黃芩懸浮細(xì)胞培養(yǎng)過程中黃芩苷與蛋白質(zhì)含量相關(guān)性分析

張東向 焦戰(zhàn)戰(zhàn) 張令昂 邱全權(quán) 趙靜 劉麗潔

摘要：以黃芩懸浮細(xì)胞為材料研究其生長過程中蛋白質(zhì)含量變化規(guī)律及與黃芩苷次生合成之間的關(guān)系。結(jié)果表明，在黃芩懸浮細(xì)胞生長周期（21 d）內(nèi)，蛋白質(zhì)含量的高低與黃芩苷的積累呈正相關(guān)。在黃芩懸浮細(xì)胞生長周期的前6 d，懸浮細(xì)胞處于潛伏期，蛋白質(zhì)含量低水平表達(dá)，黃芩苷合成緩慢； 6～18 d，懸浮細(xì)胞處于生長期，蛋白質(zhì)的含量高水平表達(dá)，合成速率較快，這期間黃芩苷也迅速合成； 18～21 d，懸浮細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期，此時蛋白質(zhì)含量處于穩(wěn)定期，黃芩苷合成也幾乎停止。同時采用L9（34）正交試驗研究培養(yǎng)基中6-BA、碳源、氮源、pH的配比對蛋白質(zhì)含量表達(dá)的影響，結(jié)果表明碳磷源（NH4+）對蛋白質(zhì)的表達(dá)影響最大。

關(guān)鍵詞：黃芩；懸浮細(xì)胞；黃芩苷；蛋白質(zhì)含量；正交試驗

中圖分類號：R282.71 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）21-5338-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.21.033

Analyses of the Correlation between Baicalin and Protein Content in the

Scutellaria Suspension Cells

ZHANG Dong-xiang， JIAO Zhan-zhan， ZHANG Ling-ang，Qiu Quan-quan ZHAO Jing， LIU Li-jie

（College of Life Science and Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： Taking the scutellaria suspensioncells as the material， the relationship between the protein content and baicalin secondary synthesis in the growth process of the scutellaria suspension cells was investigated. The results showed that during the growth cycle （21 days） of the scutellaria suspension cells， the content of protein and the accumulation of baicalin was positively correlated. During the former 6 days of the growth cycle of the scutellaria suspension cells， the skullcap cells was in incubation period， the content of the protein express at a low level and the synthesis of baicalin was slow. During 6 to 18 days， the cells was in its growing phase， the content of protein expressed at high levels， at the same time baicalin rapidly synthetised. During 18 to 21 days， the cells was in its stable period， the content of baicalin was also in its stable period， the synthesis of baicalin almost stopped， meantime， L9（34） orthogonal table was used to optimize the ratio of medium 6-BA， carbon sources， nitrogen sources and pH， it was conducted that carbon sources had the maxium influence on the protein expression.

Key words： Scutellaria Baicalensis Georgi； scutellaria suspension cells； Baicalin； protein content； orthogonal experiment

中藥黃芩為唇形科植物黃芩（Scutellaria baicalensis Georgi）的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血安胎等功效[1]。其主要成分黃芩苷（Baicalin），具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗血栓形成和保護(hù)肝臟、心腦血管、神經(jīng)元等作用[2]。大多數(shù)酶都是蛋白質(zhì)，而酶的活性又與次生代謝有關(guān)聯(lián)，比如黃芩體內(nèi)過氧化物酶能夠催化黃芩有效成分黃芩苷與過氧化氫反應(yīng)生成黃芩素[3，4]。孫守慧等[5]研究楊樹次生代謝物質(zhì)與青楊天牛酶活性的關(guān)系，任振興等[6]研究表明黃芩愈傷組織中多酚氧化酶活性與黃芩苷合成有相關(guān)性。為此，研究了黃芩懸浮細(xì)胞中黃芩苷與蛋白質(zhì)含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芩懸浮細(xì)胞（實驗室篩選，來源于黃芩懸浮細(xì)胞的誘導(dǎo)[7]）。繼代培養(yǎng)基：液體SM培養(yǎng)基（附加1.0 mg/L的6-BA和0.2 mg/L的2，4-D），蔗糖3%，pH 5.8，暗培養(yǎng)，溫度（25±1） ℃，培養(yǎng)周期21 d。

YPL-1全溫?fù)u瓶柜，T6新世紀(jì)型紫外可見分光光度計，GTR16-2型高速臺式冷凍離心機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 黃芩懸浮細(xì)胞鮮重測定 采用電子天平稱量，在超凈臺測培養(yǎng)瓶中懸浮細(xì)胞鮮重，稱完后繼續(xù)培養(yǎng)，并做好記錄。液體培養(yǎng)基的基本成分同MS固體培養(yǎng)基，只是去除瓊脂，根據(jù)試驗?zāi)康牟煌蚺囵B(yǎng)基中添加不同的待研究成分。液體懸浮培養(yǎng)培養(yǎng)基裝液量為70 mL/250 mL三角瓶， 接種量 3 g/70 mL培養(yǎng)基。培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，搖床轉(zhuǎn)速110～130 r/min。

1.2.2 黃芩懸浮細(xì)胞干重測定 在超凈臺中，每隔3 d取懸浮培養(yǎng)物，抽濾使培養(yǎng)物與培養(yǎng)液分離，收集培養(yǎng)液測定其相關(guān)成分的含量。細(xì)胞于60 ℃烘至恒重，用電子天平稱細(xì)胞干重（預(yù)先稱好濾紙的質(zhì)量），根據(jù)取樣體積與總培養(yǎng)液比例計算培養(yǎng)基中細(xì)胞干物質(zhì)的濃度與干重。

1.2.3 黃芩苷含量測定 采用紫外分光光度法測定[8]，在超凈臺中，每隔3 d取2 mL懸浮細(xì)胞，通過抽濾分離培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞。培養(yǎng)液中的黃芩苷含量：將培養(yǎng)液置于60 ℃烘箱中烘干，然后加入10 mL 50%乙醇溫浴提取、定容，可見分光光度計在278 nm處測光密度（OD）值，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖1）計算黃芩苷濃度C。培養(yǎng)細(xì)胞中的黃芩苷含量：將細(xì)胞培養(yǎng)物60 ℃烘至恒重，研成粉末，過50目篩。稱取適量干燥的細(xì)胞培養(yǎng)物，加入10 mL 50%乙醇，50 ℃溫浴5～6 h。冷卻后用50%乙醇定容。用去離子水稀釋適當(dāng)倍數(shù)，搖勻，作為待檢樣?？梢姺止夤舛扔嫓y定278 nm處OD值。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（圖1）計算黃芩苷濃度C。培養(yǎng)懸浮細(xì)胞中總黃芩苷含量=培養(yǎng)液中黃芩苷含量+細(xì)胞中的黃芩苷含量。

1.2.4 蛋白質(zhì)的提?。═CA—丙酮沉淀法[9-10]） 稱取新鮮的材料0.5 g，在液氮中研磨懸浮細(xì)胞，加入樣品體積3倍的提取液[含10%TCA和0.07%的 β-巰基乙醇的丙酮。裂解液：2.7 g尿素、0.2 g CHAPS溶于3 mL滅菌的去離子水中（終體積為5mL）]，使用前再加入1 mol/L的DTT 65 μL/mL。在-20 ℃過夜，然后4 ℃ 8 000 r/min離心1 h，棄上清。加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻后4 ℃ 8 000 r/min離心1 h，然后真空干燥沉淀，備用。上樣前加入裂解液，室溫放置30 min，使蛋白充分溶于裂解液中， 15 ℃ 8 000 r/min離心1 h，或更長時間，以沒有沉淀為標(biāo)準(zhǔn)，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：在紫外-可見分光光度計595 nm處測定吸光值[11]。用不同濃度的牛血清蛋白標(biāo)作為標(biāo)準(zhǔn)液，每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)，搖勻，放置5 min，以A595 nm吸光值為縱坐標(biāo)，牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

1.2.5 蛋白質(zhì)含量測定 將提取的蛋白質(zhì)溶液稀釋到一定的濃度，加入5.0 mL考馬斯亮藍(lán)，搖勻，放置5 min，加入比色皿中，在紫外-可見分光光度計595 nm處測定吸光值。用測得的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清清蛋白的μg數(shù)，計算出待測蛋白質(zhì)的含量[11]。

1.2.6 正交試驗 對培養(yǎng)基中6-BA、碳源、氮源、pH的配比對蛋白質(zhì)表達(dá)的影響進(jìn)行了L9（34）正交試驗（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃芩懸浮細(xì)胞的生長曲線和黃芩苷合成曲線

將新鮮的黃芩愈傷組織研磨成細(xì)胞狀，接種于液體培養(yǎng)基中，每瓶接種量約2.0 g，置于搖床中暗培養(yǎng)，從第3天起每隔3 d取樣一次，測定黃芩懸浮細(xì)胞的生長量（鮮重與干重）和黃芩苷的量。

圖3、圖4顯示，黃芩懸浮細(xì)胞的生長曲線呈典型的“S”形，0～6 d為潛伏期，6～18 d為快速合成期，18～21 d為穩(wěn)定期，黃芩懸浮細(xì)胞生長變緩。從圖5可以看出，黃芩苷在前6 d合成比較緩慢，6～18 d為黃芩苷的快速合成期，之后黃芩苷的量變化不大。

由圖3、圖4和圖5可知，黃芩懸浮細(xì)胞的生長和黃芩苷合成積累基本上同步，邊生長邊合成。在懸浮細(xì)胞生長的前6 d，懸浮細(xì)胞內(nèi)主要是適應(yīng)從固體培養(yǎng)到液體培養(yǎng)的環(huán)境，這一時期細(xì)胞的生長量和黃芩苷的合成量都不明顯；但隨著細(xì)胞適應(yīng)液體培養(yǎng)的環(huán)境后，細(xì)胞的生長量和黃芩苷的合成都迅速增加；到了后期，由于液體培養(yǎng)基成分的逐漸消耗，這一時期細(xì)胞的生長量和黃芩苷的合成量開始變得不明顯，達(dá)到一種穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.2 黃芩懸浮細(xì)胞中蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律

將新鮮的黃芩愈傷組織研磨成細(xì)胞狀，接種于液體MS培養(yǎng)基上，每瓶接種量約2.0 g，置于搖瓶柜中暗培養(yǎng)，從第3天起每隔3 d取樣一次，按上述方法測定蛋白質(zhì)含量。

圖6顯示，在黃芩懸浮細(xì)胞生長周期的前6 d，蛋白質(zhì)含量低水平表達(dá)，含量為0.154 3 mg/g；6～18 d，蛋白質(zhì)含量高水平表達(dá)，蛋白質(zhì)含量不斷積累，最大值達(dá)2.345 9 mg/g；18 d后蛋白質(zhì)含量達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。

由圖7可以看出，蛋白質(zhì)含量高低與黃芩苷的積累呈正相關(guān)，回歸方程為y=27.474 x+10.167，回歸系數(shù)R2=0.989，然后對回歸方程進(jìn)行方差分析（表2），顯著性檢測結(jié)果P=4.34×10-6<0.05，表明方程回歸顯著。

通過正交設(shè)計L9（34）優(yōu)化培養(yǎng)條件，測定不同條件下蛋白質(zhì)的含量，對結(jié)果進(jìn)行分析（表3）。從表3可以看出，因素A、B、C、D變化對蛋白質(zhì)含量影響最明顯的為碳源。圖8顯示，在不同培養(yǎng)條件下，蛋白質(zhì)含量的變化趨勢基本相同，主要合成在6～18 d期間。

3 小結(jié)與討論

植物體中的反應(yīng)絕大多數(shù)是酶促反應(yīng)，而酶絕大多數(shù)是蛋白質(zhì)。很多研究表明，植物次生代謝產(chǎn)物與酶活性有關(guān)聯(lián)。本試驗研究結(jié)果表明，在黃芩懸浮細(xì)胞中蛋白質(zhì)的含量與次生代謝產(chǎn)物黃芩苷的含量相關(guān)。在黃芩懸浮細(xì)胞生長周期前6 d，細(xì)胞處于緩解期，主要原因是，由固體培養(yǎng)到液體培養(yǎng)需要一個緩沖的過程，因此在這一時期初生代謝和次生代謝都很緩慢；而6 d后初生代謝和次生代謝產(chǎn)物迅速合成，這一點不同于組織培養(yǎng)；到18 d后達(dá)到穩(wěn)定期，原因在于培養(yǎng)液的減少抑制了產(chǎn)物的合成。

本試驗結(jié)果表明，蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律與黃芩懸浮細(xì)胞生長和黃芩苷積累量有關(guān)，在黃芩愈傷組織生長周期的前6 d，細(xì)胞處于緩解期，表現(xiàn)為細(xì)胞的生長量、黃芩苷的合成量以及蛋白質(zhì)的合成量，都比較緩慢；到6～18 d時三者都增加；到18 d后，由于培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分的逐漸消耗，表現(xiàn)為細(xì)胞生物量增長緩慢，黃芩苷的含量和蛋白質(zhì)的含量逐漸達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。通過數(shù)據(jù)分析和正交試驗驗證了以上的規(guī)律性?？梢钥闯?，在黃芩懸浮細(xì)胞的生長過程中，蛋白質(zhì)的含量與黃芩愈傷組織成長和黃芩苷積累有一定的相關(guān)性。

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