球形芽孢桿菌C3—41菌株銨鹽利用特性及銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)分析

梁運(yùn)改 江瑩 金琪 蔡亞君

摘要：對(duì)球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41在不同銨鹽濃度中的生長(zhǎng)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內(nèi)時(shí)，菌株正常生長(zhǎng)并形成毒素，但是芽孢形成時(shí)間隨銨鹽濃度的升高而提前。從該菌株中提取基因組DNA，通過(guò)PCR的方法克隆了其基因組中疑似銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的編碼基因amt基因序列（GeneID： 501248970）。為了研究amt基因在T7啟動(dòng)子啟動(dòng)下的表達(dá)，構(gòu)建了表達(dá)質(zhì)粒pETAMT并轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中，對(duì)得到的重組菌株進(jìn)行活性分析。結(jié)果表明，重組菌株E-pETAMT與對(duì)照菌株E-pET28a相比具有明顯的將銨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)及將銨鹽分泌到細(xì)胞外的活性，即表明該amt基因編碼的蛋白質(zhì)在重組菌株E-pETAMT中表達(dá)并表現(xiàn)出銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性。通過(guò)KEGG軟件對(duì)C3-41菌株氮代謝途徑的分析表明，銨鹽既用于其氨基酸的合成，也是部分氨基酸的代謝產(chǎn)物。

關(guān)鍵詞：球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）；銨鹽；銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)；活性；氮代謝

中圖分類號(hào)：Q786 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2015）21-5240-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.010

Ammonium Utilitation and Ammonium Transporter Analysis of

Lysinibacillus sphaericus C3-41 Strain

LIANG Yun-gai， JIANG Ying， JIN Qi， CAI Ya-jun

（Environmental Engineering College， Wuhan Textile University， Wuhan 430073， China）

Abstract： The effect of ammonium on Lysiniacillus sphaericus C3-41 strain was studied， and the result showed that， at the concentration of 0.5～4.0 g/L，C3-41 strain grew in similar level and expressed binary toxins normally， but spores formed earlier at high concentration.The putative ammonium transporter encoding gene （amt， GeneID： 501248970） was cloned by PCR from Lysinibacillus sphaericus C3-41 genomic DNA. To express amt gene under T7 promoter （a vegetative promoter），the recombinant plasmid pETAMT was constructed and transformed into Escherichia coli BL21 strain. The generated recombinant strain E-pETAMT could transport ammonium into the cell and secrete ammonium to the extracellular. This result indicated that the protein encoding by amt gene had the activity of ammonium transporter. KEGG analysis of nitrogen metabolism for strain C3-41showed that ammonium could be used for amino acid synthesis，but also was the metabolite product of some amino acids.

Key words： Lysinibacillus sphaericus； ammonium； ammonium transporter； activity； nitrogen metabolism

氮素是所有生物體必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而銨離子是最容易被生物體吸收利用的氮源形式。銨離子在氮素代謝中有著重要地位，它既是生物體內(nèi)所有氮源的最終代謝產(chǎn)物，同時(shí)也是生物體內(nèi)合成的核酸、氨基酸和輔因子等含氮類化合物的底物，因此，在維持生物體內(nèi)的氮素動(dòng)態(tài)平衡中，相對(duì)穩(wěn)定的銨離子庫(kù)具有重要意義。銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)是一類存在于真核生物或原核生物細(xì)胞膜上的、能主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)NH4+的載體，它可將細(xì)胞所處環(huán)境中的微量NH4+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)成為其自身氮源，確保細(xì)胞內(nèi)的NH4+濃度穩(wěn)定和細(xì)胞代謝的正常進(jìn)行。近年來(lái)，有關(guān)銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆及功能鑒定的研究已有較多報(bào)道，銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因主要包括amtB、mep和rh三大類。其中mep基因主要分布在酵母中，rh基因主要分布在獼猴中，研究比較詳盡的是amtB基因，分布在細(xì)菌、古生菌和真核生物中，在不同類群中高度保守。其中在細(xì)菌中主要分布于氨氧化細(xì)菌、雀稗固氮菌、巨胞氮單胞菌、敏捷氮單孢菌、谷氨酸棒狀桿菌和枯草芽孢桿菌中[1]。

球形芽孢桿菌（Lysiniacillus sphaericus）C3-41菌株是中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所蟲(chóng)媒病毒媒介控制學(xué)科組分離的一株對(duì)蚊幼蟲(chóng)高毒力的菌株，是中國(guó)第一個(gè)登記注冊(cè)的微生物殺蚊劑商品制劑。但是該菌在生產(chǎn)時(shí)不能利用糖類物質(zhì)，其生長(zhǎng)和提供能量的碳源只能由富含氨基酸的含氮物質(zhì)提供。國(guó)外多采用胨化牛奶、合成和半合成的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，發(fā)酵成本高；而國(guó)內(nèi)普遍采用的是由農(nóng)副產(chǎn)品（黃豆粉、花生餅粉、棉子餅粉、玉米浸出液和魚(yú)粉等）組成的培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，成本雖低，但由于其代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量氨類物質(zhì)，導(dǎo)致發(fā)酵液pH過(guò)高，影響菌株的生長(zhǎng)和毒素的形成，發(fā)酵液的菌數(shù)和毒力均不高，也影響了該菌株作為安全高效的生物殺蟲(chóng)劑的大規(guī)模推廣應(yīng)用[2]。為研究該菌株對(duì)銨鹽利用的特性，解決其發(fā)酵時(shí)易受氨類物質(zhì)影響的問(wèn)題，本試驗(yàn)首先研究了不同濃度銨鹽對(duì)球形芽孢桿菌C3-41菌株的菌體生長(zhǎng)、芽胞形成及毒素表達(dá)的影響；其次對(duì)2008年完成的球形芽孢桿菌C3-41菌株全基因組[3]測(cè)序中的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的編碼基因（初步命名為amt）進(jìn)行了研究，將amt基因在T7啟動(dòng)子調(diào)控下進(jìn)行了原核表達(dá)，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物是否具有銨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)及分泌的活性進(jìn)行了分析；此外，通過(guò)KEGG軟件對(duì)C3-41菌株的氮代謝途徑進(jìn)行了分析。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

球形芽孢桿菌C3-41菌株為中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所蟲(chóng)媒病毒媒介控制學(xué)科組分離保藏，大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、BL21為筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存菌株。LB培養(yǎng)基（每升含10 g 蛋白胨，5 g酵母粉，10 g NaCl）：氨芐青霉素和卡那霉素使用濃度分別為50 μg/mL 和30 μg/mL。G-Tris培養(yǎng)基：每100 mL含1 mL 0.8% CaCl2·H2O，1 mL 20% （NH4）2SO4（添加量可按試驗(yàn)需要變動(dòng)），1 mL 20% 葡萄糖，5 mL 1 mol/L Tris-HCl pH 7.5，1 mL 5% K2HPO4，1 mL G-Tris鹽母液（含0.025% FeSO4·H2O，0.05% CuSO4，0.05% ZnSO4·7H2O，0.5% MnSO4·H2O，2.0% MgSO4），0.15 g酵母粉，pH 7.4。

1.2 主要試劑與儀器

所用內(nèi)切酶以及用于質(zhì)粒提取、PCR產(chǎn)物回收和DNA片段快速純化試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司；其余常規(guī)試劑均為Sigma進(jìn)口分裝。主要儀器有美國(guó)Biotec synergy HT全波長(zhǎng)自動(dòng)酶標(biāo)儀，美國(guó)ABI 9800 PCR 儀，電泳系統(tǒng)為美國(guó)BioRad DNA 電泳系統(tǒng)和蛋白質(zhì)電泳系統(tǒng)。

1.3 不同銨鹽濃度對(duì)球形芽孢桿菌C3-41菌株生長(zhǎng)及毒素表達(dá)的影響分析

將菌株接入5 mL LB液體培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)過(guò)夜后按1∶100比例轉(zhuǎn)接入含不同濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 g/L）（NH4）2SO4的G-Tris 培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)，在培養(yǎng)的0、8、24、48、72、96 h取樣。將樣品置于4 ℃冰箱中保存，至取樣完畢后對(duì)菌體生長(zhǎng)狀況、芽孢數(shù)及菌體二元毒素表達(dá)進(jìn)行測(cè)定分析。

菌體生長(zhǎng)狀況分析方法：以吸光度表示菌體的生長(zhǎng)狀況，利用分光光度計(jì)測(cè)定樣品在600 nm波長(zhǎng)下的吸光度（OD600 nm），它是追蹤液體培養(yǎng)物中微生物生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)方法。

芽孢計(jì)數(shù)方法：取100 μL樣品離心，菌體用無(wú)菌水洗滌3次后加1 mL無(wú)菌水充分振蕩搖勻，80 ℃水浴處理20 min，然后將濃度進(jìn)行系列梯度（10-3、10-4、10-5、10-6、10-7）稀釋，每個(gè)稀釋濃度涂布3個(gè)LB固體平板，30 ℃培養(yǎng)過(guò)夜后對(duì)平板上長(zhǎng)出的菌落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

二元毒素的表達(dá)分析方法：球形芽孢桿菌對(duì)蚊幼的毒力主要依賴于在芽孢期產(chǎn)生的二元毒素。二元毒素是由等量的41.9 ku BinA和51.4 ku BinB蛋白質(zhì)多肽組成，二者的同時(shí)存在是形成伴孢晶體所必需的，缺一不可。對(duì)菌株二元毒素表達(dá)的分析通過(guò)SDS-PAGE電泳進(jìn)行。SDS-PAGE分析方法參照文獻(xiàn)[4]。

1.4 DNA的提取

大腸桿菌質(zhì)粒DNA提取參照文獻(xiàn)[4]小量堿法進(jìn)行。芽孢桿菌菌株的總DNA提取參照蔡亞君等[5]的方法進(jìn)行提取。

1.5 幾丁質(zhì)酶基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)Genbank中球形芽孢桿菌C3-41菌株的銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)基因amt的ORF（GeneID：501248970）全序列設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物，引物序列為：AMT1：5′-GGATCCGGGATGGAGGAAATAATATTATC-3′（下劃線為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），AMT2：5′-GTCGACGGGTTATATGTGTTGTTCTTCTTG-3′（下劃線為SalⅠ酶切位點(diǎn)）。擴(kuò)增體系為：芽孢桿菌總DNA 0.1 μg，10×PCR reaction buffer 2.5 μL，2.5 pmol dNTPs，Taq DNA polymerase 1 U，引物各10 pmol，加ddH2O至25 μL。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性30 s，60 ℃退火90 s，72 ℃延伸3 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸7 min。

1.6 用于amt基因原核表達(dá)的重組質(zhì)粒的構(gòu)建

以球形芽孢桿菌C3-41菌株總DNA為模板，AMT1/AMT2為引物，PCR擴(kuò)增得到amt基因ORF，其兩端分別帶有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點(diǎn)，PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化回收后進(jìn)行BamHⅠ/SalⅠ雙酶切。雙酶切后的PCR片段與表達(dá)質(zhì)粒pET28a BamH Ⅰ/Sal Ⅰ酶切后的片段連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli BL21后在卡那霉素抗性LB平板上篩選克隆子，隨機(jī)挑取菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為amt基因在質(zhì)粒pET28a T7啟動(dòng)子控制下表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名為pETAMT。

1.7 Amt蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性分析

將質(zhì)粒pETAMT轉(zhuǎn)化E. coli BL21，質(zhì)粒經(jīng)酶切驗(yàn)證后得到在T7啟動(dòng)子下表達(dá)Amt蛋白質(zhì)的重組菌株E-pETAMT，同時(shí)將表達(dá)質(zhì)粒pET28a轉(zhuǎn)化菌株E. coli BL21后形成用于對(duì)照的重組菌株E-pET28a。

銨鹽吸收試驗(yàn)：將重組菌株置于LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，取1 mL培養(yǎng)液離心收集菌體；菌體用無(wú)菌水洗滌后轉(zhuǎn)接入100 mL銨鹽濃度分別為0.1、1.0、10.0 mmol/L的G-Tris培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并于6、12、24 h時(shí)取樣檢測(cè)銨鹽濃度。

銨鹽分泌試驗(yàn)：將重組菌株置于LB液體培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行活化培養(yǎng)，取1 mL培養(yǎng)液離心收集菌體；菌體用無(wú)菌水洗滌后轉(zhuǎn)接入100 mL不添加硫酸銨的G-Tris培養(yǎng)基中，于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，并于6、12、24 h時(shí)取樣檢測(cè)銨鹽濃度。

銨鹽濃度測(cè)定通過(guò)納氏試劑比色法[6]進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 銨鹽濃度對(duì)球形芽孢桿菌C3-41菌株生長(zhǎng)及毒素表達(dá)的影響

2.1.1 銨鹽濃度對(duì)C3-41菌株菌體生長(zhǎng)的影響 在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內(nèi)，不同銨鹽濃度對(duì)培養(yǎng)基的初始pH影響不大，pH為7.5～8.0，在芽孢萌發(fā)的適合pH內(nèi)[7]；加入C3-41菌液培養(yǎng)后，培養(yǎng)液的pH維持在7.0～8.5，也始終處于適合C3-41菌體生長(zhǎng)的范圍內(nèi)（pH 3～9）[2]。對(duì)樣品的生長(zhǎng)狀況檢測(cè)結(jié)果（圖1）表明，在銨鹽濃度為0.5～4.0 g/L范圍內(nèi)，其所導(dǎo)致的培養(yǎng)基不同初始pH對(duì)C3-41菌體生長(zhǎng)影響不大。在培養(yǎng)的0～8 h，菌體生長(zhǎng)都處于延滯期；培養(yǎng)到8～24 h ，菌體生長(zhǎng)開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；到培養(yǎng)24 h以后，菌體生長(zhǎng)均進(jìn)入緩慢生長(zhǎng)時(shí)期；在培養(yǎng)至96 h時(shí)，樣品的OD600 nm取得最大值，分別為1.095、1.162、1.094、0.965、1.393。

2.1.2 銨鹽濃度對(duì)C3-41菌株芽孢形成的影響 通過(guò)對(duì)C3-41菌株在含不同濃度銨鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的不同時(shí)段的菌液中的芽孢進(jìn)行計(jì)數(shù)，得到結(jié)果如表1所示。由表1可知，在含不同濃度銨鹽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，芽孢數(shù)均隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增加；且在相同時(shí)間段的樣品中，芽孢數(shù)總體上隨著銨鹽濃度的增加而增加，銨鹽濃度越高，芽孢形成的時(shí)間越早。

2.1.3 銨鹽濃度對(duì)C3-41菌株二元毒素形成的影響 取100 μL C3-41菌株在不同銨鹽濃度培養(yǎng)基中培養(yǎng)至96 h的菌液進(jìn)行離心，并用無(wú)菌水洗滌菌體后進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果（圖2）表明，在0.5～4.0 g/L銨鹽濃度范圍內(nèi)，不同濃度及其所導(dǎo)致的培養(yǎng)基不同初始pH對(duì)C3-41菌體二元毒素的形成沒(méi)有顯著影響，各樣品的二元毒素都能正常表達(dá)，41.9 ku和51.4 ku蛋白質(zhì)條帶均可見(jiàn)。

2.2 Amt蛋白質(zhì)的生物信息學(xué)分析

2.2.1 Amt蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 根據(jù)amt基因的氨基酸序列，通過(guò)蛋白質(zhì)序列分析工具ProtParam（http：//www.expasy.ch/toots/protparam.html）分析Amt蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量、理論等電點(diǎn)（pI）、氨基酸組成及半胱氨酸（Cys）數(shù)目、帶正電荷的氨基酸（Arg+Lys）和帶負(fù)電荷的氨基酸（Asp+Glu）數(shù)目。結(jié)果顯示，蛋白質(zhì)由433個(gè)氨基酸殘基組成，分子質(zhì)量為45 627.1 u，pI為5.40，含2個(gè)Cys，Arg+Lys為18個(gè)，Asp+Glu為28個(gè)。

2.2.2 Amt蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè) 采用ProtParam工具進(jìn)行Amt蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，Amt蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中含有大量的α螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲，α螺旋占48.27%，無(wú)規(guī)則卷曲占43.19%，延伸鏈占8.55%，無(wú)β轉(zhuǎn)角。

2.2.3 Amt蛋白質(zhì)跨膜區(qū)域預(yù)測(cè) 采用ProtParam工具進(jìn)行Amt蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)在線預(yù)測(cè)，結(jié)果（圖3）顯示，Amt蛋白質(zhì)有11個(gè)胞內(nèi)向胞外的跨膜結(jié)構(gòu)域和10個(gè)胞外向胞內(nèi)的跨膜結(jié)構(gòu)域。

2.2.4 Amt蛋白質(zhì)序列分析 將amt基因翻譯得到的Amt蛋白質(zhì)序列與Genbank中其他銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示球形芽孢桿菌的Amt蛋白質(zhì)序列與芽孢桿菌屬菌株Lysinibacillus fusiformis、Bacillus sp. B14905、L. boronitolerans、L. sphaericus、B. isronensis、B. licheniformis的Amt蛋白序列相似性分別為97%、96%、94%、89%、71%和61%，與2個(gè)Escherichia coli菌株的Amt蛋白質(zhì)序列相似性均為 28%，結(jié)果見(jiàn)圖4。說(shuō)明該蛋白質(zhì)種內(nèi)差異性小，種間差異性大。

2.3 用于Amt蛋白質(zhì)表達(dá)的重組菌株的構(gòu)建

正確的克隆質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ/SalⅠ雙酶切后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收amt基因片段（1 302 bp），與表達(dá)質(zhì)粒pET28a BamHⅠ/SalⅠ酶切后的片段（5 369 bp）連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α后在卡那霉素抗性LB平板上篩選克隆子，隨機(jī)挑取菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行BamHⅠ/SalⅠ酶切鑒定，鑒定正確的質(zhì)粒即為amt基因在質(zhì)粒pET28a T7啟動(dòng)子控制下表達(dá)的重組質(zhì)粒，命名為pEAmt，結(jié)果見(jiàn)圖5。將質(zhì)粒pEAmt轉(zhuǎn)化入E. coli BL21，得到用于誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌株E-pEAmt。

2.4 重組菌株的銨鹽吸收測(cè)定

將重組菌株E-pEAmt和E-pET28a在分別含有0.1、1.0、10.0 mmol/L銨鹽的G-tris培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min條件下培養(yǎng)，于6、12、24 h取樣檢測(cè)OD600 nm及銨鹽濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，在含有銨鹽的培養(yǎng)基中，在同樣條件下培養(yǎng)時(shí)，菌株E-pEAmt的生長(zhǎng)量明顯高于菌株E-pET28a，表明菌株E-pEAmt比菌株E-pET28a能更好地利用銨鹽用于菌體生長(zhǎng)，且在0.1～10.0 mmol/L銨鹽濃度范圍內(nèi)，銨鹽濃度變化對(duì)菌體生長(zhǎng)影響不大。在培養(yǎng)過(guò)程中，菌株E-pET28a培養(yǎng)液從培養(yǎng)6 h起即產(chǎn)生銨鹽積累，比原始培養(yǎng)基中銨鹽濃度顯著提高，而菌株E-pEAmt培養(yǎng)液則在培養(yǎng)24 h時(shí)才出現(xiàn)少量銨鹽積累。綜合以上結(jié)果，表明菌株E-pEAmt通過(guò)amt基因的表達(dá)，具備了將銨鹽轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的功能。

2.5 重組菌株的銨鹽分泌測(cè)定

將重組菌株E-pEAmt和E-pET28a在不添加硫酸銨的G-tris培養(yǎng)基中于37 ℃、200 r/min條件下進(jìn)行培養(yǎng)，于6、12、24 h取樣檢測(cè)OD600 nm及銨鹽濃度，結(jié)果（表3）顯示，2個(gè)重組菌株生長(zhǎng)量無(wú)顯著差別，二者在培養(yǎng)初期都從培養(yǎng)基中吸收銨鹽，使培養(yǎng)基中銨鹽濃度降低，但隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)、菌體數(shù)量的增多，菌株E-pEAmt培養(yǎng)液中銨鹽濃度增加，結(jié)合表2的結(jié)果，表明菌株E-pEAmt在培養(yǎng)初期利用培養(yǎng)基中的銨鹽作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而此后由于菌株的代謝又會(huì)產(chǎn)生大量銨鹽，將銨鹽分泌到細(xì)胞外。

3 討論

在本研究中，首先對(duì)球形芽孢桿菌C3-41菌株在不同銨鹽濃度的G-tris培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)及毒素表達(dá)進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示，在含量高達(dá)4.0 g/L（約3 mol/L）的銨鹽培養(yǎng)基中其菌體生長(zhǎng)量基本不受影響，也能正常表達(dá)二元毒素，但是其芽孢的形成時(shí)間隨銨鹽濃度升高而提前。通過(guò)對(duì)球形芽孢桿菌C3-41菌株的全基因組測(cè)序結(jié)果分析，其中含有一個(gè)編碼假定銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的amt基因，本研究將amt基因在T7啟動(dòng)子下于大腸桿菌中表達(dá)，其重組菌株既能吸收銨鹽，也能將銨鹽由體內(nèi)分泌到體外，表明該amt基因在C3-41菌株中編碼的確實(shí)是銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)。通過(guò)KEGG軟件對(duì)C3-41菌株的氮代謝途徑進(jìn)行分析，如圖6所示，該菌株不能利用糖類物質(zhì)（N-乙酰氨基葡萄糖除外）作為碳源，也不能利用無(wú)機(jī)氮作為氮源，只能利用氨基酸、蛋白質(zhì)，其分析結(jié)果與之前對(duì)C3-41菌株?duì)I養(yǎng)需求的研究結(jié)果[8]基本一致。在該分析結(jié)果中，銨鹽既用于合成氨基酸，也是多個(gè)氨基酸的降解產(chǎn)物，這也表明其菌體中銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)存在的必要性；另外發(fā)現(xiàn)，C3-41菌株能將銨鹽合成纈氨酸和異亮氨酸，但這兩種氨基酸卻不能降解生成氨類物質(zhì)。對(duì)球形芽胞桿菌C3-41菌株銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)及銨鹽代謝的分析有助于指導(dǎo)其發(fā)酵工業(yè)生產(chǎn)。

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