HPLC法對鉤藤超臨界萃取物中鉤藤堿的分析

曾啟華 李森柱 王蒙 林錦良

摘要：通過超臨界二氧化碳萃取技術(shù)（SFE-CO2）和高效液相色譜法（HPLC），以甲醇-水（70∶30，V/V）為流動相，對鉤藤堿進行分析。研究表明，方法回歸方程為y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994），即鉤藤堿濃度在0.015～0.022 mol/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。該分析方法快速、簡單、靈敏，具有良好的準(zhǔn)確度和精密度，可用于鉤藤堿常規(guī)分析檢驗。

關(guān)鍵詞：HPLC法；超臨界萃??；鉤藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jack.]；鉤藤堿

中圖分類號：O629.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5398-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.050

Study on the HPLC Method for Analysis of Rhynchophylline Extracted

from Uncaria tomentosa by Supercritical Fluid

ZENG Qi-hua1，2，LI Sen-zhu1，WANG Meng1，LIN Jin-liang1，2

（1.College of Chemical Engineering， Zunyi Normal College， Zunyi 563002， Guizhou， China； 2. Laboratory of Utilization Research on Characteristic Resources in Qianbei of Guizhou Province， Zunyi 563002， Guizhou， China）

Abstract：The analysis of rhynchophylline by the means of supercritical carbon dioxide extraction technology and high performance liquid chromatography （HPLC） analytic method with methanol and water （70∶30，V/V） as mobile phase. The results showed that regression equation for y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994）， and the linear relationship was good in the region of 0.015～0.015 mol/mL. The analysis method was rapid， simple， sensitive and has good accuracy and precision， can be used for routine analysis of rhynchophylline.

Key words：HPLC；supercritical fluid exaction； uncaria tomentosa；rhynchophylline

中草藥材鉤藤是茜草科茜草屬鉤藤[Uncaria rhynchophylla（Miq.）Jack.]、大葉鉤藤（Uncariamacophylla Wall.）、毛鉤藤（Uncaria hirsute Havil.）、華鉤藤[Uncariasinensis（Oliv.）Havil.]或者無柄果鉤藤（Uncaria sessilifmctus Roxb.）的帶鉤干燥枝莖[1]，始載于中古代醫(yī)學(xué)典著《名醫(yī)別錄》，這味中藥材在中國已有幾十年研究歷史。現(xiàn)代研究表明，其含吲哚類生物堿，如鉤藤堿（rhynchophylline），異鉤藤堿（iso-rhynchophylline）能夠抑制外周血管收縮，降低血管阻力，降低血壓，因此臨床上廣泛應(yīng)用于抗高血壓以及抗血栓形成和抗血小板聚集等病癥的治療[2-5]。

對于鉤藤堿的有效提取方法，傳統(tǒng)前處理方法中大多采用倒回流提取法[6]，目前只有少量關(guān)于超臨界二氧化碳超臨界萃取技術(shù)（SFE-CO2）在鉤藤堿分離的應(yīng)用報道。超臨界萃取有速率快、易操作、溫度低，保護熱敏性物質(zhì)、萃取物及其萃余物均無有機溶劑污染等優(yōu)點。超臨界狀態(tài)下的二氧化碳對固態(tài)的物質(zhì)有極強的穿透力，對芳香類化合物萃取性能強，所以超臨界萃取技術(shù)在天然產(chǎn)物的有效成分及香精香料的提取方面具有廣泛的應(yīng)用[7]。

鉤藤質(zhì)量的評價標(biāo)準(zhǔn)多以鉤藤堿和異鉤藤堿的含量為指標(biāo)。因此，建立便捷、準(zhǔn)確的分析方法有助于鉤藤藥材的質(zhì)量控制。有大量的文獻報道了傳統(tǒng)鉤藤萃取液中分析鉤藤堿（異鉤藤堿）的方法，然而，對于超臨界萃取物中的鉤藤堿等的分析鮮見報道。本研究利用高效液相色譜法（HPLC）對超臨界萃取物鉤藤堿進行分析，為鉤藤堿的開發(fā)和利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗儀器

STF-110超臨界萃取儀（美國SUPERCRITICAL FLUID TECHNOLOGIES公司）；LC-20AD高效液相系統(tǒng)（日本SHIMADZU公司）；FA-JA型電子分析天平（上海越平儀器有限公司）；SB-5200型超聲波提取儀（上海德洋意邦有限公司）。

1.2 試劑與材料

鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)對照品（純度≥99%），購于上海研晶生化試劑有限公司；甲醇為色譜純（純度≥ 99.9%），購自Yirenda Chemicals公司；超純水（自制）；純度為99.999%二氧化碳和氮氣均由貴陽申建氣體公司提供；無水乙醇，乙腈等試劑均為市售分析純。

鉤藤試樣購于遵義康城醫(yī)藥有限公司，產(chǎn)于廣西，打磨成約40目和20目粉末各500 g。

1.3 試驗方法

1.3.1 鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取4.200 mg鉤藤堿，置于10 mL 容量瓶中，無水甲醇定容，濃度為0.42 mg/mL的溶液，作鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)對照液，靜置0.5 h，經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，備用。

1.3.2 制備樣品 用SFE-CO2提取鉤藤藥品，萃取釜溫度為40 ℃，背壓閥溫度為55 ℃；CO2流速為15 mL/min；夾帶劑（無水乙醇）流速為15 mL/min。在壓力2 000 kPa靜態(tài)萃取30 min，動態(tài)萃取30 min[8]，進行2次超臨界萃取所得，超聲波輔助溶解于甲醇，備用。平均室溫為19 ℃，平均濕度為47%。

1.3.3 樣品溶液制備 精密稱取0.100 g鉤藤提取物細(xì)粉，置于10 mL容量瓶中，加無水甲醇至刻度，靜置0.5 h，滴加無水甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)過0.45 μm微孔濾膜過濾，取濾液，備用。

1.3.4 色譜條件 色譜柱為Phenomenex C8 （250 mm×4.6 mm，5 μm）；無水甲醇-水（70∶30，V/V）作流動相，并有無水乙醇（純度≥99.7%）夾帶劑；柱溫為30 ℃；流速為0.5 mL/min；檢測波長為254 nm。進樣量為20 μL，平均室溫為19 ℃，平均濕度為47%[9-11]。

1.3.5 線性范圍考察 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液1.00、1.25、1.67、2.50、3.41 mL至50 mL容量瓶中，補加甲醇稀釋至刻度線，分別標(biāo)號為1號到5號，搖勻，靜置0.5 h，定容。置于高效液相色譜儀，精密吸取20 μL，按前述色譜條件分別進樣，測定各峰面積。以峰面積為橫坐標(biāo)，樣品濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程。

1.3.6 回收率及精密度試驗 精密稱取鉤藤提取物細(xì)粉0.100 g，分別加入高、中、低濃度的對照品溶液，其他步驟同樣品處理方法，測定加樣回收率。取3種不同濃度的鉤藤堿溶液，各濃度重復(fù)測定5次，計算其濃度和精密度（RSD）。

1.3.7 樣品測定 取鉤藤提取物樣品溶液20 μL，按前述色譜條件進樣，測定含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 線性關(guān)系考察結(jié)果

以峰面積為橫坐標(biāo)，以鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為縱坐標(biāo)，進行回歸分析，得到回歸方程為y=7.000 0×10-8x-0.000 6（R2=0.994），當(dāng)濃度在0.015～0.022 mol/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，見圖1。

2.2 回收率、精密度試驗結(jié)果

結(jié)果表明，方法的平均回收率為97.35%，RSD為1.83%，符合測定基本要求。表明該方法簡單、準(zhǔn)確、快速，可用于該實驗中鉤藤堿含量的測定[12，13]。

2.3 樣品含量測定

鉤藤堿標(biāo)準(zhǔn)溶液及樣品HPLC色譜圖分別如圖1、圖2所示。測得鉤藤提取物中鉤藤堿含量為12.68%。

3 小結(jié)與討論

（1）本研究與同類中藥超臨界萃取最佳萃取條件相比[14，15]，鉤藤堿在超臨界狀態(tài)下萃取率相對較低，但仍能得到一定的產(chǎn)量。而且SFE法萃取鉤藤堿體現(xiàn)了簡單、快速的優(yōu)勢。

（2）HPLC法測定鉤藤堿回歸方程表明，鉤藤堿在0.015～0.022 mol/mL內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。此法可用于鉤藤提取物中鉤藤堿的含量分析，為鉤藤堿的分離、鑒定提供依據(jù)。在后續(xù)的研究中，結(jié)合質(zhì)譜分析技術(shù)，對產(chǎn)物的組成將有更深入的了解。

（3）鉤藤堿的含量測定方法有高效液相色譜法、薄層掃描法，國家標(biāo)準(zhǔn)采用了薄層掃描法測定其含量，但結(jié)果證明，薄層掃描法重復(fù)性較差，不宜采用[11]。吳衛(wèi)等[13]采用了C18柱高效液相色譜法測定鉤藤堿的含量，結(jié)果表明該法準(zhǔn)確。本研究采用C8柱，柱效更佳，試驗條件可以對超臨界提取物的分析中推廣。

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