流式細(xì)胞儀在航海醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

章海榮 韓 玲 王萬銀 劉玉龍 張 倩 家常亮

第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系 上海 200433

流式細(xì)胞儀在航海醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的設(shè)計(jì)與應(yīng)用

章海榮 韓 玲 王萬銀 劉玉龍 張 倩 家常亮

第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系 上海 200433

流式細(xì)胞儀作為一種先進(jìn)的細(xì)胞定量分析檢測儀器，廣泛應(yīng)用于航海醫(yī)學(xué)專業(yè)教育與科研研究領(lǐng)域，并起到了關(guān)鍵作用。流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)課程通過流式細(xì)胞術(shù)原理講解、儀器演示以及實(shí)驗(yàn)操作環(huán)節(jié)，幫助學(xué)員漸進(jìn)學(xué)習(xí)和掌握相應(yīng)內(nèi)容。根據(jù)航海醫(yī)學(xué)專業(yè)的教學(xué)需求，開設(shè)流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)課程，按照流式細(xì)胞儀的構(gòu)造及原理講解、細(xì)胞樣本制備、細(xì)胞DNA含量和凋亡檢測、操作演示等四方面進(jìn)行教學(xué)。通過流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)課程教學(xué)的實(shí)施，學(xué)員整體加深了對(duì)流式細(xì)胞儀基礎(chǔ)知識(shí)的理解和掌握，提升了動(dòng)手操作能力、科研分析及解決問題的能力，為學(xué)員在日后的科研實(shí)驗(yàn)中利用該項(xiàng)技術(shù)奠定了良好的基礎(chǔ)。

流式細(xì)胞儀；實(shí)驗(yàn)教學(xué)

流式細(xì)胞儀（flow cytofluorometers）是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)以及細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)、單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科儀器，用以實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞特征及細(xì)胞或細(xì)胞器的組成進(jìn)行定性和定量分析。隨著流式細(xì)胞術(shù)的不斷發(fā)展，現(xiàn)已成為當(dāng)前科技領(lǐng)域發(fā)展十分迅速的生物學(xué)技術(shù)之一，它不僅滲透到航海醫(yī)學(xué)各基礎(chǔ)學(xué)科，還廣泛應(yīng)用于臨床治療的各個(gè)領(lǐng)域。

流式細(xì)胞儀在航海醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究中，主要用來測量細(xì)胞蛋白質(zhì)含量測定、DNA和RNA含量分析、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞增殖的分析、免疫細(xì)胞功能分析、細(xì)胞內(nèi)活性氧檢測、線粒體膜電位分析、細(xì)胞生長因子CBA分析、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、血小板GP分析和定量流式細(xì)胞術(shù)等。

第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心（以下簡稱“中心”）大型精密儀器室是大型儀器操作服務(wù)和實(shí)驗(yàn)教學(xué)平臺(tái)，流式細(xì)胞儀承擔(dān)了全校本科及研究生的實(shí)驗(yàn)教學(xué)任務(wù)。我室流式細(xì)胞儀型號(hào)為BD FACSCalibur，在實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，我們率先引入了流式細(xì)胞術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生物學(xué)，F(xiàn)CM理論知識(shí)與學(xué)生動(dòng)手操作能力培養(yǎng)的有效融合，不斷拓展學(xué)員科研創(chuàng)新等能力培養(yǎng)素質(zhì)的培養(yǎng)。

1 流式細(xì)胞術(shù)原理

流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）是一種在功能上對(duì)單細(xì)胞或其他生物粒子進(jìn)行定量分析和分選的檢測手段。FCM的結(jié)構(gòu)分為三大部分，流動(dòng)式及液流驅(qū)動(dòng)系統(tǒng)（聚焦細(xì)胞以供檢測）、激光光源及光速形成系統(tǒng)（激發(fā)和收集光信號(hào)）、信號(hào)檢測、存貯、光電轉(zhuǎn)換、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，并使其數(shù)字化以供計(jì)算機(jī)分析）。其信息主要來自特異性熒光信號(hào)及非熒光散射信號(hào)。散射光信號(hào)包括前向角散射光（Forward Scatter，F(xiàn)SC）及側(cè)向角散射光（SideScatter，SSC）。在進(jìn)行熒光密度分析時(shí)，對(duì)每個(gè)細(xì)胞都進(jìn)行集中不同波長條件下的測定。熒光抗體最常用于顯示細(xì)胞表面特異受體的密度，從而對(duì)分化不同的細(xì)胞類型的亞群進(jìn)行辨別，其中也包括對(duì)表達(dá)導(dǎo)入基因的細(xì)胞核表達(dá)特殊標(biāo)志物細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別。

2 實(shí)驗(yàn)教學(xué)設(shè)計(jì)實(shí)施

中心的流式型號(hào)為BD FACSCalibur，是第一臺(tái)全自動(dòng)多色流式系統(tǒng)兼具分析和分選雙向功能的臺(tái)式機(jī)，其多參數(shù)系統(tǒng)能提供航海醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)科研實(shí)驗(yàn)所必需的客觀、可重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。實(shí)驗(yàn)教學(xué)中我們根據(jù)儀器使用情況及選修學(xué)員的人數(shù)，合理安排時(shí)間，采取儀器現(xiàn)場觀摩、學(xué)生分組輪換的形式對(duì)儀器進(jìn)行講解教學(xué)。

先講授流式細(xì)胞術(shù)的基礎(chǔ)原理，并進(jìn)行儀器構(gòu)造的講解和展示，使學(xué)員對(duì)流式細(xì)胞儀有初步的了解。進(jìn)一步對(duì)液流系統(tǒng)、光學(xué)系統(tǒng)、電子控制系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、細(xì)胞分選系統(tǒng)5部分系統(tǒng)及各部分工作原理進(jìn)行介紹，同時(shí)闡述待測標(biāo)本經(jīng)過儀器的上述系統(tǒng)的情況，將流式細(xì)胞儀原理拓展并貫穿至各個(gè)系統(tǒng)中，使學(xué)員對(duì)流式細(xì)胞儀有整體清晰的把握，從而達(dá)到教學(xué)目的。

3 樣本制備及儀器操作演示

操作環(huán)節(jié)的教學(xué)順序?yàn)槲募?、?biāo)本制備、參數(shù)設(shè)定、樣本采集、結(jié)果分析、數(shù)據(jù)導(dǎo)出。主要分三方面內(nèi)容。

（1）逐一開啟穩(wěn)壓電源、計(jì)算機(jī)、激光光源進(jìn)入開機(jī)程序，強(qiáng)調(diào)開、關(guān)機(jī)過程及儀器日常維護(hù)的注意事項(xiàng)。

（2）運(yùn)行Cell Quest軟件，講解軟件的組成部分、流式檢測常用術(shù)語介紹、熒光補(bǔ)償原理及調(diào)節(jié)應(yīng)用、檢測結(jié)果圖的表示形式。

（3）以單色和雙色實(shí)驗(yàn)為例，利用BD公司培訓(xùn)用的熒光微球，現(xiàn)場演示DNA含量分析（PI單色）、細(xì)胞凋亡分析（Annexin V-FITC/PI雙色）等分析檢測方法。

通過上述教學(xué)演示，學(xué)員對(duì)流式細(xì)胞術(shù)的操作有了一定的了解，并加深了對(duì)儀器原理及構(gòu)造的認(rèn)識(shí)，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)教學(xué)環(huán)節(jié)奠定基礎(chǔ)。

4 實(shí)例操作分析

實(shí)驗(yàn)一：人體乳腺癌細(xì)胞DNA含量分析

（1）收集細(xì)胞：用不含EDTA的0.25%的胰酶消化離心。

（2）細(xì)胞固定：加入預(yù)冷的70%乙醇（PBS配制），于4 ℃固定或-20 ℃長期固定。

（3）酶解RNA：以1 mL預(yù)冷的PBS洗細(xì)胞一次，加入預(yù)冷的PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×106，取出100 uL細(xì)胞懸液，加入RNase A酶，使RNase A終濃度為1 mg/mL，混勻后37 ℃水浴30 min。

（4）熒光染色：加入PI綜合染色液，使PI終濃度為50 ug/mL，混勻，4 ℃冰箱避光保存。

（5）上機(jī)檢測：300目尼龍網(wǎng)過濾后，上機(jī)檢測。

實(shí)驗(yàn)二：小鼠成纖維細(xì)胞凋亡分析

（1）收集細(xì)胞：用不含EDTA的胰酶消化收集（注：胰酶消化時(shí)間不宜過長，以避免容易引起假陽性）。

（2）洗滌細(xì)胞：用PBS洗滌細(xì)胞二次（2000 rpm離心5 min）收集1～5×105細(xì)胞。

（3）懸浮細(xì)胞：加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；（可根據(jù)細(xì)胞多少適當(dāng)調(diào)整buffer的量，最少可以減少到100 uL）。

（4）熒光染色：加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide，混勻。

（5）上機(jī)檢測：室溫、避光、反應(yīng)5 min～15 min；在1 h內(nèi)，進(jìn)行下述熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀的觀察和檢測。

5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

實(shí)驗(yàn)一：人體乳腺癌細(xì)胞DNA含量分析

在生物細(xì)胞中，DNA含量是恒定的參量，DNA含量隨著細(xì)胞增殖周期各時(shí)期不同而發(fā)生變化。DNA含量檢測是流式細(xì)胞儀應(yīng)用最早且目前仍然廣泛應(yīng)用的指標(biāo)之一。惡性腫瘤細(xì)胞一般多出現(xiàn)異倍體，研究表明DNA含量分析對(duì)細(xì)胞毒性藥物的研究很有價(jià)值。DNA含量分析可以提供細(xì)胞周期信息，通過熒光染料碘化丙啶（Propidium ，簡稱PI）是一種雙鏈DNA的熒光染料，PI與DNA分子可特異性結(jié)合，且具有一定正比量效關(guān)系比。在細(xì)胞DNA直方圖上，原則上其異倍體G0/1期細(xì)胞DI值（DNA index）之差0.2以上時(shí)，或DI值之差雖然不大于0.2，但出現(xiàn)兩個(gè)明顯的細(xì)胞峰，均視為不同克隆細(xì)胞。一般DI值之差＜0.2時(shí)，視為同一克隆細(xì)胞。如檢測結(jié)果表明是DNA異質(zhì)性腫瘤，這表明它是多克隆起源的，則腫瘤惡性程度更高（如圖1所示）。

圖1 乳腺癌細(xì)胞周期檢測的正常組和增值組變化

實(shí)驗(yàn)二：小鼠成纖維細(xì)胞凋亡分析

細(xì)胞凋亡（apoptosis，Apo），又稱細(xì)胞程序性死亡（Programmed cell death，PCD），是指細(xì)胞在一定的勝利或病理?xiàng)l件下，遵循自身的程序，自己結(jié)束其生命的過程。它是一個(gè)主動(dòng)的、高度有序的、基因控制的、一系列酶參與的過程。在形態(tài)學(xué)上，細(xì)胞凋亡改變了他們的光散特性。在正常細(xì)胞中，磷脂酰絲氨酸（PS）只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè)，而在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜中的磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內(nèi)側(cè)翻向外側(cè)。Annexin V是一種分子量為35～36 kD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié)合。因此Annexin V被作為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。將Annexin V進(jìn)行熒光素（EGFP、FITC）標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin V作為熒光探針，利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶（Propidium Iodide， PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但對(duì)凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此將Annexin V與PI匹配使用，就可以將處于不同凋亡時(shí)期的細(xì)胞區(qū)分開。圖2為該小鼠成纖維細(xì)胞凋亡檢測的正常組和增值組變化情況。

圖2 小鼠成纖維細(xì)胞凋亡分析

6 結(jié)束語

該實(shí)驗(yàn)教學(xué)實(shí)現(xiàn)了教學(xué)和科研的有機(jī)結(jié)合，通過FCM相關(guān)內(nèi)容的理解和掌握，學(xué)員的海航醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)操作技能有了一定的提高。在細(xì)胞標(biāo)本的制備到上機(jī)檢測、結(jié)果分析等一系列步驟中，不僅學(xué)生動(dòng)手操作能力、科研分析及解決問題的能力得到了培養(yǎng)和鍛煉，學(xué)生的積極性也得到充分的調(diào)動(dòng)。通過師生之間的互動(dòng)，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)教學(xué)方案，提高了教學(xué)質(zhì)量，取得了較好的教學(xué)成果。在提高流式細(xì)胞儀利用率的同時(shí)，也最大限度地發(fā)揮了現(xiàn)有儀器設(shè)平臺(tái)的資源優(yōu)勢和師資特長，使學(xué)員接受了最好的專業(yè)訓(xùn)練。目前選修流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)課程的本科生和研究生人數(shù)逐年增長，我們將進(jìn)一步優(yōu)化我們的平臺(tái)，使得越來越多的學(xué)員得到更好的學(xué)習(xí)和鍛煉。

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Design and Implementation of Flow Cytometry Experiments Teaching in Pharmacy

Zhang Hairong， Han Ling， Wang Wanyin， Liu Yulong， Zhang Qian， Jia Changliang
Second Military Medical University， Shanghai， 200433， China

Flow cytometry as a quantitative analysis of the most advanced cell testing equipment， is widely used in pharmacy professional education and scientifc research in the feld， and played a key role. Flow cytometry experiments to explain the principles of fow cytometry course， equipment demonstrations and experiments operating areas， to help students learn and master progressive. According to the characteristics of the teaching hospital pharmacy professional learning， the creation of fow cytometry experiments curriculum， and designed a flow cytometer operation demonstration， explain the structure of the instrument， sample preparation， cell DNA content and apoptosis detection four teaching content. In the process of implementing the teaching of flow cytometry experiments， we found that participants overall deepened the understanding of the basics of flow cytometry and master， to enhance the hands-on ability， scientific analysis and problem-solving skills for students in future research real experimental use of the technology has laid a good foundation.

fow cytometry； experimental teaching

2014-06-09

章海榮，本科，實(shí)驗(yàn)師。通訊作者：韓玲，教授，主任。