到整個細(xì)胞形態(tài)。這一現(xiàn)象正是因?yàn)樵诩?xì)胞漿和細(xì)胞核附近聚集了病毒顆?；虿《鞠嚓P(guān)表達(dá)產(chǎn)物，被熒光抗體特異性染色后而呈現(xiàn)的形態(tài)特征。

圖7 基因組RNA的體外轉(zhuǎn)錄PCR鑒定結(jié)果Fig.7 RT-PCR and nested-PCR analysis of in vitro transcript Genome RNANote: 1.λ-EcoT14 Ⅰ digest DNA marker;2.DL2000 DNA marker;3.RT-nPCR product by HE;4.PCR product by HE;5.RT-nPCR product by M;6.PCR product by M;RT-nPCR product by L;8.PCR product by L.

圖8 轉(zhuǎn)染細(xì)胞總RNA RT-nPCR和套式PCR鑒定Fig.8 RT-PCR and nested-PCR analysis of transfec-ted cellsNote: 1.Control cells RT-nPCR product by M;2.Transfected cells RNA nested-PCR product by L;3.Transfected cells RNA RT-nPCR product by L;4.Transfected cells RNA nested-PCR product by M;5.Transfected cells RNA RT-nPCR product by M;6.Transfected cells RNA nested-PCR product by HE;7.Transfected cells RNA RT-nPCR product by HE;8.λ-EcoT14 I digest DNA marker;9.DL2000 DNA marker.

圖9 轉(zhuǎn)染細(xì)胞HepG2的間接免疫熒光抗體染色Fig.9 Transfected cell HepG2 Stained by indirect fluorescent antibodyNote: A，B，D，E，G，H.The results of transfection RNA genome with HepG2 cells;C，F(xiàn)，I.Control.

3 討論

由于RNA易降解，對其直接進(jìn)行一系列操作非常困難，通常要將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA進(jìn)行下一步操作，所以RT-PCR成為了RNA病毒分子生物學(xué)研究的技術(shù)基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的反轉(zhuǎn)錄酶(如AMV、M-MLV等)有較強(qiáng)的RNase H活性，限制了RT-PCR擴(kuò)增片段的長度(一般很難超過3 kb)，這種限制對于研究較大基因組RNA病毒帶來了困難。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，對RNase H活性部位進(jìn)行點(diǎn)突變獲得了一系列無RNase H活性的反轉(zhuǎn)錄酶(如SuperScriptTMⅡ，SuperScripTMⅢ、 M-MlV RNase K、ThermoScriptTMⅡ等)，這大大增加了RT-PCR擴(kuò)增片段的長度[14]。長鏈RT-PCR技術(shù)的發(fā)展，使得一次性擴(kuò)增10 kb以上的病毒基因組cDNA成為了可能。使得RNA病毒分子生物學(xué)研究有了長足的進(jìn)步。

本研究中，構(gòu)建pKS-Ch-S-1株全長cDNA時，為了方便連接和用于體外轉(zhuǎn)錄獲得全基因組RNA，在基因組cDNA的5′端插入了BamHⅠ酶切位點(diǎn)，同時為了增加轉(zhuǎn)錄后RNA穩(wěn)定性和感染性，在基因組cDNA的5′端插入了一個鳥嘌呤G。T7 RNA聚合酶啟動子后端加入了一段非病毒序列，也是為了增加轉(zhuǎn)錄后RNA穩(wěn)定性和感染性。為了產(chǎn)生精確的基因組3′末端，我們在基因組cDNA的3′端插入了EcoR V和BamHⅠ兩個酶切位點(diǎn)。

由于HEV在細(xì)胞和組織中含量較低，RT-PCR在通常情況下很難擴(kuò)增并檢測到目的片段，本實(shí)驗(yàn)中，多數(shù)情況下使用HE、M和L等 RT-nPCR引物進(jìn)行了RT-nPCR擴(kuò)增。所擴(kuò)增出的三個片段代表了HEV全長基因組、ORF2和ORF1基因，所擴(kuò)增出的產(chǎn)物均具有代表性。

由于HEV不產(chǎn)生蝕斑，我們無法看到細(xì)胞病變，從而不能用蝕斑情況加以鑒定。實(shí)驗(yàn)里幾種鑒定過程中，最早出現(xiàn)的是RT-nPCR和熒光抗體陽性鑒定結(jié)果，其次，經(jīng)過多次傳代才獲得了大量完整的病毒抗原。在別的研究中也出現(xiàn)了同樣的結(jié)果，感染性cDNA均需在多次傳代后才會出現(xiàn)陽性結(jié)果。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了HEV基因組cDNA體外轉(zhuǎn)入載體pKS-HEV，并轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞，對其表達(dá)進(jìn)行了初步研究。為將來在分子水平上研究HEV及研發(fā)疫苗提供了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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