二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究

童陳琦 王 維 梁斌鑫

浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州 310014

二甲雙胍抗腫瘤血管及抑制胃癌細(xì)胞生長的實(shí)驗(yàn)研究

童陳琦 王 維 梁斌鑫

浙江省人民醫(yī)院藥學(xué)部，浙江杭州 310014

目的探討二甲雙胍對腫瘤血管及胃癌細(xì)胞生長的抑制作用。方法利用人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）細(xì)胞劃痕試驗(yàn)、Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)、Matrigel血管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)，研究二甲雙胍對血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、遷移及血管狀結(jié)構(gòu)形成的影響，且運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測二甲雙胍對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）表達(dá)的影響；利用胃癌細(xì)胞BGC823的MTT實(shí)驗(yàn)、蘇木精凋亡染色、Annexin-Ⅴ細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)、定量PCR凋亡因子檢測實(shí)驗(yàn)，研究二甲雙胍對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響。結(jié)果二甲雙胍能夠明顯抑制HUVEC的遷移、侵襲、血管狀結(jié)構(gòu)形成，并且明顯減少細(xì)胞VEGF的表達(dá)；二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且具有濃度依賴性，其中最大抑制率為68.80%，半抑制濃度（IC50）為（11.97±1.84）mmol/L；二甲雙胍可以誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞凋亡，具有濃度依賴性，10 mmol/L二甲雙胍組凋亡比例接近60%；二甲雙胍組BGC823細(xì)胞的Bcl-2 mRNA減少，而AMPKα1、Bax、Bad mRNA的表達(dá)增加。結(jié)論 二甲雙胍能夠抑制腫瘤血管形成和胃癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗胃癌細(xì)胞生長作用。

二甲雙胍；抗腫瘤；腫瘤血管形成；胃癌

二甲雙胍是雙胍類口服降血糖藥，主要通過活化AMPK通路來減少肝臟糖異生，同時促進(jìn)脂肪和肌肉組織對葡萄糖的攝取，從而達(dá)到降低血糖的目的[1-2]。研究已經(jīng)證實(shí)二甲雙胍不僅是一種非常好的糖尿病藥物，還能夠抑制肝癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌、肺癌、卵巢癌和腎癌的生長[3-4]。例如根據(jù)發(fā)表在Cancer Prevention Research雜志上的一項新研究提示：在患有糖尿病的非吸煙者中，那些服用糖尿病藥物二甲雙胍的患者患肺癌的風(fēng)險也明顯降低[5]，但是其作用機(jī)制多而復(fù)雜，例如二甲雙胍可通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用，它可以降低結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)，并且誘導(dǎo)細(xì)胞色素C從線粒體釋放進(jìn)入胞漿，明顯促使caspase-3、PARP活化[6]。此外，有文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍除能誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡和抑制細(xì)胞增殖外，還可以抑制腫瘤血管的形成[7]。腫瘤血管為腫瘤的生長提供足夠的營養(yǎng)和養(yǎng)分，也是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移所必需的。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）是血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，是腫瘤血管新生的一個關(guān)鍵調(diào)控因子，二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，從而達(dá)到抑制腫瘤生長的目的。

胃癌是全世界范圍的高發(fā)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計，我國胃癌的發(fā)病人數(shù)占到全世界的42%左右，每年發(fā)病40萬例，死亡人數(shù)超過2/3[8]。近年來，研究發(fā)現(xiàn)胃癌的生長是血管依賴性的，腫瘤直徑達(dá)到2 mm時，胃癌的生長就需要新生毛細(xì)血管來提供營養(yǎng)和養(yǎng)分[9]。越來越多的研究提示，腫瘤血管與胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，阻斷腫瘤血管新生可以抑制胃癌的生長[10-11]。由于二甲雙胍對胃癌的抑制作用尚不明確，因此，本研究以人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）、胃癌細(xì)胞BGC823為研究對象，探討二甲雙胍對血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲、遷移及血管狀結(jié)構(gòu)形成的影響，以及對胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響，為胃癌的臨床預(yù)防及治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HUVEC（美國ScienCell公司）；胃癌細(xì)胞BGC823（北京協(xié)和細(xì)胞庫）；二甲雙胍、MTT、結(jié)晶紫染液、蘇木精染液 （Sigma公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶（Hyclone公司）；Matrigel膠（BD公司）；VEGF抗體（Bioworld公司）；ECM培養(yǎng)基（美國ScienCell公司）；AV/PI雙染凋亡檢測試劑盒（Mbchem公司）；XDS-1B倒置顯微鏡（重慶重光儀器公司）；Transwell小室（Millipore公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HUVEC加入至完全ECM培養(yǎng)基中，胃癌細(xì)胞BGC823培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 將HUVEC接種于6孔板中，各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h待貼壁后，用200 L加樣槍頭在其培養(yǎng)板中劃一直線，并用無血清培養(yǎng)基沖洗刮掉的細(xì)胞，形成一無細(xì)胞“裸露”區(qū)域[12]，再分別加入含5、10 mmol/L含二甲雙胍的培養(yǎng)基（實(shí)驗(yàn)組）和不加二甲雙胍的培養(yǎng)基（對照組）繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，采集圖像，觀察二甲雙胍對血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移的影響。

1.2.3 細(xì)胞Transwell實(shí)驗(yàn) 制備HUVEC細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×105個/mL，取細(xì)胞懸液100 μL加入Transwell上層小室，下層加入600 L含10%FBS的ECM培養(yǎng)基。待細(xì)胞固定后，加入含5、10 mmol/L二甲雙胍的培養(yǎng)基100 μL，且設(shè)置空白對照組。培養(yǎng)細(xì)胞24 h，取出小室，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min，然后用棉簽擦去上室內(nèi)的細(xì)胞，顯微鏡下采集圖像，觀察二甲雙胍對血管內(nèi)皮細(xì)胞侵襲的影響。

1.2.4 血管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn) 將Matrigel基質(zhì)膠放于4℃進(jìn)行解凍，然后均勻鋪在細(xì)胞培養(yǎng)板中（每孔50 μL Matrigel）。將鋪完Matrigel基質(zhì)膠的96孔培養(yǎng)板置于37℃培養(yǎng)箱中孵育30 min，取HUVEC懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度為2×105個/mL，每孔加入100 μL，待細(xì)胞固定后，加入含5、10 mmol/L二甲雙胍的培養(yǎng)基100 μL，且設(shè)置空白對照組。繼續(xù)在孵箱培養(yǎng)12 h，顯微鏡下觀察微管形成情況。

1.2.5 流式檢測 VEGF表達(dá) 在培養(yǎng)板中接種 5× 105個/mL的HUVEC細(xì)胞，并且加入5、10 mmol/L二甲雙胍，且設(shè)置空白對照組。培養(yǎng)48 h后，胰酶消化HUVEC細(xì)胞，收集細(xì)胞，離心并去除培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入VEGF流式抗體孵育30 min，上機(jī)檢測VEGF的表達(dá)情況。

1.2.6 MTT法測定BGC823細(xì)胞增殖 收集對數(shù)生長期的BGC823細(xì)胞，離心并去除培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基重懸，以5×103個/孔接種于96孔板。培養(yǎng)24 h后，分別加入0、1.25、2.5、5、10、20、40、60 mmol/L的二甲雙胍，37℃培養(yǎng)72 h后，移除培養(yǎng)基，每孔加入20 μL新配制的含5 mg/mL MTT的無血清培養(yǎng)基，37℃孵育4 h后，3000 r/min，離心15 min，去除上清，加入200 μL DMSO，輕度振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm檢測波長，無參比波長的條件下測定OD值[13]。

1.2.7 蘇木精凋亡染色 將蓋玻片放于培養(yǎng)器皿中，讓培養(yǎng)BGC823細(xì)胞長于玻片上，等細(xì)胞固定后，加入10 mmol/L二甲雙胍，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后取出玻片，用4%多聚甲醛固定5 min，然后用蘇木精進(jìn)行細(xì)胞染色，觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.8 Annexin-Ⅴ細(xì)胞凋亡檢測 BGC823細(xì)胞分別在5、10 mmol/L二甲雙胍中暴露24 h后，收集、離心并去除培養(yǎng)基，然后用PBS洗2次，加入100 μL Binding Buffer和2 μL Annexin-Ⅴ，室溫避光30 min，再加入4 μL PI，避光反應(yīng)5 min，加入400 μL Binding Buffer，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況[14]。

1.2.9 Real-time PCR檢測凋亡因子 BGC823細(xì)胞分別在5、10 mmol/L二甲雙胍中暴露24 h后，采用TRIzol抽提法提取實(shí)驗(yàn)組及對照組細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，流程參照試劑盒說明進(jìn)行。將2×qPCR Mix（10 μL），模板DNA（1 μL），上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，然后加DEPC水8 μL，混勻后置于qPCR儀中，95℃變性10 min，然后經(jīng)95℃變性30 s，60℃退火30 s，共40個循環(huán)，擴(kuò)增。最后統(tǒng)計實(shí)驗(yàn)結(jié)果，觀察AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)所涉及基因的引物序列見表1。

表1 Actin、AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad基因的引物序列

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍對HUVEC細(xì)胞遷移、侵襲的影響

如圖1A所示，與空白對照組比較，5、10 mmol/L二甲雙胍均能抑制人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC的遷移。如圖1B所示，5、10 mmol/L二甲雙胍均能抑制HUVEC細(xì)胞的侵襲能力。

圖1 二甲雙胍對HUVEC細(xì)胞遷移、侵襲的影響

2.2 二甲雙胍對HUVEC細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)形成的影響

由于HUVEC細(xì)胞能在體外Matrigel上形成血管狀結(jié)構(gòu)，可以模擬人體內(nèi)毛細(xì)血管生成的過程，所以，本研究利用HUVEC細(xì)胞在Matrigel膠上形成血管樣結(jié)構(gòu)，評價二甲雙胍對血管形成的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5、10 mmol/L二甲雙胍均可以明顯抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)的形成（圖2A）。

2.3 二甲雙胍對HUVEC細(xì)胞VEGF表達(dá)的影響

本研究收集5、10 mmol/L二甲雙胍及空白對照組處理的HUVEC細(xì)胞，離心除去培養(yǎng)基后，用PBS清洗2次，然后加入VEGF流式抗體孵育30 min，上機(jī)檢測VEGF的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，5、10 mmol/L二甲雙胍均能明顯減少HUVEC細(xì)胞中VEGF的表達(dá)（圖2B）。

圖2 二甲雙胍對HUVEC細(xì)胞血管狀結(jié)構(gòu)形成及VEGF表達(dá)量的影響

2.4 二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞增殖的抑制作用

利用MTT實(shí)驗(yàn)，測得各組細(xì)胞的OD值，根據(jù)公式：抑制率=（對照組OD值-給藥組OD值）/對照組OD值×100%，計算出各濃度的抑制率，結(jié)果見表2。然后用MicroCal Origin軟件作圖，并且擬合腫瘤細(xì)胞生長曲線。結(jié)果表明二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用（圖3A），且具有濃度依賴性，最大抑制率為68.80%，半抑制濃度（IC50）為（11.97±1.84）mmol/L。

表2 不同濃度二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞增殖的影響

2.5 二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞凋亡的影響

通過細(xì)胞爬片、蘇木精染色，發(fā)現(xiàn)加入10 mmol/L二甲雙胍處理的BGC823細(xì)胞核染色質(zhì)致密濃縮，核固縮、深染，提示二甲雙胍能夠直接誘導(dǎo)BGC823細(xì)胞凋亡（圖3B）。Annexin V-FITC可標(biāo)記早期凋亡細(xì)胞，而碘化丙啶（PI）能使凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜著色。經(jīng)過Annexin V/PI染色結(jié)果，本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞凋亡，且具有濃度依賴性，10 mmol/L二甲雙胍組凋亡比例接近60%（圖4）。

圖3 二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6 二甲雙胍對BGC823細(xì)胞AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)的影響

圖4 二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞凋亡的影響

BGC823細(xì)胞經(jīng)過5、10 mmol/L二甲雙胍處理后，提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄后Real-time PCR檢測AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與空白對照組比較，二甲雙胍組BGC823細(xì)胞的Bcl-2 mRNA減少，而AMPKα1、Bax、Bad mRNA的表達(dá)增加（圖5）。

3 討論

二甲雙胍具有抗腫瘤的多種生物活性，研究已證實(shí)，二甲雙胍能抑制包括乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌、腎癌、卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌及神經(jīng)膠質(zhì)瘤等多種惡性腫瘤的生長[15]，但對胃癌生長的抑制作用及機(jī)制尚不十分明確。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍能夠抑制腫瘤血管的新生[16-17]，因此本研究首先利用HUVEC在體外研究二甲雙胍對腫瘤血管形成的干預(yù)作用，本研究結(jié)果初步顯示，二甲雙胍能夠明顯抑制HUVEC的遷移、侵襲。由于Matrigel血管狀結(jié)構(gòu)形成實(shí)驗(yàn)?zāi)苣M人體內(nèi)毛細(xì)血管生成的過程，包括內(nèi)皮細(xì)胞出芽增殖和毛細(xì)血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成等步驟，接近人體內(nèi)腫瘤血管生成的實(shí)際過程[18]，所以，本研究建立HUVEC體外血管狀結(jié)構(gòu)形成模型，觀察二甲雙胍對血管狀結(jié)構(gòu)形成的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可以明顯抑制HUVEC血管樣結(jié)構(gòu)的形成，且經(jīng)過二甲雙胍處理的細(xì)胞VEGF表達(dá)明顯減少，以上結(jié)果提示二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管形成，發(fā)揮抗胃癌作用。

圖5 二甲雙胍對AMPKα1、Bax、Bcl-2、Bad mRNA表達(dá)的影響

此外，以往的研究提示二甲雙胍也能夠直接作用于腫瘤細(xì)胞，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長。例如研究者發(fā)現(xiàn)二甲雙胍能激活細(xì)胞內(nèi)AMPK并抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[19]，可以誘導(dǎo)多種卵巢癌細(xì)胞凋亡[20]。也有研究者表明二甲雙胍可以減少結(jié)腸癌細(xì)胞Bcl-2、Bcl-xl的表達(dá)，增加Bax的表達(dá)，促使caspase-3、PARP活化，發(fā)揮誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡作用[6]。但是對胃癌的研究尚不清楚，因此本研究利用MTT實(shí)驗(yàn)，提示二甲雙胍對胃癌BGC823細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，最大抑制率接近70%。蘇木精核染及Annexin V/PI流式凋亡檢測結(jié)果均顯示二甲雙胍能夠誘導(dǎo)胃癌BGC823細(xì)胞凋亡。實(shí)驗(yàn)通過定量PCR檢測凋亡相關(guān)基因Bax、Bad Bcl-2 mRNA證實(shí)二甲雙胍可以減少BGC823細(xì)胞的Bcl-2，增加Bax、Bad mRNA表達(dá)量，且AMPKα1 mRNA表達(dá)量的表達(dá)量明顯增加，提示二甲雙胍具有直接抑制胃癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡的作用，且有可能是通過激活A(yù)MPK通路實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，糖尿病的一線治療藥物二甲雙胍對腫瘤的多種生物活性已經(jīng)受到研究者們的廣泛關(guān)注[21-22]。本研究結(jié)果示，二甲雙胍可以通過AMPK通路來抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)VEGF的表達(dá)，抑制腫瘤血管形成，也可以直接作用于胃癌細(xì)胞，抑制其增殖，并誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗胃癌作用。

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ExPerimental study of Metformin for inhibiting tumor angiogenesis and gastric cancer cell growth

TONG Chenqi WANG Wei LIANG Binxin
Department of Pharmacy,Zhejiang Provincial People's Hospital,Zhejiang Province,Hangzhou 310014,China

Objective To investigate the inhibiting effect of Metformin on the tumor angiogenesis and gastric cancer cell growth.Methods The cell scratch test,Transwell invasion assay and Matrigel vascular structure formation experiment of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)were used to study the effect of Metformin on vascular endothelial cell migration,invasion and the vascular structure formation,and the influence of Metformin on VEGF expression was illuminated by flow cytometry;then MTT assay,hematoxylin apoptosis of dyeing,Annexin-Ⅴ apoptosis and quantitative PCR detection for apoptosis factors of gastric cancer BGC823 cells were conducted to research the effect of Metformin on gastric cancer cell proliferation and apoptosis.Results Metformin could significantly inhibit endothelial cell migration,invasion,vascular structure of HUVEC,and reduce VEGF expression;Metformin had an obvious inhibiting effect in gastric cancer BGC823 cells proliferation,with the concentration-dependence,the biggest inhibition rate was 68.80%,the 50%inhibiting concentration (IC50)was (11.97±1.84)mmol/L;Metformin could also increase cell apoptosis of BGC823 cells,with the concentration-dependence,the apoptosis rate of 10 mmol/L Metformin was close to 60%;the Bcl-2 mRNA of BGC823 cells treated by Metformin decreased,and the expression of AMPKα1, Bax,Bad mRNA increased.Conclusion Metformin can inhibit gastric cancer growth by inhibiting tumor angiogenesis and gastric cancer cell proliferation,and inducing gastric cancer apoptosis,which plays a role of inhibiting gastric cancer cell growth.

Metformin;Anti-tumor;Tumor angiogenesis;Gastric cancer

R735.7

A

1673-7210（2015）11（a）-0025-06

2015-06-24本文編輯：張瑜杰）

王維（1982.2-），男，碩士研究生；研究方向：中藥藥理和腫瘤藥理學(xué)。