舒巴坦對鮑曼不動桿菌突變選擇窗與外膜蛋白相關性研究

吳萌萌 李 雯 陳 蕓

南京醫(yī)科大學藥學院，江蘇南京 210029

舒巴坦對鮑曼不動桿菌突變選擇窗與外膜蛋白相關性研究

吳萌萌 李 雯 陳 蕓

南京醫(yī)科大學藥學院，江蘇南京 210029

目的探索鮑曼不動桿菌耐藥機制，完善防耐藥突變濃度（MPC）理論，指導臨床合理用藥。方法通過測定臨床分離鮑曼不動桿菌的MPC相關參數(shù)，研究舒巴坦的防耐藥突變能力，并對突變濃度誘導菌株進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），探索外膜蛋白（OMP）表達量與耐藥之間關系。結果舒巴坦對臨床分離5株鮑曼不動桿菌耐藥選擇指數(shù)分別為6.4、7.2、5.6、9.9、5.6，誘導后的菌株OMP 29 kD條帶減弱，提示鮑曼不動桿菌在突變濃度的舒巴坦誘導下，碳青霉烯耐藥相關性外膜蛋白（CarO）低表達。結論舒巴坦對鮑曼不動桿菌耐藥突變選擇窗（MSW）的形成與CarO低表達可能密切相關，OMP的缺失可能是鮑曼不動桿菌耐藥的首要機制；舒巴坦藥代動力學參數(shù)表明，在臨床應用中應避免其單獨使用，聯(lián)合用藥可以減小或者關閉MSW，并減慢耐藥菌株的產(chǎn)生速度。

鮑曼不動桿菌；防耐藥突變濃度；突變濃度選擇窗；舒巴坦；外膜蛋白

鮑曼不動桿菌是常見的非發(fā)酵菌，在細菌感染性疾病中的構成比僅次于銅綠假單胞菌，是目前醫(yī)院獲得性感染第二位的革蘭陰性菌[1]，主要發(fā)生在肺部感染、血流感染、手術切口感染、泌尿系統(tǒng)感染等，其感染的發(fā)生有逐年升高的趨勢[2]。鮑曼不動桿菌的天然耐藥機制較多，耐藥菌株的發(fā)展迅速，抗菌藥物往往因為耐藥而失效，這給臨床治療帶來了極大的困難。故尋找其耐藥機制，抑制耐藥的發(fā)生發(fā)展，成為治療鮑曼不動桿菌感染的一個重要課題。

Drlica研究團隊提出的防突變濃度（mutant prevention concentration，MPC）理論[3]，為有效抑制細菌耐藥及制訂應對策略提供了新的思路和參考依據(jù)。將MPC定義為預防突變的耐藥菌株被選擇性富集生長所需要的最低藥物濃度，它作為除抗菌活性之外的評價藥物預防細菌耐藥突變能力的新評價指標。然而，當兩種或多種抗菌藥物聯(lián)合使用時，細菌需要同時滿足兩個甚至更多個耐藥突變才能富集出耐藥菌株。由于細菌一次自然突變頻率是1×10-7，而感染區(qū)域細菌濃度難以＞1×1011cfu，兩次同時發(fā)生突變的概率很低，所以兩種及以上藥物聯(lián)合使用可以縮小或者關閉耐藥突變選擇窗。目前MPC理論多基于喹諾酮（FQ）類這一雙靶點藥物的耐藥機制，拓撲異構酶基因的點突變導致了此類藥物的低水平耐藥。然而，MPC理論的建立基礎和藥物耐藥機制無關，對頭孢菌素類藥物防耐藥突變濃度測定雖偶有報道，但缺乏理論依據(jù)。本研究首先測定舒巴坦對鮑曼不動桿菌的MPC相關參數(shù)，描繪抗菌藥物濃度-細菌恢復生長曲線，并且采用突變選擇濃度下的舒巴坦對鮑曼不動桿菌誘導，測定OMP表達情況。探索舒巴坦對鮑曼不動桿菌防耐藥突變濃度形成的機制，完善MPC理論，指導臨床合理用藥。

1 材料與方法

1.1 抗菌藥物

注射用頭孢哌酮鈉舒巴坦鈉 （輝瑞制藥有限公司，批號：1239033），頭孢哌酮原料藥（美侖生物有限公司，批號：20130816），舒巴坦原料藥（美侖生物有限公司，批號20130325）。

1.2 藥敏試驗及實驗菌株

臨床菌株鑒定使用梅里埃細菌鑒定儀，藥敏試驗采用紙片法，藥敏驗證采用肉湯微量稀釋法。2012年5月～2013年5月期間全部分離鑒定出鮑曼不動桿菌菌株存入菌種保藏庫，共計898株（包含相同部位同一菌株），從whonet軟件中篩選出同一患者相同部位多次送檢并臨床診斷為鮑曼不動桿菌感染者，對頭孢哌酮舒巴坦抑菌圈進行分析處理，選取對該藥敏感性逐漸下降者，進一步采用肉湯微量稀釋法驗證，選取對舒巴坦敏感株進行本試驗。

質(zhì)控株ACTT25923、ATCC25922、ATCC15692均來源于江蘇省菌種保藏庫。

1.3 最小抑菌濃度（MIC）和抑制99%細菌生長的藥物濃度（MIC99）的測定及判斷標準

倍比稀釋的藥物濃度為512～514 μg/mL，使用96孔板，每孔菌液100 μL，肉湯100 μL，使每孔接種菌量為1×104cfu。

依據(jù)美國國家臨床實驗室標準化委員會（the national committeeforclinicallaboratorystandards，NCCLS） 2005年頒布的藥敏試驗判定標準判定。用微量稀釋法確定MIC，若遇菌液濁度跳孔，則需重新實驗。

報道的方法測定MIC99，即以測定的MIC為最高濃度基線，取MIC的20%為濃度差，逐步線性遞減至1/2 MIC濃度，按照濃度梯度配制抗菌藥物的瓊脂平板。取對數(shù)期菌液，將菌液濃度調(diào)整至1.5麥氏濃度，再將菌液稀釋1/10至3×102cfu/mL。將0.1 mL菌液加入含藥平板，加入適量酪蛋白肉湯（MH肉湯）便于涂布至整個平板。過夜37℃培養(yǎng)后，選擇可以計數(shù)的平板進行菌落計數(shù)，計算抑制99%的細菌生長（即恢復生長比例為1%）的藥物濃度，定義為MIC99[4-5]。

1.4 暫定防耐藥防突變濃度（MPCpr）和MPC的測定

參考相關的MPC測定方法并加以修改。采用震蕩培養(yǎng)，將鮑曼不動桿菌菌落懸于50 mL MH肉湯，37℃振蕩培養(yǎng)6 h，4℃下以3000 r/min的速度離心，棄去上清液，再細菌懸浮于500 mL新鮮MH肉湯中，振蕩培養(yǎng)6 h，此時菌液濃度可達3×109cfu/mL，將菌液4℃下以3000 r/min的速度離心30 min，最終將菌液濃度調(diào)整至3×1010cfu/mL[4-6]。

以MIC為最低藥物濃度，兩倍遞增藥物，配制濃度梯度遞增的平皿。每個平皿用微量加樣器取菌液100 μL，再加入適量的新鮮肉湯（約400 μL）涂抹至整個瓊脂平板，每個藥物濃度使用4個平皿，則每個濃度平皿的鮑曼不動桿菌總接種菌量約為1.2×1010cfu。37℃培養(yǎng)，每隔24 h取出做1次細菌計數(shù)，記錄細菌生長情況。以培養(yǎng)72 h仍無菌落生長的最低藥物濃度作為MPCpr。再以MPCpr為最高藥物濃度，線性遞減20%MPCpr的藥物濃度，制作含藥平皿，以最終無菌落生長的最低藥物濃度作為最終的MPC。

1.5 菌落恢復生長曲線的繪制

用震蕩培養(yǎng)方法富集的3×1010cfu/mL，并稀釋1/10至3×103cfu/mL，接種于MIC99至MPC之間各梯度藥物濃度的含藥平皿上，選擇可計數(shù)的平皿進行菌落計數(shù)，計算不同藥物濃度的細菌恢復生長曲線，繪制出藥物濃度-菌落恢復生長比率曲線。

1.6 突變選擇窗濃度對鮑曼不動桿菌的誘導

MPC測定的試驗中肉湯法富集的鮑曼不動桿菌，在MIC99至MPC之間選擇適合濃度的舒巴坦，用20 mL含藥試管震蕩培養(yǎng)菌株，使得含藥的菌液濃度調(diào)整為3×1010cfu/mL，24、36、72 h后分別用比濁儀測定，待濁度穩(wěn)定后作為誘導后待測的菌液。

1.7 誘導菌的OMP表達量檢測

采用化學法提取鮑曼不動桿菌的OMP，將MPC與MIC99之間藥物濃度平皿上未抑制的細菌接種于10 mL MH肉湯，于37℃震蕩培養(yǎng)6 h，取全部菌液，4℃超速離心10 000 r/min，20 min后取上清。加入20 mL的Tris-Mg緩沖液重懸，采用超聲波破碎細菌。4℃離心3000 r/min，10 min后室溫下離心去除未破碎細菌。超速離心100 000 r/min，60 min，4℃，去除上清（胞質(zhì)成分），收集細菌OMP[6]。充分吸除上清，用0.1～0.2 mL的ddH2O重懸沉淀物。使用Nanodrop測定蛋白濃度，將蛋白濃度調(diào)節(jié)至40 μg/μL，蛋白樣品-20℃儲存。

OMP電泳采用SDS-PAGE，配制15%分離膠及5%濃縮膠，先灌注分離膠，再灌注濃縮膠，用ddH2O清除游離的丙烯酰胺，配置電泳緩沖液，組裝電泳裝置。加樣約為20 μL。起始電泳電壓為90 V，等待樣品基本進入分離膠且平衡后，電壓提高至120 V。配制固定液（乙醇500 mL，乙酸100 mL，ddH2O 400 mL）和脫色液（乙醇250 mL，乙酸80 mL，ddH2O 670 mL），電泳結束后將凝膠立即浸泡在固定液中，再反復用新鮮的脫色液脫色，脫色至背景透明為止，用ddH2O洗凈脫色液后置于UVP凝膠成像系統(tǒng)中照相。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果

肉湯微稀釋法藥敏試驗，頭孢哌酮舒巴坦的MIC范圍是8～32 μg/mL，舒巴坦的MIC范圍是8～32 μg/mL，以上兩者MIC范圍相似，而頭胞哌酮的MIC＞128μg/mL，為高度耐藥。見表1。

表1 5株臨床分離菌的MIC比較（μg/mL）

2.2 防耐藥突變濃度測定結果

臨床分離5株鮑曼不動桿菌防耐藥突變濃度試驗結果，選擇指數(shù)=MPC/MIC99，本試驗的選擇指數(shù)在5.6～9.9之間。見表2。

表2 舒巴坦對鮑曼不動桿菌MIC、MIC99、MPCpr和MPC比較

2.3 菌株661-17恢復生長曲線

針對臨床分離株661-17描繪藥物濃度-細菌恢復生長比率曲線，曲線呈現(xiàn)2次下降的“S形”。見圖1。

圖1 鮑曼不動桿菌661-17恢復生長曲線

2.4 鮑曼不動桿菌OMP提取及電泳結果

將661-17、46C4、46E3三株鮑曼不動桿菌用適合濃度的舒巴坦誘導后提取蛋白進行SDS-PAGE，凝膠成像29 kD區(qū)域可見表達不一致的條帶。泳道1、2、3為菌株661-17；泳道4、5、6為菌株46C4；泳道7、8、9為菌株46E3；泳道1、4、7誘導濃度為8 μg/mL，此濃度低于MIC99，泳道2、5、8誘導濃度為32 μg/mL，泳道3、6、9誘導濃度為64 μg/mL，濃度介于MIC99和MPC之間。見圖2。

圖2 誘導菌SDS-PAGE結果

根據(jù)29kD條帶的光密度分析，將泳道1的29 kD條帶光密度值設置為參照值1.00，得出誘導濃度分別為8、32、64 μg/mL下，光密度值分別為（1.03±0.15）、（0.21±0.09）、（0.24±0.05），表明在誘導濃度位于MIC與MPC之間時，29 kD表達量降低。見圖3。

3 討論

3.1 舒巴坦對鮑曼不動桿菌臨床分離株的防耐藥突變濃度

圖3 29 kD條帶蛋白表達半定量測定

表1為舒巴坦對5個臨床分離鮑曼不動桿菌株的MIC、MIC99、MPCpr和MPC。通過比較，可以看出舒巴坦對不同臨床分離的鮑曼不動桿菌都有差別，所以藥物的防突變能力是針對特定的病原菌和特定的藥物而言。MPC與MIC之間的濃度稱為耐藥突變選擇窗（mutant selection window，MSW），范圍越窄，則該藥物針對病原菌的防突變能力越強。MPC與MIC的比值定義為選擇指數(shù)，藥物的選擇指數(shù)直接反映該藥物防耐藥突變能力。本研究使用舒巴坦對5個臨床分離株的選擇指數(shù)在5.6～9.9之間，普遍低于FQ類藥物對鮑曼不動桿菌的選擇指數(shù)4～64[8]，針對鮑曼不動桿菌，舒巴坦相對于FQ藥物防耐藥突變能力強，不易產(chǎn)生耐藥。

3.2 菌落恢復生長曲線

本研究選取661-17臨床分離株，以MIC99和MPC為依據(jù)，測定兩者之間多點濃度的細菌恢復生長比例。本研究前三個濃度點（0、10、12.8 μg/mL）＜MIC范圍，隨著藥物濃度增高細菌生長明顯受到抑制，菌落數(shù)出現(xiàn)第1次明顯下降，這由于藥物抑制了大部分敏感菌株的生長，在此濃度范圍內(nèi)敏感菌仍然占大多數(shù)，低于MIC的藥物濃度被認為臨床治療無效，這一濃度范圍也不會造成耐藥菌選擇性富集生長。但隨著藥物濃度增加（25.6～102.4 μg/mL），鮑曼不動桿菌抑制率并未明顯下降，而是停留在相對穩(wěn)定的一個范圍（1×10-8～1×10-7），由于藥物抑制了大部分的敏感菌，耐藥菌得到富集生長，高于MIC的濃度雖然在臨床上認為治療有效，但使耐藥菌富集導致耐藥。隨著藥物濃度進一步增加（＞89.6 μg/mL），出現(xiàn)無菌生長，即敏感菌和耐藥菌的生長同時被抑制，在細菌恢復生長曲線上出第2次下降，直至藥物濃度增加到112.5 μg/mL，即達到MPC，含藥瓊脂平板上沒有菌落生長。此時的藥物濃度不僅可以控制臨床感染，也不會導致耐藥菌富集生長。其MIC99和MPC之間的濃度稱為突變選擇窗，其范圍的寬窄直接關系到藥物抑制耐藥菌富集的能力。

3.3 OMP表達與選擇性耐藥

將突變選擇窗內(nèi)的兩個藥物濃度（32 μg/mL和 64 μg/mL）與鮑曼不動桿菌共培養(yǎng)，得到富集后的耐藥菌，進行SDS-PAGE，從結果可以看出突變選擇濃度誘導前后的鮑曼不動桿菌，在27.0 kD附近有許多表達不明顯的蛋白條帶，本研究通過對比發(fā)現(xiàn)，突變選擇窗內(nèi)的藥物濃度誘導后的菌株在該位置附近的蛋白表達缺失。在研究鮑曼不動桿菌碳青霉烯類藥物耐藥機制時發(fā)現(xiàn)其OMP在27.0 kD的表達條帶差異與碳青霉烯類藥物耐藥密切相關，故稱CarO蛋白[6]。該蛋白的二級結構為β-桶狀，其性質(zhì)屬熱修飾性蛋白，加熱可以使得該蛋白相對分子量從25.0 kD變化為29.0 kD。但迄今為止，在CarO的結構中未發(fā)現(xiàn)碳青霉烯類藥物特異性位點，故推斷CarO蛋白可能為非特異性水溶性藥物通道。舒巴坦為小分子水溶性藥物，CarO通道的表達量可直接影響藥物進入菌體內(nèi)而發(fā)揮抗菌活性，產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象。

3.4 臨床合理用藥

目前，舒巴坦是鮑曼不動桿菌防控的一線藥物[8]。根據(jù)所報道的頭孢哌酮舒巴坦（1︰1）在健康人的藥動學參數(shù)研究[9]：頭孢哌酮舒巴坦臨床注射2 g，其中舒巴坦含量為1 g，各年齡階段的Cmax在24～54 μg/mL范圍內(nèi)，這個濃度恰好落在本研究測定的MSW之內(nèi)，在此濃度內(nèi)更容易富集耐藥菌。而合并腎功能障礙患者，落在MSW內(nèi)的時間比例可能會更高[10]。基于MPC理論的的應用和發(fā)展，聯(lián)合使用抗菌藥物是縮小和關閉突變選擇窗的有效手段，同時可以減少單一藥物大劑量使用而產(chǎn)生的嚴重不良反應。本研究測定出的舒巴坦MPC接近或者＞100 μg/mL，而根據(jù)舒巴坦的藥代動力學特點很難達到MPC以上，故單一使用舒巴坦治療鮑曼不動桿菌感染時極易富集除耐藥菌。有研究報道[11]多黏菌素和左氧氟沙星或多黏菌素和妥布霉素聯(lián)合使用可以縮小鮑曼不動桿菌的耐藥突變選擇窗的寬度，減緩或者阻止多黏菌素耐藥菌株出現(xiàn)。另一項研究表明頭孢哌酮/舒巴坦和莫西沙星聯(lián)合使用，針對耐碳青霉烯類鮑曼不動桿菌的MPC研究，亦可以減小或者關閉MSW，延緩耐藥菌株的富集[12]。

3.5 舒巴坦對鮑曼不動桿菌耐藥突變選擇窗形成機制

MPC理論的提出是基于對FQ藥物的耐藥機制。FQ類抗菌藥物對細菌作用的靶位為拓樸異構酶Ⅱ和拓樸異構酶Ⅳ，拓樸異構酶Ⅱ由gyr A、B亞單位組成；拓樸異構酶Ⅳ由par C、E亞單位組成[11]，通過MSW濃度范圍內(nèi)的藥物誘導后的菌株進行靶位基因測序分析，結果表明藥物靶位基因的突變與特定范圍濃度的藥物密切相關[13]。在藥物濃度較低時，菌株未發(fā)現(xiàn)突變序列；當FQ濃度＞MIC時在持續(xù)的藥物選擇壓力下，敏感菌被殺滅，恢復生長的菌株產(chǎn)生十多種位點的gyrA基因的改變。然而隨著FQ濃度進一步升高，接近及超過MPC，耐藥突變位點減少，直至無菌生長。

細菌突變發(fā)生頻率約為1×10-7，由于人體感染部位細菌載量可達到1×1010cfu，其絕對數(shù)可以超過1×103cfu，在抗菌藥物的選擇壓力下，必然會出現(xiàn)耐藥突變菌成為優(yōu)勢生長群而富集。當藥物濃度高于MPC時，同時發(fā)生兩次或多次耐藥突變才能得到生長，兩次耐藥突變同時發(fā)生的頻率約為1×10-14，而感染組織的細菌載量幾乎無法達到1×1014cfu，所以耐藥突變菌株出現(xiàn)的可能性將極小[14]?；诖死碚摰耐茢?，將藥物的濃度提高至MPC以上，可以較好地解決細菌耐藥問題。

基因點突變解釋了FQ類藥物的MPC形成的原因，然而對于β-內(nèi)酰胺類藥物的MPC理論適用性一直存在爭議[15]。有研究表明頭孢曲松、亞胺培南、美洛培南等藥物，其MIC和MPC范圍不超過一個稀釋倍數(shù)，認為MPC或許不適合于β-內(nèi)酰胺類藥物，由于此類藥物的耐藥機制復雜并且多種機制混合存在，其首要的機制并非基因位點的突變，而是細菌捕獲外源性耐藥DNA，MPC理論僅適用于基因位點突變而導致的耐藥問題[16]。針對以上反對性的觀點，Zhao研究團隊[17]認為，MSW是一個測定的濃度范圍，利用此范圍內(nèi)濃度的藥物和細菌接觸后，可選擇性富集擴增耐藥菌。在臨床治療中的意義是，人們是積極預防細菌耐藥產(chǎn)生，還是利用宿主的免疫系統(tǒng)來清除耐藥菌，這一觀點廣泛適用于所有抗菌藥物產(chǎn)生的耐藥問題，而和具體的發(fā)生機制無關。

近年來認為，OMP缺失可能是鮑曼不動桿菌耐藥的重要機制。本研究通過對MSW濃度內(nèi)的舒巴坦誘導鮑曼不動桿菌，發(fā)現(xiàn)誘導后恢復生長的菌株29.0 kD條帶減弱，表明誘導后的菌株CarO表達量下降，這顯著地增加了菌株的耐藥性[18]，也有研究表明，CarO類型和表達量與CarO基因突變有關[19]，這種機制與FQ形成MSW的機制高度類似，均為基因位點突變導致藥物難以發(fā)揮殺菌作用，也佐證了MPC在β-內(nèi)酰胺類藥物中的適用性。然而根據(jù)舒巴坦的藥代動力學特點，在臨床治療中，常規(guī)用量時的血藥濃度恰好落在MSW內(nèi)，單獨極有可能產(chǎn)生耐藥。故推薦應與其他藥物聯(lián)合使用[20]，減少或關閉MSW，減緩細菌耐藥發(fā)展。

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Study of Sulbactam against relationshiP between Acinetobacter baumannii selection window and outer membrane Protein

WU Mengmeng LI Wen CHEN Yun
School of Pharmacy,Nanjing Medical University,Jiangsu Province,Nanjing 210029,China

Objective To explore Acinetobacter baumannii resistance mechanisms and improve mutant prevention concentration(MPC)theory for guiding clinical therapy.Methods The mutant prevention ability of Sulbactam was investigated by measuring relevant parameter of MPC of the clinically isolated Acinetobacter baumannii.SDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)was performed to explore the relationship between outer membrane protein expression of mutant concentration induced strain and drug resistance.Results The resistance selection index of Sulbactam against five clinically isolated Acinetobacter baumannii was 6.4,7.2,5.6,9.9 and 5.6 respectively.The membrane protein band at 29 kD was weaken after the mutant induction,which indicated that the expression of Carbapenem associated resistance outer membrane protein (CarO)of Acinetobacter baumannii induced by Sulbactam at mutation concentration was low.Conclusion The mutant selection window (MSW)formation of Acinetobacter baumannii caused by Sulbactam may be closely related to low expression of CarO.The primary mechanism of drug resistance in Acinetobacter baumannii maybe owing to its membrane protein deficiency.The pharmacokinetic parameters of Sulbactam indicate that single medication should be avoided in clinical application.Combination drug therapy can reduce or close MSW and slow down the speed of drug-resistant strains generation in treatment of Acinetobacter baumannii infection.

Acinetobacter baumannii;Mutant prevention concentration;Mutant selection window;Sulbactam;Outer membrane

R914.1

A

1673-7210（2015）11（a）-0048-06

2015-07-27本文編輯：趙魯楓）

江蘇省南京市醫(yī)學科技發(fā)展項目（QYK11130）。

陳蕓（1978-），女，博士，教授；研究方向：大分子藥物的臨床藥物分析和藥代動力學。