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    心樂膠囊對病毒性心肌炎小鼠MMP-1、TIMP-1蛋白水平的影響*

    2015-11-26 10:53:28徐惠梅海錦歌路瑞華
    黑龍江中醫(yī)藥 2015年2期
    關鍵詞:心肌炎膠原病毒性

    徐惠梅 崔 欣 海錦歌 路瑞華

    (黑龍江省中醫(yī)藥科學院·150036)

    病毒性心肌炎是由嗜心肌性病毒感染而發(fā)的局限性或彌漫性炎癥的心肌疾病。有研究表明其病程中的心室重構不僅與心肌細胞壞死、凋亡和免疫損傷有關,而且與心肌間質膠原纖維的改變密切相關。其中膠原降解系統(tǒng)MMPs的高表達與MMPs/TIMPs的比例失調在病毒性心肌炎心肌間質重構起著重要作用。[1]本研究旨在用中藥干預病毒性心肌炎動物模型,在細胞水平觀察心樂膠囊對MMPs/TIMPs系統(tǒng)的影響及作用機制。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 病毒 柯薩奇B3型(CVB3),Nancy株,引自哈爾濱醫(yī)科大學微生物實驗中心。

    1.1.2 實驗動物 BALB/c雄性小鼠,由哈爾濱醫(yī)科大學附屬二院實驗動物中心提供,3周齡,體重20±2克。合格證號:SCXK(黑) 2008004。

    1.1.3 主要試劑及藥品 一抗為Rabbit Anti-TIMP-1、Rabbit Anti-MMP-1北京博奧森生物技術有限公司提供。二抗為兔二步法檢測試劑盒PV-6001,北京中杉金橋生物技術有限公司提供。心樂膠囊:黑龍江省中醫(yī)研究院制劑室提供;玉丹榮心丸:上海玉丹藥物有限公司提供。

    1.2 方法

    1.2.1 動物模型制備、分組及給藥將60只小鼠隨機分為6組,每組10只。經統(tǒng)計學處理,組間體重無顯著性差異:空白對照組、模型對照組、玉丹榮心丸組、心樂膠囊低、中、高劑量組。除空白組外,后5組小鼠給予500 TCID50 CVB3稀釋液0.2ml腹腔注射,每四天注射一次,連續(xù)注射四次,建立病毒性心肌炎小鼠模型。注射結束后玉丹榮心丸組按3.51g/kg給予玉丹榮心丸混懸液0.2ml,灌胃日一次;心樂膠囊高、中、低個劑量組分別給予按2.184g/kg、1.092g/kg、0.546g/kg的混懸液0.2ml灌胃日一次;空白對照組、模型對照組給予等量生理鹽水灌胃日一次, 療程15天。

    1.2.2 指標檢測 斷頸處死小鼠,取心臟,用4%多聚甲醛液固定后石蠟包埋、切片、DAB顯色,如有需要蘇木素復染。根據北京中杉金橋生物技術有限公司試劑說明書中抗體免疫組織化學染色結果判斷標準,MMP-1、TIMP-1均為細胞漿內出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性。

    采用APSAP法測定MMP-1、TIMP-1平均陽性染色面積百分比[2]。

    1.2.3 統(tǒng)計學處理 實驗數據以SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計學分析,各組實驗數據以(x-±s)表示。總體數據用One-Way ANOVA作統(tǒng)計分析,用LSD檢驗作各組間均數兩兩比較。檢驗顯著性水平設定為P<0.05。

    2 結果

    2.1 一般情況

    除空白組外,其余各組小鼠于感染后2~3天發(fā)病,出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、飲食減少、聳毛。造模期間各組均有1只小鼠死亡。灌胃治療開始后,模型組死亡2只,玉丹榮心丸組較心樂膠囊各劑量組小鼠易激惹。其余小鼠癥狀逐漸減輕,活動較前好轉,其中治療組均較模型組癥狀輕。空白組無發(fā)病及死亡。

    2.2 各組心肌組織MMP-1蛋白水平比較

    表1 各組心肌組織MMP-1蛋白水平比較

    ▽▽P <0.05;與玉丹榮心丸組比較◆P<0.01,◆◆P <0.05;與心樂膠囊中低劑量組比較▲P<0.01。

    2.3 各組心肌組織TIMP-1蛋白水平比較

    表2 各組心肌組織TIMP-1蛋白水平比較

    3 討論

    在正常心肌細胞中,MMPs的正常表達與MMPs/TIMPs比例平衡起著非常重要的作用。MMPs 是內源性蛋白水解酶家族,是細胞外基質的破壞與降解過程中重要作用的生理調節(jié)因子。組織金屬蛋白酶抑制因子( TIMP) 是MMPs的特異性抑制物。TIMP與MMP以1:1的比例形成MMP- TIMP復合體,從而阻斷MMP與底物結合,抑制MMP的活性,降低膠原的降解。

    在整個病毒性心肌炎的病程中,心肌膠原的改變是由修復性纖維化到反應性纖維化的動態(tài)演變過程,急性期是修復性纖維化以Ⅰ型膠原增生為主,恢復期修復性纖維化與反應性纖維化并存,發(fā)展至慢性期的反應性纖維化以Ⅲ型膠原增生為主。[3]本實驗研究的MMP-1的主要功能則為降解Ⅰ、Ⅲ型膠原,其在病毒性心肌炎整個病程中持續(xù)高表達直至恢復期。TIMP-1作為其特異性抑制因子,可阻斷其與底物結合,從而抑制膠原的溶解, 延緩心室重構的發(fā)展。

    本實驗中,與空白對照組相比,模型對照組的MMP-1水平明顯升高(P<0.01),TIMP-1水平明顯下降(P<0.01)。提示MMP-1活性升高,TIMP-1活性降低,兩者平衡失調,膠原降解增加,促使心肌纖維化的發(fā)生。與模型組相比,陽性藥對照組MMP-1水平下降(P<0.05),而心樂膠囊各劑量組MMP-1水平下降明顯(P<0.01),與低劑量組相比,心樂膠囊高劑量組MMP-1水平下降更明顯(P<0.05)。與模型組相比,陽性藥對照組TIMP-1水平升高(P<0.05),而心樂膠囊各劑量組TIMP-1水平升高明顯(P<0.01),與低劑量組相比,心樂膠囊高劑量組TIMP-1水平升高更明顯(P<0.05)。以上結果提示玉丹榮心丸與心樂膠囊均能使MMP-1水平降低,促進TIMP-1水平升高,減小MMP-1/TIMP-1的比值,從而減少心肌膠原蛋白過度降解,延緩心肌纖維化進程。與低劑量組比,心樂膠囊高劑量組效果更為明顯,表明心樂膠囊的抗心肌纖維化作用可能與劑量呈正相關作用。

    [1] 韓奇杰,等. 病毒性心肌炎引起心肌纖維化機制探討[J].國際內科學雜志,2009,36:512-515.

    [2] 姜洋,金小明,屠康. 平均陽性染色面積百分比法分析免疫組化結果初探[J].生物醫(yī)學工程學雜志,2007;24(3):650-653.

    [3] 王娟,程志青.基質金屬蛋白酶及其組織抑制劑與病毒性心肌炎心肌纖維化[J].中國心血管雜志,2007;12:467-469.

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