反應(yīng)時間對聚多巴胺/納米銀修飾多孔鈦生物學(xué)性能的影響

容錫滄 張 余 譚幗馨 譚 英 寧成云 李 梅 李麗華

反應(yīng)時間對聚多巴胺/納米銀修飾多孔鈦生物學(xué)性能的影響

容錫滄 張 余 譚幗馨 譚 英 寧成云 李 梅 李麗華

目的探討制備新型鈦基材料過程中，納米銀顆粒載入反應(yīng)時間對其體外抗菌性能和細胞相容性等生物學(xué)性能的影響。方法通過聚合作用以多巴胺在納米孔鈦表面構(gòu)建聚多巴胺（PDA）膜層，通過調(diào)節(jié)納米銀顆粒載入反應(yīng)時間（15 min，30 min，60 min），得到不同納米銀顆粒濃度的聚多巴胺修飾鈦。利用掃描電鏡（SEM）、細胞黏附、細胞毒性及殺菌率等檢測方法，對載不同納米銀顆粒濃度的聚多巴胺修飾鈦進行體外生物相容性及抗菌性能評價。結(jié)果載入納米銀反應(yīng)時間為30 min的鈦基材料較其他反應(yīng)時間的材料表現(xiàn)出良好的細胞黏附能力、較低的細胞毒性和滿意的抗菌性能。結(jié)論通過調(diào)整納米銀沉積反應(yīng)時間，可調(diào)節(jié)材料表面銀離子釋放量，可得到既有良好細胞相容性，又有較強抗菌能力的聚多巴胺/納米銀修飾多孔鈦。

多孔鈦聚多巴胺納米銀顆粒生物學(xué)性能反應(yīng)時間

鈦及其合金作為傳統(tǒng)的金屬植入物材料，具有良好的生物相容性、機械性和耐生物腐蝕性等特點，已廣泛應(yīng)用于臨床及實驗研究中。但是鈦及其合金不具有抗感染能力，同時因表面具有較強的蛋白吸附能力，植入人體后表面形成的蛋白層容易被細菌定植而發(fā)生細菌感染，引起手術(shù)失敗。另外，鈦及其合金因表面存在生物惰性氧化層，不能與骨組織發(fā)生化學(xué)鍵性結(jié)構(gòu)，在組織界面處容易形成纖維組織隔層，植入人體后容易發(fā)生松動，這亦是植入失敗的原因之一。隨著材料技術(shù)的發(fā)展，目前利用載銀抗菌無機金屬材料和納米抗菌材料的優(yōu)點，研究出一種新型抗菌劑，即納米銀抗菌材料，被認為是目前最強的抗菌材料。在細菌耐藥性日趨嚴重的大環(huán)境下，納米銀具有安全性高、無耐藥性，熱穩(wěn)定和化學(xué)穩(wěn)定性好，抗炎能力強和促進損傷愈合等特性，使得利用納米銀改進鈦及其合金日益受到關(guān)注。但是納米銀材料潛在的細胞毒性成為其廣泛應(yīng)用的制約因素。因此，尋找提高納米銀材料細胞相容性的方法尤其重要。聚多巴胺（PDA）具有仿貽貝黏連蛋白結(jié)構(gòu)，其能提高材料的生物相容性和生物活性[1-2]。Giglio等[3]通過電聚合等方法，證明其形成于鈦表面的納米銀/水凝膠復(fù)合涂層具有優(yōu)良的生物活性和抗菌效果。此外，聚多巴胺還具有一定的還原性，Ball等[4]利用金屬離子絡(luò)合和還原的原理，將聚多巴胺處理后的聚苯乙烯材料與硝酸銀溶液反應(yīng)后在其表面形成納米銀涂層，從而可表明聚多巴胺能無電金屬化于材料表面。本研究通過構(gòu)建仿生聚多巴胺層于鈦表面，進而通過反應(yīng)時間來調(diào)節(jié)聚多巴胺對金屬離子絡(luò)合和還原程度，制備出載不同納米銀含量的聚多巴胺鈦材料，并通過研究其體外抗菌性能和細胞相容性，探討制備新型鈦基植入材料的方法及其生物學(xué)性能。

1 實驗方法

1.1 實驗材料及試劑

金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、小鼠前成骨細胞均由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科凍存。

醫(yī)用純鈦片（99.9%，寶雞市啟辰新材料科技有限公司）；鹽酸多巴胺（98%，阿拉丁試劑有限公司）；硝酸銀（98%，上海國藥）；4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚（DAPI，美國Sigma公司）。

掃描電鏡（Nova Nano SEM4300，荷蘭FEI公司）；光電子能譜儀（ESCALAB 250，美國Thermo公司）；石墨爐原子吸收光譜儀（Z-5000，日本Hitachi公司）；熒光顯微鏡（1×2-ILL 100，日本Olympus公司）；酶標儀（Multiskan FC，美國Thermo公司）。

1.2 材料制備

1.2.1 鈦表面納米孔結(jié)構(gòu)化處理

實驗材料由廣東工業(yè)大學(xué)輕工化工學(xué)院制備提供。將直徑為1 cm，厚度為0.1 mm的醫(yī)用純鈦片（99.9%）分別用丙酮、無水乙醇和去離子水各超聲清洗10 min，除去鈦表面油污；再將鈦片浸泡于HF（0.54 mol/L）、HNO3（0.29 mol/L）按體積比1∶1配成的溶液中反應(yīng)5 min；去離子水超聲清洗，置于50℃恒溫干燥箱中干燥備用，得到酸處理鈦片（Ti）。預(yù)處理后浸入60℃piranha溶液（VH2SO4∶VH2O2=7∶3）中反應(yīng)30 min，超聲清洗后，干燥得到納米孔結(jié)構(gòu)化鈦（nTi）。

1.2.2 鈦表面聚多巴胺仿生修飾

將nTi浸入到pH值為8.5、濃度為2 g/L的鹽酸多巴胺（98%）溶液中振蕩反應(yīng)24 h，于超聲清洗器中用去離子水清洗10 min，氮氣中烘干，得到聚多巴胺修飾納米孔化鈦（Ti-PDA）。

1.2.3 Ti-PDA表面載納米銀

將Ti-PDA樣品浸入到20 mM的硝酸銀（98%）溶液中反應(yīng)一定時間（15 min，30 min，60 min），再于超聲清洗器中用去離子水反復(fù)清洗，后氮氣干燥，得到不同反應(yīng)時間的載納米銀聚多巴胺鈦樣品（Ti-PDA-Ag-15min，Ti-PDA-Ag-30min，Ti-PDA-Ag-60min）。

1.3 材料表征及化學(xué)成分分析

利用掃描電鏡的方法觀察樣品表面的微觀形貌和特點。使用光電子能譜儀分析樣品的化學(xué)組成，采用15 KV、150 W、hν=1486.6 eV的單色AlKα射線，用C1s結(jié)合能為84.8 eV的標準進行能量校正。

1.4 銀離子釋放實驗

為檢驗納米銀修飾鈦表面材料銀離子的釋放情況，將Ti-PDA-Ag樣品剪裁成1 cm2大小，在37℃恒溫下浸入去離子水中，按設(shè)定的時間點（0.25 d，0.5 d，1 d，2 d，3 d，5 d，7 d，9 d，12 d，14 d）取出浸提液，每個樣品利用石墨爐原子吸收光譜儀測定其中銀離子的含量3次。

1.5 體外抗菌實驗

革蘭氏陽性菌以金黃色葡萄球菌為試驗株，革蘭氏陰性菌以大腸埃希菌為試驗菌株，檢驗鈦表面的抗菌性能，菌液均由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科凍存。操作如下：將凍存菌液加到LB液體培養(yǎng)基（Luria-Bertani培養(yǎng)基，含10 g/L蛋白胨，5.0 g/L氯化鈉和5.0 g/L牛肉膏，pH值在7.0～7.2間）中，再放到恒溫培養(yǎng)搖床37℃培養(yǎng)活化24 h。將菌液濃度調(diào)整至1×106CFU/mL（菌液濃度通過測定光密度OD值確定：在波長為600 nm條件下，0.1 OD值對應(yīng)每毫升108個細胞）。將直徑為1 cm2的鈦樣品置于24孔培養(yǎng)板中，用濃度106CFU/mL的細菌懸液500 μL與樣品在37℃生化培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)24 h后，將菌液稀釋104倍后，取100 μL在固體LB培養(yǎng)基上涂板培養(yǎng)，最后計算菌落總數(shù)，計算殺菌率（R）。

1.6 樣品表面細菌粘附實驗

以金黃色葡萄球菌為代表，按照上述步驟將共培養(yǎng)6 h的樣品用無菌生理鹽水進行清洗，然后用戊二醇溶液固定5 h，PBS清洗后，乙醇梯度脫水（濃度為25%，50%，70%，95%，100%），每個濃度乙醇溶液均脫水10 min，CO2臨界點干燥后噴金，置于掃描電鏡下觀察。

1.7 體外細胞黏附情況

小鼠前成骨細胞（MC3T3-E1）由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗科凍存。將小鼠前成骨細胞懸液濃度調(diào)整至2×104cells/mL，吸取500 μL細胞懸液分別與Ti、nTi、Ti-PDA、Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDAAg-30min和Ti-PDA-Ag-60min樣品在24孔培養(yǎng)板中37℃、5%CO2條件細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。將樣品用PBS清洗，戊二醇溶液固定5 h，再用PBS清洗，乙醇梯度脫水（濃度為25%，50%，70%，95%，100%），CO2臨界點干燥后噴金，掃描電鏡下觀察。

6組樣品按上述方法培養(yǎng)120 min后，加入4%多聚甲醛，4℃條件下30 min，再加入4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚，在室溫下反應(yīng)30 min，最后使用熒光顯微鏡觀察拍照，平均3次，觀察細胞早期黏附情況。

1.8 體外細胞毒性

將6組樣品按照上述共培養(yǎng)的步驟進行處理，選取不同時間點（1 d、3 d、5 d和7 d），生理鹽水清洗樣品后，每孔加入300 μL α-MEM和30 μL MTT溶液，孵育3 h后吹打混勻，吸取提取液后置于96孔板中，用酶標儀以樣品Ti作為對照樣在490 nm波長下測定OD值，平均3次，并進行統(tǒng)計學(xué)處理。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 材料表征及化學(xué)成分分析

樣品Ti、nTi、Ti-PDA、Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min均可通過掃描電鏡觀察。Ti通過piranha溶液（H2O2/H2SO4混合液）酸洗鈦表面，形成納米孔化結(jié)構(gòu)；多巴胺經(jīng)過一系列反應(yīng)后在納米網(wǎng)結(jié)構(gòu)的鈦表面構(gòu)建出均勻顆粒狀的聚多巴胺膜層；將聚多巴胺修飾的多孔鈦浸入硝酸銀溶液中，通過調(diào)整反應(yīng)時間，得到固定不同濃度納米銀粒子的鈦基材料（圖1）。

通過光電子能譜儀（XPS）分析Ti-PDA-Ag-30min樣品表面化學(xué)組成，XPS寬譜中400 eV左右出現(xiàn)一個較強的N 1s峰，歸屬于PDA，XPS定量結(jié)果計算其表面O/C比值為0.32，與PDA結(jié)構(gòu)理論值0.25較為接近，說明PDA成功自聚合在納米結(jié)構(gòu)化鈦表面。結(jié)合能約為370 eV處有兩個很強的Ag 3d峰，分別對應(yīng)Ag0 3d5/2（368.28 eV）和Ag0 3d3/2（374.18 eV），說明納米銀沉積在Ti-PDA表面，且以銀單質(zhì)形式存在（圖2）。

2.2 銀離子釋放實驗

Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min樣本的銀離子釋放均呈遞減的趨勢，釋放初期（2 d），銀離子釋放顯著，后期釋放趨于穩(wěn)定（圖3）。同時，隨著沉積時間的增加，銀離子的釋放總量是在增加的。至14 d，Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min樣本的銀離子累積釋放量分別相當(dāng)于其載銀總量的11.47%、14.73%和17.10%。

2.3 體外抗菌實驗

體外抗菌實驗顯示，無論單純納米結(jié)構(gòu)化的鈦還是增加了聚多巴胺修飾的鈦（Ti、nTi和Ti-PDA），對兩種細菌均未見明顯的殺滅作用，而聚多巴胺/納米銀修飾鈦表面具有較強的殺菌作用（圖4）。Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min樣本，對金黃色葡萄球菌的殺菌率分別為60.4%、100%和100%，對大腸埃希菌的殺菌率分別為83.8%、100%和100%（圖5）。

2.4 樣品表面細菌黏附實驗

細菌黏附實驗掃描電鏡結(jié)果顯示，樣本Ti、nTi和Ti-PDA表面黏附的細菌均較多，并且細菌量未見明顯差異，而樣本Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDAAg-30min和Ti-PDA-Ag-60min細菌黏附的數(shù)量大大減少，且部分發(fā)生碎裂，并且隨著納米銀含量增多而更加明顯（圖6）。

2.5 體外細胞黏附情況

各樣本表面小鼠前成骨細胞的早期黏附情況電鏡下觀察顯示，Ti樣本表面的小鼠前成骨細胞呈橢球狀和長梭形，只能見到少量偽足伸展；nTi樣本小鼠前成骨細胞呈不規(guī)則多邊形鋪展，較Ti表面伸出較多偽足；而使用聚多巴胺（PDA）活化的材料樣本（Ti-PDA、Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min），小鼠前成骨細胞呈不規(guī)則多邊形，可見其有較多偽足甚至偽足間的交聯(lián)（圖7）。

DAPI染色觀察，Ti-PDA、Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min及Ti-PDA-Ag-60min樣本MC3T3-E1細胞早期黏附的數(shù)量均較Ti及nTi明顯增多，差異顯著（P＜0.05），且Ti-PDA材料細胞早期黏附數(shù)量較其余各樣本顯著增多（P＜0.001，圖8-9）。

2.6 體外細胞毒性

MTT結(jié)果（圖10）表明，小鼠前成骨細胞與Ti、nTi、Ti-PDA、Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min材料共培養(yǎng)1 d和3 d，各組材料中細胞增殖情況無顯著差異（P＞0.05）；至培養(yǎng)5 d和7 d，Ti、nTi和Ti-PDA之間細胞增殖數(shù)量無顯著差異（P＞0.05），而Ti-PDA-Ag-15min及Ti-PDAAg-30min對小鼠前成骨細胞增殖表現(xiàn)出一定的抑制作用（P＜0.05），但增殖率仍大于90%。但是Ti-PDA-Ag-60min的增殖率已明顯降低（P＜0.001），增殖率接近于80%，與Ti-PDA-Ag-15min及Ti-PDAAg-30min樣本比較，已有較大的細胞毒性。

圖1 樣本的掃描電鏡結(jié)果Fig.1 The results of SEM observation

圖2 樣本Ti-PDA-Ag-30min的能譜分析（XPS）結(jié)果Fig.2 XPS spectra analysis of the Ti-PDA-Ag-30min samples

圖3 樣本Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDAAg-60min的銀離子釋放溶解曲線

圖4 各樣品的殺菌能力Fig.4 Typical photographs of re-cultivated colonies on agar

圖5 載納米銀樣品的殺菌率對比Fig.5 Sterilization rate of the silver nanoparticles loaded samples

圖6 樣品表面金黃色葡萄球菌黏附6 h掃描電鏡圖Fig.6 SEM observation of titanium surfaces after incubation with staphylococcus aureus for 6 hours

圖7 各樣本細胞黏附掃描電鏡觀察Fig.7 SEM observation of cell adhesion in each sample

圖8 MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)120 min粘附情況的熒光顯微鏡圖（DIPI染色）Fig.8 The fluorescence images of MC3T3-E1 cells(stained with DAPI)after cultured on different surfaces for 120 minutes

圖9 MC3T3-E1細胞共培養(yǎng)120 min黏附數(shù)目比較Fig.9 Initial cell adhesion properties of MC3T3E1 cells after cultured on different surfaces for 120 minutes

3 討論

3.1 聚多巴胺修飾納米孔化鈦表面載納米銀

Uede等[5]研究證實，H2O2/H2SO4混合液處理不同時間，會因其對基底的刻燭作用而引起鈦表面粗糙度的不同改變。不同粗糙度的材料表面又將影響骨整合和機械固定的情況，微米尺度表面結(jié)構(gòu)的材料通過與周圍的骨組織進行機械咬合而達到長期的機械穩(wěn)定性，而納米尺度表面結(jié)構(gòu)的材料則通過直接或間接的相互作用影響細胞行為，從而影響骨整合速度。譚英等[6]為了實現(xiàn)鈦表面微納米結(jié)構(gòu)復(fù)合，通過控制H2O2/H2SO4溶液的反應(yīng)時間、溫度和配比，在酸處理的亞微米“臺階”結(jié)構(gòu)鈦表面構(gòu)建了不同的納米形貌，得到微納米復(fù)合結(jié)構(gòu)；氧化液的溶解作用使得鈦表面原有的亞微米“臺階”隨著時間逐漸被刻燭，亞微米粗糙度降低；氧化后鈦表面的親水性和表面能大大提高，化學(xué)成分主要為無定型的Ti02；并推導(dǎo)了化學(xué)氧化法構(gòu)建不同納米形貌的機理，認為主要是反應(yīng)過程中鈦基底的溶解與二氧化鐵沉積反應(yīng)之間相互競爭的結(jié)果；其細胞實驗結(jié)果表明，相較于酸處理鈦片，化學(xué)氧化改性得到的微-納米多級結(jié)構(gòu)更能夠促進成骨細胞的早期黏附、增殖和分化。同時，通過H2O2/H2SO4混合液處理，使得鈦表面羥基化。

多巴胺（3,4-二經(jīng)基苯丙氨，dopamine）是3,4-二羥基苯丙氨酸（DOPA）的一種非常重要的衍生物，含有豐富的兒茶酚和乙氨基活性基團。多巴胺具有與DOPA相似的物理化學(xué)性質(zhì)，幾乎能黏附到任何材料基底上[1]。聚多巴胺之所以能在一些羥基化的材料表面形成強的黏附，是因為其中的鄰苯二酚基團可與羥基形成有強結(jié)合力的雙齒類配位體[7]。本研究中，通過piranha溶液（H2O2/H2SO4混合液）處理酸洗鈦表面，不僅納米結(jié)構(gòu)化了鈦表面，而且活化了鈦表面，使其富含羥基，增強了聚多巴胺層的結(jié)合力。另外，多巴胺能在堿性條件下形成聚多巴胺單分子層，吸附于納米網(wǎng)孔化的鈦材料表面，目前Zhang等[8]已通過實驗證實上述情況。

本實驗中，多巴胺經(jīng)過氧化、環(huán)化、分子內(nèi)重排等一系列自聚合反應(yīng)后，在納米網(wǎng)結(jié)構(gòu)的鈦表面構(gòu)建出均勻顆粒狀的聚多巴胺膜層；將聚多巴胺修飾的多孔鈦浸入硝酸銀溶液中，聚多巴胺表面的鄰苯二酚基團和醌式基團對銀離子具有絡(luò)合作用，使銀離子吸附在其表面；同時，聚多巴胺利用表面酚羥基的氧化還原性將吸附的銀離子原位化學(xué)還原成Ag納米粒子固定在基底表面[6-7]，并通過調(diào)控沉積反應(yīng)時間，可得到固定不同濃度納米銀粒子的鈦基材料。

3.2 細胞相容性

醫(yī)用金屬材料與普通金屬材料有較大的不同，醫(yī)用金屬材料的要求高，因其植入體內(nèi)后將與組織和細胞長期直接接觸，需要滿足較多的要求，包括良好的生物相容性、無毒副作用、生物活性及生物結(jié)合性好、植入體內(nèi)能夠與機體組織形成緊密結(jié)合或通過材料誘導(dǎo)組織生長等[9]。納米銀材料是一種新型的抗菌材料，但是納米銀材料潛在的細胞毒性成為其廣泛應(yīng)用的制約因素。有研究表明，銀離子產(chǎn)生的細胞毒性均于較高濃度下產(chǎn)生[10-11]。

本研究中設(shè)定15 min、30 min、60 min沉積時間點，得到3個不同的樣品Ti-PDA-Ag-15min，Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min。小鼠前成骨細胞早期黏附情況的電鏡觀察及DAPI染色觀察表明，納米結(jié)構(gòu)化鈦表面和聚多巴胺仿生膜層有利于細胞的早期黏附。MTT實驗結(jié)果表明，至培養(yǎng)后期（5 d和7 d），Ti-PDA-Ag-15min及Ti-PDA-Ag-30min對小鼠前成骨細胞的增殖顯示出一定的抑制作用，但增殖率仍大于90%，說明材料細胞毒性較低，符合0級醫(yī)用生物材料標準。但是Ti-PDA-Ag-60min的增殖率已明顯降低，接近于80%，有較大的細胞毒性。實驗發(fā)現(xiàn)，利用聚多巴胺良好的細胞相容性及生物學(xué)活性，并通過調(diào)整聚多巴胺修飾的多孔鈦浸入硝酸銀溶液的沉積反應(yīng)時間，可調(diào)整材料納米銀含量，得到既有良好生物相容性，又有較低細胞毒性的鈦基納米銀材料。

3.3 體外抗菌性能

無機抗菌劑表面改性材料與抗生素和天然抗菌劑不同，以抗菌金屬Ag、Cu、Zn等為代表的無機抗菌劑不僅具有良好的生物安全性、耐熱性、持久性以及良好的加工性能，而且具有廣譜抗菌性、高殺菌效率、不容易產(chǎn)生耐藥等優(yōu)點[12]。其主要通過添加Ag、Cu、Zn等無機抗菌劑發(fā)揮抗菌功能。有研究分析，帶正電的Ag、Cu、Zn等抗菌金屬離子可吸附至表面帶負電荷的細菌細胞膜表面，進而損傷細菌的細胞膜、細胞壁[13-14]。當(dāng)抗菌金屬離子吸附到細菌細胞膜后，可使細菌細胞膜的通透性改變，同時使細菌內(nèi)大量新陳代謝所必需的還原糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)泄漏，誘導(dǎo)細菌死亡[12，15-16]。另外，Zafar等[17]研究表明，聚多巴胺膜層結(jié)構(gòu)中存在一種苯酚類物質(zhì)，有較弱的抗菌作用，但達不到常規(guī)的抗菌要求。另外，納米銀體外抗菌性能與其含量、形狀及尺寸等有著重要關(guān)聯(lián)。Shahverdi等[18]證明，較小粒徑的納米銀具有更大的比表面積，更強的細胞穿透性，具有更強的殺菌能力。

本研究結(jié)果表明，引入納米銀的鈦基材料有高效的殺菌性。細菌生物膜形成的過程主要包括：細菌在植入物表面的黏附、增殖、分離三部分，而細菌黏附則是引發(fā)植入物感染的起始因素[19-20]。破壞細菌在金屬內(nèi)植物表面的黏附可有效減少感染的發(fā)生。掃描電鏡示，Ti、nTi和Ti-PDA樣本表面黏附的細菌均較多，且細菌量未見明顯差異，而大量的細菌黏附較易形成生物膜，當(dāng)生物膜形成后細菌將在其保護下避免受到如抗菌素等的殺傷，容易發(fā)生頑固的感染。而樣本Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min細菌黏附的數(shù)量大大減少，且部分發(fā)生碎裂，并隨著納米銀含量增多而趨于明顯，避免了細菌生物膜的形成。另外，在銀離子釋放實驗中，我們發(fā)現(xiàn)Ti-PDA-Ag-15min、Ti-PDA-Ag-30min和Ti-PDA-Ag-60min樣本的銀離子累積釋放量分別相當(dāng)于其載銀總量的11.47%、14.73%和17.10%，可以預(yù)見，納米銀修飾的鈦表面具有持久的抗菌性能。

綜合上述結(jié)果，通過納米孔化鈦表面、增加聚多巴胺涂層及載納米銀顆粒等作用，得到的新型鈦材料表面有較好的細胞黏附性能及較強的殺菌能力。銀離子有一定的細胞毒性，通過調(diào)整納米銀沉積反應(yīng)時間，可調(diào)節(jié)材料表面銀離子釋放量，得到既有較低的細胞毒性，又有較強抗菌能力的聚多巴胺/納米銀修飾鈦表面材料。聚多巴胺仿生膜層的接枝厚度可以通過控制多巴胺接枝濃度、時間等調(diào)控。因此，可以保留鈦基底納米結(jié)構(gòu)的同時，實現(xiàn)聚多巴胺膜層的仿生修飾和納米載銀；且聚多巴胺表面豐富的活性基團可以進一步接枝生物分子，根據(jù)具體臨床的需要，實現(xiàn)鈦表面的特異性功能化，擴大鈦金屬的用途。本研究只是初步的體外研究，下一步將結(jié)合內(nèi)植物材料的體表面積等因素，進行如最佳的反應(yīng)時間等的下一步研究。

[1]Lee H,Dellatore SM,Miller WM,et al.Mussel-inspired surface chemistryformultifunctionalcoatings[J].Science,2007,318 (5849):426-430.

[2]Lynge ME,van der Westen R,Postma A,et al.Polydopamine--a nature-inspired polymer coating for biomedical science[J]. Nanoscale,2013,3(12):4916-4928.

[3]De Giglio E,Cafagna D,Cometa S,et al.An innovative,easily fabricated,silver nanoparticle-based titanium implant coating: development and analytical characterization[J].Anal Bioanal Chem,2013,405(2-3):805-816.

[4]Ball V,Nguyen I,Haupt M,et al.The reduction of Ag+in metallic silver on pseudomelanin films allows for antibacterial activity but does not imply unpaired electrons[J].J Colloid Interface Sci, 2011,364(2):359-365.

[5]Ueda M,Ikeda M,Ogawa M.Chemical-hydrothermal combined surface modification of titanium for improvement of osteointegration [J].Mater Sci Eng,2009,29(3):994-1000.

[6]譚英,譚幗馨,寧成云,等.鈦表面化學(xué)氧化法構(gòu)建納米凝膠層性能及機理研究[J].稀有金屬材料與工程,2014(10):2425-2430.

[7]Ye Q,Zhou F,Liu W.Bioinspired catecholic chemistry for surface modification[J].Chem Soc Rev,2013,40(7):4244-4258.

[8]Zhang RX,Braeken L,Luis P,et al.Novel binding procedure of TiO2nanoparticles to thin film composite membranes via selfpolymerized polydopamine[J].J Membr Sci,2013,15(437):179-188.

[9]Zhang Y,Zhang M.Three-dimensional macroporous calcium phosphate bioceramics with nested chitosan sponges for loadbearing bone implants[J].J Biomed Mater Res,2002,61(1):1-8.

[10]Navarro E,Piccapietra F,Wagner B,et al.Toxicity of silver nanoparticles to Chlamydomonas reinhardtii[J].Environ Sci Technol,2008,42(23):8959-8964.

[11]Cao H,Liu X,Meng F,et al.Biological actions of silver nanoparticles embedded in titanium controlled by micro-galvanic effects[J]. Biomaterials,2011,32(3):693-705.

[12]Sawai J.Quantitative evaluation of antibacterial activities of metallic oxide powders(ZnO,MgO and CaO)by conductimetric assay[J].J Microbiol Methods,2003,54(2):177-182.

[13]Feng QL,Wu J,Chen GQ,et al.A mechanistic study of the antibacterial effect of silver ions on Escherichia coli and Staphylococcus aureus[J].J Biomed Mater Res,2000,52(4):662-668.[14]Kim JS,Kuk E,Yu KN,et al.Antimicrobial effects of silver nanoparticles[J].Nanomedicine,2007,3(1):95-101.

[15]Li WR,Xie XB,Shi QS,et al.Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles on Escherichia coli[J].Appl Microbiol Biotechnol,2010,85(4):1115-1122.

[16]Kim KJ,Sung WS,Suh BK,et al.Antifungal activity and mode of action of silver nano-particles on Candida albicans[J]. Biometals,2009,22(2):235-242.

[17]Zafar I,Edward PCL,Tyler JA.Antimicrobial effect of polydopamine coating on Escherichia coli[J].J Mater Chem,2012,22(40): 21608-21612.

[18]Shahverdi AR,Fakhimi A,Shahverdi HR,et al.Synthesis and antibacterial activity of silver nanoparticles with different sizes [J].J Nanoparticle Res,2008,10(8):1343-1348.

[19]Valappil SP,Pickup DM,Carroll DL,et al.Effect of silver content on the structure and antibacterial activity of silver-doped phosphate-based glasses[J].Antimicrob Agents Chemother,2007, 51(12):4453-4461.

[20]Mack D,Rohde H,Dobinsky S,et al.Identification of three essential regulatory gene loci governing expression of Staphylococcus epidermidis polysaccharide intercellular adhesin and biofilm formation[J].Infect Immun,2000,68(7):3799-3807.

The Influence of Reaction Time on the Biocompatibility of Polydopamine/Silver Nanoparticles Modified Porous Titanium

RONG Xicang1,ZHANG Yu2,TAN GuoXin3,TAN Ying3,NING Chengyun4,LI Mei2,LI Lihua2.1 The Affiliated Jiangmen People’s Hospital of Southern Medical University,Jiangmen 529000,China;2 General Hospital of Guangzhou Military Command,Guangzhou 510010,China;3 Faculty of Light and Chemical,Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006,China;4 College of Materials Science and Technology,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China.Corresponding author:ZHANG Yu(E-mail:luck_2001@126.com).

ObjectiveTo investigate the reaction time influence on the antibacterial property and cytocompatibility of polydopamine/silver nanoparticles modified porous titanium.MethodsA bioinspired polydopamine(PDA)layer was deposited on titanium surface by polymerization.By adjusting the response time of nanosize silver particles(15 min,30 min, 60 min)of the modified titanium,different concentration of silver nanoparticles modified titanium coated by polydopamine were prepared.Using scanning electron microscopy(SEM),cell adhesion,cell toxicity and sterilization rate examination to evaluate the in vitro biocompatibility and antibacterial properties of polydopamine modified titanium with load of different concentration of silver nanoparticles.ResultsThe modified titanium surface material with the response time of 15 min in nanosize silver particles loading,showed better cell adhesion ability,lower cytotoxicity and more satisfactory antibacterial properties than the others.ConclusionBy adjusting the reaction time of nano silver deposition,the silver ion release quantity is adjustable,and the polydopamine/silver nanoparticles modified porous titanium,which have good cell compatibility and strong antibacterial ability,can be gained.

Porous titanium;Polydopamine;Silver nanoparticles;Biocompatibility;Reaction time

R318.08

A

1673－0364（2015）05－0295－07

10.3969/j.issn.1673-0364.2015.05.003

2015年5月19日；

2015年6月28日）

國家自然科學(xué)基金項目（81271957）。

529000廣東省江門市南方醫(yī)科大學(xué)附屬江門市人民醫(yī)院（容錫滄）；510010廣東省廣州市廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院骨科醫(yī)院（張余，李梅，李麗華）；510006廣東省廣州市廣東工業(yè)大學(xué)化工輕工學(xué)院（譚幗馨，譚英）；510641廣東省廣州市華南理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院（寧成云）。

張余（E-mail：luck_2001@126.com）。