分光光度法測(cè)定蝦青素

張泳,厲妙沙,吳嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

分光光度法測(cè)定蝦青素

張泳,厲妙沙,吳嘉圣

(上虞新和成生物化工有限公司,浙江上虞312369)

建立一種快速測(cè)定化學(xué)合成蝦青素含量的分光光度分析方法。采用經(jīng)氫醌處理的三氯甲烷做為提取溶液,在489 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度,該分光光度法的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)是0.9999,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.36%,加標(biāo)回收率為99.8%～102.5%,表明該分析方法準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好,且簡(jiǎn)便、快速,可以作為企業(yè)大批量生產(chǎn)中蝦青素的測(cè)定方法。

蝦青素;分光光度法;化學(xué)合成

0 概述

蝦青素是一種廣泛存在于生物體的非維生素A源類胡蘿卜素。在水生動(dòng)物蝦、蟹、魚(yú)和鳥(niǎo)類的羽毛中發(fā)揮調(diào)節(jié)色素沉積并顯色的作用。蝦青素被廣泛應(yīng)用于魚(yú)蝦等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的飼料添加劑,以補(bǔ)充人體內(nèi)蝦青素的缺乏。蝦青素是類胡蘿卜素合成的最高級(jí)別產(chǎn)物,具有明顯的抗氧化、消除活性單線態(tài)氧的作用。因此在食品、化妝品、保健品領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景[1]。

從動(dòng)植物及菌類中提取的蝦青素,由于其蝦青素含量較低及檢測(cè)限值低的原因,基本采用液相色譜分析法。而目前市場(chǎng)上魚(yú)飼料中的蝦青素90%是化學(xué)合成得到,國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)有系統(tǒng)的對(duì)化工合成的蝦青素含量檢測(cè)的研究報(bào)道。本文研究參考國(guó)外對(duì)蝦青素理化性質(zhì)的報(bào)道,采用紫外分光光度法對(duì)化學(xué)合成蝦青素的含量進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果滿意可行。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

蝦青素是由四個(gè)異戊二烯單位以共扼雙鍵形式鏈接,兩端又有兩個(gè)異戊二烯單位組成六節(jié)環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物,蝦青素分子結(jié)構(gòu)中的這種共扼雙鍵體系及離域化的π電子,在可見(jiàn)光區(qū)表現(xiàn)出強(qiáng)吸收帶,且每種類胡蘿卜素分子的最大吸收峰位置與紫外可見(jiàn)光光譜的精細(xì)結(jié)構(gòu)都是具有特征性的。由于類胡蘿卜素分子的這種光吸收性質(zhì),溶液中的類胡蘿卜素一般服從beer-lambert定律,所以通過(guò)分光光度法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)蝦青素精確的定量分析[2]。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)儀器

UV8500雙光束紫外分光光度計(jì)(無(wú)錫科達(dá)儀器廠)

電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)

超聲波清洗器(杭州科博儀器有限公司)

恒溫水浴裝置(金壇市科析儀器有限公司)

離心機(jī)

氮?dú)獯蹈?/p>

石英比色皿

1.2.2 試劑

(1)BHT(2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,分析純)

(2)三氯甲烷(分析純,浙江杭州雙林化工試劑廠)

(3)二氯甲烷(分析純)

(4)碳酸氫鈉(工業(yè)級(jí))

(5)氫醌(工業(yè)級(jí))

(6)硫代硫酸鈉(分析純)

(7)三氯甲烷處理方法:

分別稱取0.1 g碳酸氫鈉、硫代硫酸鈉、氫醌和BHT置于500mL的棕色容量瓶,加入三氯甲烷至刻度,搖勻超聲30 min后過(guò)濾待用。

(8)試驗(yàn)溶液:

準(zhǔn)確稱取蝦青素樣品40mg(準(zhǔn)確至0.0002 g),置于250mL的棕色容量瓶,加入10mg BHT,加入50mL二氯甲烷溶解,在熱水浴中超聲5min,流水冷卻至室溫;再加入100 mL三氯甲烷繼續(xù)超聲5min溶解,冷卻至室溫,然后用三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻,即為待測(cè)溶液。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 工作曲線的繪制

精密稱取待測(cè)蝦青素溶液適量,用三氯甲烷溶劑溶解,配置成濃度為1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、5.0μg/mL、6.0μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液,用UV8500紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同波長(zhǎng)下的吸光度。在最大波長(zhǎng)下,以三氯甲烷試劑空白調(diào)零,測(cè)定吸光度。以蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo),對(duì)應(yīng)吸光度值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸、繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線,見(jiàn)圖1。得到回歸方程式:y=0.1686x+0.075(R2=0.9999)

圖1 分光光度法的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟

準(zhǔn)確移取待測(cè)溶液A 1.0 mL于50 mL棕色容量瓶中,用處理過(guò)的三氯甲烷(三氯甲烷加0.02%氫醌振搖后過(guò)濾)稀釋至刻度,搖勻,得溶液B。準(zhǔn)確移取試驗(yàn)溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用處理后的三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻。

用紫外—可見(jiàn)光分光光度計(jì)測(cè)定溶液B在波長(zhǎng)489 nm處的吸光度(1 cm石英比色皿)。以處理后的三氯甲烷為空白對(duì)照。

計(jì)算:

式中:

X——樣品中蝦青素百分含量;

A489——樣品溶液在489nm處測(cè)得的吸光度;

M——稱取樣品的質(zhì)量,g;

12500——樣品的稀釋倍數(shù);

1975——蝦青素的百分吸收系數(shù)(E1cm1%)。

誤差要求:平衡測(cè)定二次,相對(duì)偏差不超過(guò)1.0%,結(jié)果以算術(shù)平均值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1波長(zhǎng)的選擇

稱取待測(cè)蝦青素試驗(yàn)溶液適量,用三氯甲烷溶劑稀釋成濃度為1μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,在350～600 nm波長(zhǎng)范圍使用UV8500雙光束紫外分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描,得到吸收光譜圖見(jiàn)圖2。由圖2可知,蝦青素在489 nm處有最大吸收。由此分光光度法檢測(cè)波長(zhǎng)選擇489 nm。

圖2 蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸收光譜圖(三氯甲烷)

2.2 精密度試驗(yàn)

精密稱取待測(cè)蝦青素試驗(yàn)溶液1.0mL于50mL棕色容量瓶中,用經(jīng)處理的三氯甲烷稀釋至刻度,搖勻。取待測(cè)溶液放入1 cm光徑比色皿中,用UV8500紫外分光光度計(jì)測(cè)定蝦青素溶液在489 nm波長(zhǎng)處的吸光度值,連續(xù)測(cè)定6次,計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.36%。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。取待測(cè)蝦青素溶液各兩份,一份暴露在自然條件下,另一份充氮密封并避光保存在-18℃的冰箱中。暴露于自然條件下的樣品每隔1 h測(cè)一次,而冰箱保存的樣品每隔1 d測(cè)一次。分別按照分光光度法檢測(cè)吸光度。

試驗(yàn)結(jié)果表明,蝦青素樣品在自然條件下,2 h后樣品含量開(kāi)始有明顯的減少,而在冰箱保存條件下3 d后開(kāi)始出現(xiàn)減少現(xiàn)象。

這是由于蝦青素分子中的多烯鏈導(dǎo)致其具有極大的不穩(wěn)定性,對(duì)光敏感,在光照下易被破壞,很容易被空氣中的氧或過(guò)氧化物氧化,易受溫度、氧化及光照影響而發(fā)生降解。如蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液在自然狀態(tài)下2 h內(nèi)濃度明顯下降。所以對(duì)蝦青素檢測(cè)分析樣品的最佳保存時(shí)間是3 d,并且應(yīng)避光低溫保存,試驗(yàn)操作需要盡快完成且盡可能避光操作,操作過(guò)程應(yīng)盡量減少氧氣接觸機(jī)會(huì),控制操作溫度,采用40℃下抽真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮或氮?dú)獯蹈?不能空氣吹干。樣品的超聲浴溫度不要超過(guò)35℃,同時(shí)添加2,6-二叔丁基對(duì)甲酚(BHT)作為穩(wěn)定劑。

2.4 回收率試驗(yàn)

按待測(cè)蝦青素溶液濃度的75%、100%和125%制備蝦青素溶液,各3份,分別測(cè)定吸光度。分別加入濃度為100μg/mL蝦青素標(biāo)準(zhǔn)溶液1mL、2 mL、3mL用紫外分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值,計(jì)算蝦青素平均回收率,測(cè)得回收率是99.8%～102.5%,結(jié)果見(jiàn)表2。

2.5 測(cè)定

表3分別是分光光度法和液相色譜法得到的最終蝦青素的百分含量,可以看出,分光光度法和液相色譜法檢測(cè)得到的含量值基本無(wú)差異。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果

表3 不同方法得到的蝦青素含量

3 結(jié)論

本文研究利用蝦青素不溶于水,易溶于有機(jī)溶劑的特點(diǎn),將蝦青素標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)加有0.02%氫醌處理的三氯甲烷提取、稀釋12500倍后,在489 nm波長(zhǎng)下利用分光光度法對(duì)蝦青素含量進(jìn)行測(cè)定,其標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程的r2超過(guò)了0.99,線性良好,能用于定量分析測(cè)定。分光光度法測(cè)定蝦青素化學(xué)合成品,回收率99.8%～102.5%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值0.36%;其線性關(guān)系好,靈敏度較好,且操作簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì),特別適用企業(yè)大批量生產(chǎn)蝦青素情況下進(jìn)行測(cè)定。

[1]Miki W.Biological functions and activities of animal carotenoids[J].Pure&Appl Chem,1991,63:141-146.

[2]惠伯隸.類胡蘿卜素化學(xué)及生物化學(xué)[M].北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005.

[3]Sedmark J J,Weeradinghe D K,Jolly SO.Extraction and quantitation of astaxanthin from phaffia rhodzyma[J]. Biotechnol tech,1990,4(2):107-112.

[4]Pilar Calo,Jorge B Velazquez,Carmen Sieiro,et al.Analysis of astaxanthin and other carotenoids from several phaffia rhodzymamutants[J].JAgric Food Chem,1995,43:1396-1399.

Analysis of Astaxathin by Spectrophotometry

ZHANG Yong，LIMiao-sha，WU Jia-sheng
(Shangyu NHU Biochemical Co.,Ltd.,Shangyu,Zhejiang 312369,China)

Establish a rapid determination of an analytical assay of astaxathin were desgned from chemical synthesis by spectrophotometry.Using chloroform as extraction solution treated by hydroquinone,under 489nm wavelength determination of absorption.The spectrophotometric method of standard curve regression coefficient is 0.9999.the relative standard deviation is 0.36%,the standard addition recovery is 99.8%～102.5%,show that the analysismethod of high accuracy,good repeatability,and is simple,rapid,and can be used as an enterprise with the determ ination of astaxanthin in mass production.

spectrophotometry;astaxathin;chemical synthesis

1006-4184(2015)9-0051-04

2015-07-15

張泳(1981-),男,浙江紹興人,在讀碩士研究生,主要研究方向:化工分析技術(shù)。

*通訊作者:吳嘉圣(1984-),男,工程師,浙江紹興人,從事精細(xì)有機(jī)合成研究及相關(guān)技術(shù)管理工作。E-mail:shengjiawu@163.com。