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    OGG1 對(duì)PM2.5 造成人肺上皮細(xì)胞DNA 損傷的修復(fù)作用

    2015-11-27 07:07:02楊拉維王亞紅何惠娟
    現(xiàn)代醫(yī)院 2015年8期
    關(guān)鍵詞:玻片活性氧顆粒物

    楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛

    楊拉維 王亞紅 楊 騰 陳 婷 何惠娟 劉 剛:廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 廣東湛江 524001

    近年來,肺癌的死亡率日益升高,調(diào)查發(fā)現(xiàn)肺癌已經(jīng)取代肝癌成為國際上惡性腫瘤死亡的第一大原因[1]。研究表明,大氣污染物是肺癌的主要危險(xiǎn)因素[2],其中大氣顆粒物是我國城市空氣中的主要污染物之一。直徑小于或等于2.5 μm 的細(xì)顆粒物(PM2.5)在大氣顆粒物中占相當(dāng)大的比重,約為70%,是空氣中對(duì)人體健康危害最大的一類,隨著工業(yè)的發(fā)展和機(jī)動(dòng)車的增加,大氣中顆粒物污染越來越嚴(yán)重,如果長(zhǎng)期吸入顆粒物污染的空氣,必將嚴(yán)重危害人類健康[3-4]。

    細(xì)胞自身代謝和外源性的刺激都產(chǎn)生活性氧(ROS),ROS可損害各種細(xì)胞成分,包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,大量的研究表明ROS 能引起DNA 氧化損傷[5-6],DNA 氧化損傷和癌癥的發(fā)生是密切相關(guān)的。

    細(xì)胞內(nèi)8-羥基鳥嘌呤(8 -oxoG)是氧化損傷的產(chǎn)物之一,具有高的致突變性,8 -oxoG 與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。細(xì)胞內(nèi)特異識(shí)別并切除8 -oxoG 的酶稱為8 -羥基鳥嘌呤DNA糖苷酶,簡(jiǎn)稱OGG1[7-8]。OGG1 基因位于人染色體3P25 區(qū)域,屬于管家基因[9]。OGG1 基因編碼產(chǎn)物OGG1 蛋白是一個(gè)帶有AP 裂解酶活性的雙功能DNA 糖苷酶。研究結(jié)果表明OGG1 的活性與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[10-11]。

    本實(shí)驗(yàn)室前期研究了不同城市PM2.5 的成分和細(xì)胞炎癥的關(guān)系[12],發(fā)現(xiàn)不同成分的PM2. 5 能誘導(dǎo)DNA 損傷,研究了OGG1 和肺癌的關(guān)系[13],發(fā)現(xiàn)OGG1 和肺癌有顯著的相關(guān)性,因此,我們研究OGG1 對(duì)PM2.5 造成人肺上皮細(xì)胞DNA 損傷的保護(hù)作用,并探討可能的保護(hù)機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 主要儀器與試劑

    (QJS -120F 智能中流量多級(jí)顆粒采樣器(錦州利誠),QJS-100 中流量多級(jí)顆粒切割器(錦州利誠),CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司),酶標(biāo)儀(Thermo),F(xiàn)ACSCalibur 流式細(xì)胞儀(BD 公司),共聚焦顯微鏡(Leica,Bensheim,Germany),Beas - 2b 細(xì)胞,DMEM 高糖(Hyclone),胎牛血清(杭州四季青),脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑盒(Jnvitrogen,USA),MTT(Sigma),DCFH(Sigma),彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)試劑盒CometAssay?Kit (Trevigen,USA).

    1.2 PM2.5 的采集和制備

    采集PM2.5 使用QJS-120F 中流量多級(jí)顆粒采樣器,配置QJS-100 中流量多級(jí)顆粒物切割器,采樣地點(diǎn)廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究中心六樓,采樣流量100 L/min,連續(xù)采集72 h。將載有PM2.5 顆粒樣品的纖維濾膜放入超純水中,超聲振蕩15 min 以洗脫顆粒物,然后將樣品真空冷凍干燥24 h,稱重,加入一定量PBS 配制成儲(chǔ)備液,高壓滅菌,4 ℃保存,臨用前震蕩混勻。

    1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及染毒

    人肺上皮細(xì)胞(beas-2b)用含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng),細(xì)胞融合80% 時(shí)用0.25%胰蛋白酶消化傳代或用于實(shí)驗(yàn)。將前期研究已構(gòu)建的OGG1 過表達(dá)載體按照Lipofectamine 2000 說明書操作,轉(zhuǎn)染進(jìn)beas-2b,并通過Western blot 檢測(cè)beas-2b 內(nèi)OGG1 表達(dá)水平。將正常beas-2b 細(xì)胞和轉(zhuǎn)染了OGG1 過表達(dá)載體細(xì)胞分別正常培養(yǎng)到細(xì)胞融合80% 時(shí),分別加入終濃度為100 μg/ml 的PM2.5,染毒24 h。

    1.4 細(xì)胞內(nèi)活性氧水平

    分別收集染毒后的細(xì)胞,0.25%胰酶消化離心收集細(xì)胞,用PBS 漂洗兩次,加入終濃度為5 μmol/L 的DCFH -DA 染色液,37 ℃作用30 min,PBS 漂洗兩次,流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞內(nèi)二氯熒光素的平均熒光強(qiáng)度,檢測(cè)轉(zhuǎn)染OGG1 對(duì)細(xì)胞內(nèi)活性氧水平的影響。

    1.5 細(xì)胞DNA 損傷的檢測(cè)

    分別收集染毒后的細(xì)胞,用冰冷PBS 重懸細(xì)胞到1 ×105/ml,按1∶10(體積比)將細(xì)胞(1×105/ml)和融化的低熔點(diǎn)瓊脂糖LMA(37 ℃)混合,并取50 μl 加到玻片孔,將玻片放入4 ℃冰箱避光10 min 使LMA 凝固,將玻片浸泡在裂解液中,置于冰上或4 ℃裂解30 ~60 min。甩干玻片多余的裂解液,將玻片浸入新制的解旋液中避光解旋20 ~60 min。加950 ml 預(yù)冷的電泳液,將玻片放入玻片孔處,21 V,電泳30 min。將玻片取出置于水中5 min,兩次,然后置于70%酒精中5 min,低于45 ℃下干燥10 ~15 min,加入100 μl 稀釋好的SYBR Green 到凝膠孔里,置于冰箱5 min,在室溫避光干燥玻片,最后用熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡觀察。

    1.6 統(tǒng)計(jì)分析

    采用SPSS15.0 軟件進(jìn)行分析,所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)至少3 次。結(jié)果表示為(±SD)。

    2 結(jié)果

    2.1 OGG1 抑制PM2.5 誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)活性氧水平升高

    免疫印跡的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明OGG1 過表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染進(jìn)了beas-2b 細(xì)胞,并且編碼OGG1 蛋白的產(chǎn)生,使轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的OGG1 蛋白水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果表明PM2.5 能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)ROS 的水平升高,并且OGG1 能夠顯著的抑制PM2.5 導(dǎo)致的細(xì)胞ROS 升高(p<0.01)(見圖1)。這種對(duì)ROS 的抑制能力可能和OGG1 對(duì)8-oxoG 切除能力相關(guān)。

    2.2 OGG1 抑制PM2.5 誘導(dǎo)的DNA 損傷

    單細(xì)胞凝膠電泳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PM2.5 能夠?qū)е耣eas-2b細(xì)胞DNA 的損傷,損傷可能是由于PM2.5 誘導(dǎo)產(chǎn)生的細(xì)胞內(nèi)高濃度的ROS 所導(dǎo)致的,對(duì)比對(duì)照組,OGG1 過表達(dá)能夠顯著的抑制PM2.5 導(dǎo)致的DNA 損傷(p<0.01)(見圖2)。OGG1 對(duì)DNA損傷的保護(hù)可能是同其抑制細(xì)胞內(nèi)ROS 作用相關(guān)。

    圖1 免疫印跡檢測(cè)OGG1 的過表達(dá)及OGG1 對(duì)beas-2b 細(xì)胞ROS 的影響

    圖2 彗星實(shí)驗(yàn)檢測(cè)OGG1 對(duì)PM2.5 造成beas-2b 細(xì)胞DNA 損傷的修復(fù)作用

    3 討論

    近些年來,隨著工業(yè)的發(fā)展和機(jī)動(dòng)車的增加,空氣污染越來越嚴(yán)重。作為空氣質(zhì)量最重要的指標(biāo),PM2.5 指數(shù)已經(jīng)在全國各大城市實(shí)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。國內(nèi)最近統(tǒng)計(jì)研究表明,惡性腫瘤中肺癌的死亡病例數(shù)排第一位[14],越來越多的研究表明,PM2.5與哮喘、肺癌等一系列的肺部疾病的產(chǎn)生存在相關(guān)性。本實(shí)驗(yàn)研究表明,PM2.5 能夠誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生,能夠?qū)е录?xì)胞DNA 的損傷,這與之前的研究報(bào)道一致[15-16]。不同來源的PM2.5 的成分已經(jīng)被研究得非常清楚,主要是多環(huán)芳烴(PAHs)和過渡金屬元素[17],隨著對(duì)PM2.5 研究的深入,如何保護(hù)機(jī)體、減少PM2.5 對(duì)機(jī)體造成的損傷顯得非常重要。

    OGG1 是非常重要的堿基切除修復(fù)酶之一,在清除8 - oxoG,保護(hù)細(xì)胞功能方面發(fā)揮重要的作用。研究表明細(xì)胞核中的OGG1 的表達(dá)和蛋白活性都高于線粒體,線粒體中的氧化損傷和突變積累比細(xì)胞核更快。

    致癌物苯并芘Bap 是多環(huán)芳烴的重要成分之一,有研究表明Bap 能夠降低OGG1 的活性,誘導(dǎo)肺癌的產(chǎn)生[18],也有研究表重金屬導(dǎo)致的基因突變與OGG1 的活性降低有關(guān)[19],因此PM2.5的致癌很可能與PM2.5 降低OGG1 的活性相關(guān)。

    本研究表明,OGG1 的過表達(dá)對(duì)PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復(fù)和減輕作用,但對(duì)于該修復(fù)和保護(hù)作用的具體分子機(jī)制還沒有研究清楚,可能是和清除細(xì)胞內(nèi)的ROS、保護(hù)線粒體的功能相關(guān),PM2.5 是如何對(duì)線粒體造成的損傷以及OGG1 保護(hù)線粒體功能的分子機(jī)制需要后續(xù)試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。而基于OGG1 對(duì)PM2.5 造成的DNA 損傷有明顯的修復(fù)和減輕作用,OGG1 可能成為PM2.5 導(dǎo)致的肺部疾病的一個(gè)治療靶點(diǎn)。

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