堿性蛋白酶水解小麥蛋白產(chǎn)物乳化活性研究

趙豪斌++闕斐++馮文婕

摘要 堿性蛋白酶水解小麥蛋白產(chǎn)物乳化活性研究結(jié)果表明：3個(gè)因素對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響由強(qiáng)到弱的順序?yàn)閜H值>堿性蛋白酶/小麥蛋白粉質(zhì)量>溫度，最佳酶解條件為pH值7.5、底物濃度2.5%、溫度60 ℃，此時(shí)的乳化活力指數(shù)達(dá)到最高，EAI為15.48 m2/g。研究結(jié)果可為利用小麥蛋白粉開(kāi)發(fā)天然乳化劑提供參考。

關(guān)鍵詞 小麥蛋白粉；堿性蛋白酶；正交試驗(yàn)；乳化活力指數(shù)

中圖分類號(hào) TS201.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-5739（2015）17-0314-03

Study on Emulsifying Properties of Wheat Gluten by Alkali Protease Treatment

ZHAO Hao-bin QUE Fei * FENG Wen-jie

（Department of Applied Engineering，Zhejiang Economic and Trade Polytechnic，Hangzhou Zhejiang 310018）

Abstract Through the study on the emulsifying properties of wheat gluten by alkali protease，results showed that the order on the effect of 3 factors on the emulsifying properties of wheat protein from strong to weak was pH value>alkaline protease/wheat flour quality>temperature，the optimal conditions were pH value of 7.5，temperature of 60 ℃，the ratio of proteases and substrate of 2.5%. Under above conditions，emulsifying property index reached 15.48 m2/g. This study could provide reference for the development of natural emulsifier using wheat protein powder.

Key words wheat gluten；alkali protease；orthogonal test；emulsifying property index

小麥蛋白粉為小麥淀粉生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的副產(chǎn)品，其為植物蛋白源，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有人體必需的15種氨基酸，但含有較多的疏水性和不帶電的氨基酸含量，難以與加工需求相適應(yīng)，在應(yīng)用上受到了一定的限制[1]。對(duì)小麥蛋白進(jìn)行改性，改變其溶解度，可以提高其功能特性，研究比較多的是乳化性。

目前，提高小麥蛋白乳化性的方法主要有以下4種，分別包括化學(xué)法、物理法、酶解法和基因工程法。目前，由于酶解法反應(yīng)條件溫和、能耗低，安全天然，逐漸成為研究熱點(diǎn)，Kong X Z等[2]、張銳昌等[3]、齊軍茹等[4]在小麥蛋白改性方面的研究選擇了胰酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶等，經(jīng)過(guò)效果比較，對(duì)小麥蛋白進(jìn)行改性后，則其分子結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，其酶解產(chǎn)物的一些功能性質(zhì)發(fā)生了明顯的變化，如乳化性、水溶性、起泡性等，因此可在食品及飼料開(kāi)發(fā)中得到應(yīng)用。其中，堿性酶、胰酶等在條件為堿性的條件下對(duì)小麥蛋白的水解程度較大，產(chǎn)生的改性效果也較為明顯，因此成為相關(guān)學(xué)者研究的重點(diǎn)。

本文選擇乳化活力作為試驗(yàn)的指標(biāo)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，對(duì)堿性酶水解小麥蛋白的工藝條件進(jìn)行了較為系統(tǒng)的研究，現(xiàn)將試驗(yàn)情況總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料包括濟(jì)寧和美生物工程有限公司生產(chǎn)的堿性蛋白酶、徐州澳凱小麥淀粉有限公司生產(chǎn)的小麥蛋白粉、廣東天地食品貿(mào)易有限公司生產(chǎn)的純正花生油等。藥劑包括十二烷基硫酸鈉（SDS）、三氯乙酸（TCA）、福林試劑等，其中甲醛、鹽酸、氫氧化鈉等為分析純，水為蒸餾水。儀器包括上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)的分光光度計(jì)（752N）、上海大中分析儀器廠生產(chǎn)的酸度計(jì)（pHS-25B）、國(guó)華電器有限公司生產(chǎn)的水浴鍋（HH-4）、上海滬西分析儀器廠生產(chǎn)的恒溫磁力攪拌器（90-1型）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶活性測(cè)定。采用福林-酚試劑法[5]測(cè)定蛋白酶活力。

1.2.2 小麥蛋白粉粗蛋白含量測(cè)定。采用凱氏定氮法（2010年標(biāo)準(zhǔn)）測(cè)定小麥蛋白粉粗蛋白含量。

1.2.3 小麥蛋白粉乳化性測(cè)定。測(cè)定小麥蛋白粉乳化性的方法為取0.1%蛋白溶液45 mL，加入純正花生油15 mL中，在離心速度為10 000 r/min、室溫下進(jìn)行攪拌，時(shí)間控制為1 min即可，取樣的時(shí)間分別在攪拌后的0、5、10 min，取樣的部位為底部[6]。以0.1%（w/v）的SDS稀釋100倍，對(duì)500 nm處的吸光值A(chǔ)500進(jìn)行測(cè)定，空白溶液選擇SDS。乳化活力指數(shù)EAI可用零時(shí)刻的吸光值表示，計(jì)算公式如下：

EAI=■（1）

式（1）中，EAI表明蛋白質(zhì)的乳化面積，單位為m2/g；N表示稀釋倍數(shù)；Ф表示油相所占的分?jǐn)?shù)，本試驗(yàn)中油相占1/4；C表示蛋白質(zhì)的濃度，單位為g/mL；L表示比色池光徑，單位為1 cm。

以5、10 min時(shí)刻的吸光值表示乳化穩(wěn)定指數(shù)（ESI）：

ESI=■=■（2）

式（2）中，A0表示零時(shí)刻的吸光值；At表示t時(shí)刻時(shí)的吸光值；ΔT表示時(shí)間差；ΔA表示ΔT內(nèi)的吸光值差。endprint

1.2.4 小麥蛋白粉乳化性影響的單因素考查。

（1）溫度對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響。取5份小麥蛋白粉5 g溶解在蒸餾水95 mL中，并將pH值調(diào)到8.5，加入堿性蛋白酶0.05 g，分別在40、45、50、55、60 ℃的水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，滴定的試劑選擇1 mol/L NaOH，pH值控制為8.5，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2 h后，將5份反應(yīng)樣均放在溫度為95 ℃下進(jìn)行滅酶，時(shí)間為10 min，然后按照1.2.3中的方法，對(duì)乳化活力指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

（2）pH值對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響。準(zhǔn)備5份小麥蛋白粉5g溶解于95 mL的蒸餾水中，加入適量的堿性蛋白酶（0.05 g），將pH值分別調(diào)節(jié)為7.5、8.0、8.5、9.0、9.5，然后將5份樣品均放在溫度為50 ℃的水浴鍋中反應(yīng)，滴定的試劑為1 mol/L NaOH，pH值應(yīng)保持恒定，反應(yīng)的時(shí)間達(dá)到2 h后，在溫度為95 ℃下進(jìn)行滅酶，時(shí)間控制為10 min，然后按照1.2.3中的方法，進(jìn)行乳化活力指數(shù)的計(jì)算。

（3）E/S（堿性蛋白酶/小麥蛋白粉質(zhì)量比）對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響。準(zhǔn)備5份小麥蛋白粉5 g溶解于95 mL的蒸餾水中，并將pH值統(tǒng)一調(diào)至8.5，分別加入堿性蛋白酶0.025、0.050、0.075、0.100、0.125 g，然后放在溫度為50 ℃的水浴鍋中進(jìn)行反應(yīng)，滴定的試劑選擇1 mol/L NaOH，pH值維持在8.5，反應(yīng)時(shí)間達(dá)到2 h后，5份樣品均放置在溫度為95 ℃的條件下進(jìn)行滅酶處理，時(shí)間控制在10 min，然后按照1.2.3中的方法，對(duì)乳化活力指數(shù)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以乳化活力指數(shù)為指標(biāo)，確定了三因素三水平L9（34）的正交試驗(yàn)，各因素水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品蛋白酶活力

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，樣品蛋白酶活力測(cè)得為133.05 U/g。

2.2 小麥蛋白粉粗蛋白含量

經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，小麥蛋白粉粗蛋白含量測(cè)得為75%。

2.3 溫度對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響

由圖1可知，隨著反應(yīng)溫度的增加，小麥蛋白粉的乳化活性逐漸降低。可知，反應(yīng)溫度為40℃時(shí)的小麥蛋白粉乳化活性最好。溫度在45～50 ℃之間，乳化活力指數(shù)趨于平穩(wěn)；而在50～60 ℃乳化活力指數(shù)呈下降趨勢(shì)。由圖2可知，在溫度為45 ℃時(shí)，乳化穩(wěn)定性（ESI）達(dá)到最好，說(shuō)明此時(shí)的小麥蛋白粉乳化穩(wěn)定性活性比較穩(wěn)定。

2.4 pH值對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響

由圖3可知，隨著pH值的升高，產(chǎn)物的乳化活性呈先上升后下降，在堿性條件中，氨基酸為陰離子，氨基反應(yīng)性較強(qiáng)，因此pH值增加會(huì)加速M(fèi)aillard反應(yīng)[7]，進(jìn)而促進(jìn)小麥蛋白酶解。因此，乳化活性的pH值為7.5～8.0之間較好，其他pH值范圍內(nèi)較差。由圖4可知，在5 min時(shí)刻，pH值為8時(shí)，小麥蛋白粉的乳化穩(wěn)定性達(dá)到最好；在10 min時(shí)刻，pH值為9時(shí)，小麥蛋白乳化穩(wěn)定性達(dá)到最好。

2.5 E/S（堿性蛋白酶/小麥蛋白粉質(zhì)量）對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響

由圖5可知，E/S為2.5%時(shí)乳化活性最好，EAI為12.16 m2/g；E/S為0.5%～2.5%乳化穩(wěn)定性變化趨勢(shì)呈波動(dòng)型。在選定范圍內(nèi)，乳化活性變化為下降后上升，下降后再上升的趨勢(shì)。由圖6可知，在E/S為1.50%時(shí)，小麥蛋白粉的乳化穩(wěn)定性最好。

2.6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表2、表3是堿性蛋白酶水解小麥蛋白粉的正交試驗(yàn)結(jié)果、極差以及方差分析。

由表2可知，通過(guò)正交試驗(yàn)結(jié)果和極差分析可以得到最佳改性條件為pH值7.5、E/S為2.5%、溫度為60 ℃。各因素對(duì)提高小麥蛋白粉乳化性的重要性按大小次序?yàn)閜H值>E/S>溫度。根據(jù)分析，最佳條件下的EAI為15.48 m2/g。由表2可看出，3個(gè)因素對(duì)小麥蛋白粉乳化活力指數(shù)均無(wú)顯著影響[8]。

3 結(jié)論

以乳化活力指數(shù)為指標(biāo)，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)研究了堿性蛋白酶對(duì)小麥蛋白水解最適條件。結(jié)果表明：3個(gè)因素對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響由強(qiáng)到弱的順序?yàn)閜H值>堿性蛋白酶/小麥蛋白粉質(zhì)量>溫度，最佳酶解條件為pH值7.5、底物濃度2.5%、溫度60 ℃，此時(shí)的乳化性達(dá)到最高，EAI為15.48 m2/g。各因素對(duì)小麥蛋白粉乳化性的影響都不顯著。酶法改性小麥蛋白粉生產(chǎn)乳化劑不僅成本低廉，而且天然健康，若能工業(yè)化生產(chǎn)天然食品添加劑，具有巨大的市場(chǎng)潛力。

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