新疆也木勒白羊MSTN基因在不同組織中的表達(dá)定量研究

馬曉燕，祖玲玲，吐來(lái)力江·哈木太，安外爾·熱合曼，姚力丹，決肯·阿尼瓦什（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

新疆也木勒白羊MSTN基因在不同組織中的表達(dá)定量研究

馬曉燕，祖玲玲，吐來(lái)力江·哈木太，安外爾·熱合曼，姚力丹，決肯·阿尼瓦什
（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量也木勒白羊MSTN基因在不同組織（心、肝、脾、肺、腸、腎、尾脂、半膜、半鍵、股二、股三、背最長(zhǎng)?。┍磉_(dá)量的多少，分析MSTN基因在不同組織的表達(dá)規(guī)律，為也木勒白羊肌肉生長(zhǎng)性狀的選育提供遺傳學(xué)資料。結(jié)果表明：也木勒白羊MSTN基因在肌肉半膜、半鍵、股二、股三的表達(dá)量顯著高于其他各組織（P＜0.05），背最長(zhǎng)肌表達(dá)量顯著高于各內(nèi)臟組織和尾脂（P＜0.05），尾脂、肝、脾、腸、腎中表達(dá)量顯著低于其他各組織（P＜0.05），內(nèi)臟組織中肺的表達(dá)量最高，心居于第二，其余各內(nèi)臟組織表達(dá)量均差異不顯著（P＞0.05）。說(shuō)明MSTN基因在12種組織中均有表達(dá)，但在內(nèi)臟和尾脂中的表達(dá)量低于肌肉組織。

也木勒白羊；MSTN基因；基因表達(dá)

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）也稱(chēng)為生長(zhǎng)分化因子GDF-8，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-β）超家族中的一員，對(duì)肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育起著至關(guān)重要的負(fù)調(diào)控作用，其活性的喪失會(huì)引起動(dòng)物的過(guò)度發(fā)育，甚至出現(xiàn)雙肌性狀。因此，研究MSTN基因的表達(dá)規(guī)律，為調(diào)節(jié)畜禽肌肉增長(zhǎng)，改善肌肉品質(zhì)具有重要的意義。1997年，MSTN第一次在Mcpherron科研小組［1］尋找新的轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)因子研究實(shí)驗(yàn)中被發(fā)現(xiàn)。由于MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)發(fā)育的特殊調(diào)節(jié)作用，它的研究迅速成為熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)將小鼠的MSTN基因生物活性區(qū)敲除，小鼠肌肉過(guò)量增長(zhǎng)，為野生型的2～3倍［1］。Lee等［2］研究認(rèn)為，一些表現(xiàn)雙肌現(xiàn)狀的動(dòng)物是由于MSTN基因的缺失。Carlson等［3］認(rèn)為，MSTN基因的過(guò)量表達(dá)會(huì)抑制肌肉的發(fā)育，造成肌肉萎縮。也木勒白羊是新疆的地方優(yōu)良綿羊品種，其產(chǎn)肉性能優(yōu)，抗病性強(qiáng)，具有較高的利用價(jià)值。本文采用實(shí)時(shí)熒光定量法檢測(cè)產(chǎn)物的擴(kuò)增結(jié)果，采用2-ΔΔCt公式計(jì)算了MSTN基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量，第一次相對(duì)定量了也木勒白羊MSTN基因在0日齡不同組織中的表達(dá)量，為進(jìn)一步研究MSTN基因的表達(dá)規(guī)律提供了基礎(chǔ)資料，也為今后分析綿羊的產(chǎn)肉性能和肌肉增長(zhǎng)規(guī)律奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 在新疆塔城額敏縣喀拉也木勒鄉(xiāng)也木勒白羊生產(chǎn)基地選取也木勒白羊4只新生羔羊（），屠宰，取12種組織樣品迅速分裝在凍存管中，放入液氮罐中保存。

1.1.2 主要試劑 RNA提取試劑（Trizol Reagent）購(gòu)自TaKaRa公司，反轉(zhuǎn)錄試劑（Reverse Transcriptase M-MLV RNaseH-、RibonucleaseInhibitor、10×mmol/LdNTPMixture、5×RT buffer）購(gòu)自TaKaRa公司；熒光定量試劑（RibonucleaseInhibitor、SYBERPremixExTaqTM、ROX）購(gòu)自TaKaRa公司；瓊脂糖、氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇、DEPC（焦磷酸二乙酯）購(gòu)自新疆阜瑞科生物科技有限公司。

1.1.3 儀器 Eppendorf移液器：北京東南儀誠(chéng)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；超凈工作臺(tái)：上海博訊有限公司；TGL-16高速臺(tái)式冷凍低溫離心機(jī)：湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京市六一儀器廠(chǎng)；普通Biometerya PCR儀：北京艾思普科技有限公司；Geldoc 2000型凝膠成像儀：美國(guó)Bio-Rad公司；液氮罐：新疆阜瑞科生物科技有限公司；Light cycler 2.0 PCR儀：北京艾思普科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組總RNA的提取 按照Trizol試劑的說(shuō)明提取也木勒白羊不同組織總RNA，吸取4μL總RNA，采用2％瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)所提取RNA的完整性，同時(shí)利用酶標(biāo)儀得到總RNA的濃度和純度，OD260/OD280在1.8～2.0的RNA為合格RNA。合格RNA保存于超低溫冰箱中（-80℃）。

1.2.2 cDNA的獲取 25μL反轉(zhuǎn)錄體系：模板RNA2.5μg、OligodT（18）1μL、10×mmol/LdNTP 1.5μL、加RNase FreeddH20補(bǔ)至10μL，在普通PCR儀70℃，5min，后迅速急冷2min左右，急冷后離心數(shù)秒加5×buffer 5μL、inhibitor 0.1μL、反轉(zhuǎn)錄酶0.5μL、RNase FreeddH20 9.4μL后在普通PCR儀上42℃1h、70℃15min。cDNA產(chǎn)物放入-20℃保存。

1.2.3 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)各基因在GenBank上的mRNA序列（MSTN為NM-001009428.1，β-Actin為U39357），利用primer premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，生物公司合成后使用滅菌超純水處理，溶解稀釋成10μMol/L，-20℃保存。各基因的引物序列見(jiàn)表1。

表1 MSTN、β-Actin的引物序列參數(shù)

1.2.4 mRNA中MSTN基因的定量 擴(kuò)增檢測(cè)引物特異性后，用Light cycler 2.0 PCR儀分別擴(kuò)增不同組織中MSTN和β-Actin基因。具體反應(yīng)體系為：RN ase FreeddH2O 6.8μL，上、下游引物各0.4μL，2×SYBR Premix EXTaq 10μL，50×RoxReferencedye 0.4μL，cDNA模板2μL，共20μL。反應(yīng)程序：預(yù)變性95.0℃30s；95℃5s，60℃30s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)分析95℃10s，65℃15s，65～95℃升溫為0.50℃/s（Plate Read）。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析 每個(gè)樣品MSTN和β-Actin基因定量PCR分析所獲得的Ct值輸入到EXEL表中，選擇特定的樣品作為參照（本實(shí)驗(yàn)以1月齡表達(dá)量為對(duì)照），利用以下公式處理不同組織中MSTN基因CT后，利用SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單樣本方差分析，結(jié)果以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

相對(duì)表達(dá)量計(jì)算公式：

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取的總RNA，從圖1中可見(jiàn)較清晰的RNA條帶：28S、18S和5.8S，其中5.8S帶較淺，說(shuō)明RNA質(zhì)量好。OD260/OD280比值在1.8～2.0，表明RNA純度較好，可以繼續(xù)后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

2.2 也木勒白羊基因PCR擴(kuò)增

以cDNA為模板，加引物進(jìn)行PCR。采用2％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MSTN基因擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)量，結(jié)果見(jiàn)圖2。從圖2可以看出，清晰MSTN基因PCR擴(kuò)增片段接近200bp，由此可見(jiàn)引物可靠，可以做定量分析。2.3 PCR產(chǎn)物特異性分析

通過(guò)熔解曲線(xiàn)可以看出，使用引物PCR均呈單一峰（圖3），可以排除引物二聚體或其他因素的干擾，說(shuō)明引物有較好的特異性。

圖1 RNA的瓊脂糖電泳檢測(cè)

圖2 MSTN PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖3 MSTN和β-actin基因熔解曲線(xiàn)

2.4 MSTN基因mRNA在也木勒白羊不同組織中的相對(duì)定量

本實(shí)驗(yàn)采用2-ΔΔCt方法計(jì)算MSTN基因mRNA在也木勒白羊不同組織中的相對(duì)表達(dá)量。從表2可以看出，也木勒白羊MSTN基因在所檢測(cè)的樣本中均有表達(dá)，其中在股二、股三、半腱、半膜中表達(dá)量較高，背最長(zhǎng)肌居于第二，且顯著高于各內(nèi)臟組織和尾脂中的表達(dá)量（P＜0.05），在尾脂、肝、腸、脾、腎中表達(dá)量較低；內(nèi)臟組織中肺的表達(dá)量最高，心居于第二，其余各內(nèi)臟組織間均差異不顯著（P＞0.05）。

表2 MSTN基因mRNA在也木勒白羊不同組織中相對(duì)定量結(jié)果

3 討論

肌肉生長(zhǎng)抑制素（MSTN）是肌肉生長(zhǎng)發(fā)育的負(fù)調(diào)節(jié)因子，對(duì)該基因表達(dá)抑制可以造成成肌細(xì)胞的過(guò)度增殖和肌纖維的肥大，從而引起骨骼肌增生，同時(shí)有研究證實(shí)MSTN對(duì)脂肪沉積也有一定作用。對(duì)于MSTN基因在不同組織的表達(dá)，F(xiàn)erec等［4］研究表明，牛、豬、小鼠、人MSTN基因的表達(dá)主要是在骨骼肌中，在脂肪組織、腦、心、小腸、腎、肝和乳腺等器官中均有表達(dá)。Kambadur等［5］研究結(jié)果顯示，MSTN基因?qū)∪馍L(zhǎng)起負(fù)調(diào)控作用，并且影響脂肪組織積累，導(dǎo)致脂肪積累的部分抑制。白素英等［6］的研究結(jié)果顯示，MSTN基因在骨骼肌和心肌中的表達(dá)量較高，在平滑肌中的表達(dá)量較低。梁婧嫻等［7］的研究結(jié)果顯示，藏系綿羊MSTN基因在腿肌中的表達(dá)量非常高，在腿肌中的表達(dá)量是心肌的602.69倍。胡蘭等［8］在大骨雞中發(fā)現(xiàn)，MSTN在骨骼肌中表達(dá)水平較高，在心、腎、腦、腸、舌中有微弱的表達(dá)，在肺、肝中未檢測(cè)到MSTN基因的表達(dá)。潘英樹(shù)等［9］在朗德鵝組織中研究發(fā)現(xiàn)，MSTN在大腦、小腦、心、肝、脾、肺、腎、脂肪、骨骼肌中均有表達(dá)。

本實(shí)驗(yàn)中也木勒白羊MSTN基因在所檢測(cè)的樣本中均有表達(dá)，在股二、股三、半腱、半膜中表達(dá)量較高，背最長(zhǎng)肌表達(dá)量居于第二，尾脂、肝、腸、脾、腎中表達(dá)量較低，這與白素英等［6］和胡蘭等［8］的研究結(jié)果相一致。在本實(shí)驗(yàn)研究的內(nèi)臟組織中，肺的表達(dá)量最高，心居于第二，肝、脾、腎、腸的表達(dá)量差異不大，這與白素英等［6］的研究結(jié)果（在心臟中的表達(dá)量較高）不一致，這可能是種屬差異造成的。本實(shí)驗(yàn)12種組織樣均檢測(cè)到MSTN的表達(dá)，這與胡蘭等在肝中未見(jiàn)表達(dá)不一致，但與潘英樹(shù)等［9］的研究結(jié)果相一致，故MSTN在不同組織的表達(dá)還需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)中MSTN基因在12種組織樣品中均有表達(dá)，在肌肉組織中的表達(dá)量要高于在內(nèi)臟和尾脂中的表達(dá)量。且在肌肉組織中，背最長(zhǎng)肌表達(dá)量顯著低于其他各肌肉組織（P＜0.05）。在內(nèi)臟中，肺的表達(dá)量最高，心的表達(dá)居于第二，均顯著高于肝、脾、腎、腸的表達(dá)量（P＜0.05），在肝、脾、腎、腸、尾脂中均有微量表達(dá)，但均差異不顯著（P＞0.05）。

［1］McPherron A C，Lawler A M，Lee S J.Regulation of skeletal muscle mass in mice by a new TGF-beta superfamily member［J］.Nature，1997，387（6628）：83-90.

［2］Lee S J，McPherron A C.Myostatin and the control of skeleta1 muscle mass［J］.Curr Opin Genet Dev，1999，9（5）：604-607.

［3］Carlson C，Booth F W，Gordon S E.Skeletal muscle myostatin mRNA expression is fiber-type specific and increases during hindlimb unloading［J］.AmJ Physiol，1999，222：601-606.

［4］Ferec Jeanplonn，Mridula Sharma，Wayneg.Genomic organization and neonatal expression of bovine myostatingene［J］.Molecular and Cellular Biochemistrv，2001，220（1）：31-37.

［5］Kanbadur R，Sharma M，Smith T P，et al.Mutation in myostatin gene（GDF-8）in double-musculed Belgisn Blue and Piedmintese［J］.Genome Res，1997，7：910-915.

［6］白素英，劉梯，蔣國(guó)紅，等.抑肌素基因mRNA在豬肌肉組織表達(dá)差異的研究［J］.畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2004，35（3）：350-352.

［7］梁婧嫻，陳志成.藏系綿羊MSTN基因在不同年齡不同組織的表達(dá)定量研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（17）：10454-10457.

［8］胡蘭，王娜，胡銳，等.大骨雞MSTN基因的表達(dá)檢測(cè)［J］.中國(guó)家禽學(xué)報(bào)，2003（1）：46-48.

［9］潘英樹(shù)，張永宏，郭麗君，等.朗德鵝肌生成抑制素基因組織分布研究［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2008，35（5）：45-46.

Study on the Expression of MSTN Gene in Different Tissues of Yemule Lambs

Ma Xiaoyan，Zu Lingling，Jueken·Aniwashi，et al
（College ofAnimal Science，XinjiangAgricultural University，Urumqi 830052，China）

TheexpressionlevelsofMSTNgeneindifferenttissues（heart，liver，spleen，lung，intestine，kidney，fat，semimembranosus，semitendinosus，biceps femoris，triceps femoris，longissimus dorsi）ofYemule lambs were detected usingReal-time fluorescence quantitative PCR technique for providing genetic information in the selection of muscle growth traits.The results showed that expression levels in the semimembranosus，semitendinosus，biceps femoris，triceps femoris were significantly higher than those in the other tissues（P＜0.05）；the expression level in the longissimus dorsi was significantly higher than those in visceral tissues and fat（P＜0.05）；the expression levels in the fat，liver，spleen，intestine，kidneywere significantlylower than those in the other tissues（P＜0.05）；the expression level in the lung was the highest in the visceral tissues，the second in the heart；no significant differences（P＞0.05）in the other visceral tissues.MSTN gene were expressed in all 12 kinds oftissues，the expression levels in muscle tissues were higher than the expression levels in visceral tissues and fat.

Yemule sheep；MSTN gene；gene expression

S826.2

A

2095-3887（2015）05-0004-04

10.3969/j.issn.2095-3887.2015.05.002

2015-05-28

馬曉燕（1966-），女。研究方向：動(dòng)物遺傳育種。

決肯·阿尼瓦什（1962-），男，教授，博士。研究方向：動(dòng)物遺傳育種與繁殖。