匙羹藤總皂苷抗氧化活性研究

吳華慧 李 姝 潘柳谷 黃燕軍

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

匙羹藤總皂苷抗氧化活性研究

吳華慧 李 姝 潘柳谷 黃燕軍

（廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，廣西 南寧 530021）

目的：研究匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、和脂質(zhì)過氧化物（LPO）作用的影響。方法：通過硫代巴比妥酸（TBA）分光光度法測(cè)定大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化(LPO)的二級(jí)分解產(chǎn)物丙二醛(MDA)的含量，以考察匙羹藤總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟LPO的作用影響，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，鉬酸銨顯色法測(cè)定CAT的活力，考察匙羹藤總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟SOD和CAT的作用大小。結(jié)果：與對(duì)照組比較匙羹藤總皂苷在1.0mg/ml～6.0mg/ml濃度范圍可抑制大鼠肝臟LPO作用；在1.0mg/ml～6.5mg/ml濃度范圍內(nèi)可提高大鼠肝臟SOD和CAT的活性。結(jié)論：匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟SOD和CAT的活性，降低MDA的產(chǎn)生。

超氧化物歧化酶（SOD）；過氧化氫酶（CAT）；脂質(zhì)過氧化物（LPO）；匙羹藤

抗衰老生物學(xué)和自由基生物學(xué)是近年來生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，研究和開發(fā)新型抗氧化功能食品和天然抗氧化劑能滿足人們對(duì)健康長壽日益增長的要求，根據(jù)衰老的自由基理論，研究抗衰老植物的報(bào)告頗多，其研究途徑大致有三大類：一是，研究抗衰老植物有無直接清除自由基的作用；二是，研究抗衰老植物能否提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性，以達(dá)到間接清除自由基的目的；三是，研究抗衰老植物是否具有抑制脂質(zhì)過氧化物及代謝廢物的作用。本實(shí)驗(yàn)研究的匙羹藤總皂苷，在國內(nèi)外的報(bào)道大多是對(duì)小鼠細(xì)胞的某些免疫學(xué)效應(yīng)、藥理作用及臨床應(yīng)用上的研究[1-3]，而對(duì)其抗氧化活性的生物化學(xué)研究方法少見報(bào)道。本研究匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟線粒體LPO作用的影響，以及對(duì)大鼠肝臟線粒體SOD、CAT 活性的影響。筆者采用大鼠肝臟組織勻漿進(jìn)行實(shí)驗(yàn)測(cè)定的方法，了解匙羹藤總皂苷對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠肝臟SOD、CAT、LPO作用的影響。

1 材料與方法

1.1試劑和主要儀器

FJ-200高速分散勻質(zhì)機(jī)（上海標(biāo)本模型廠）；3k15臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（SIGM公司）；數(shù)顯式三用電熱恒溫水溫箱；電子天平；722型分光光度計(jì)；超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、過氧化氫酶（CAT）測(cè)試盒、蛋白定量測(cè)試盒(上述測(cè)試盒均為南京建成生物工程研究所制)、硫代巴比妥酸；冰醋酸；L—半胱氨酸；2-硫代巴比妥酸（TBA）；1,1,3,3-四乙氧基丙烷（TEP）；SD大鼠,體重180-220g（雌性各半），由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCSK桂2014-0003)；試驗(yàn)用水為自制雙蒸水。

1.2方法

1.2.1肝勻漿的制備

①勻漿介質(zhì)的制備：將 Tris1.21g及 EDTA-2Na37.23mg加雙蒸水500ml,再用200mmol/LHCL進(jìn)行滴定至pH7.4,然后加入3.42g蔗糖，8gNaCL,用雙蒸水稀釋到1000 ml，放入鹽水瓶中，以9磅壓力進(jìn)行消毒30min，4℃冰箱中備用。

②取SD(體重180g～220g)大鼠，禁食一天，頸椎脫臼處死，取肝臟，立即用冰冷的生理鹽水漂洗，除去血液，濾紙吸干，稱重，剪刀剪碎，用預(yù)冷的勻漿介質(zhì)稀釋成 20%肝勻漿，高速分散勻質(zhì)機(jī)勻漿，之后置高速冷凝離心機(jī)中3000r/min離心15min，取上清液，用含糖PBS稀釋配制成10%肝勻漿。用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定其蛋白含量[4]。

1.2.2匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟LPO的影響

在1.0mL的4g/L肝反應(yīng)液中依次加入0.05mL硫酸亞鐵、0.02mL L-半胱氨酸、不同濃度的匙羹藤總皂苷樣品，混勻，37℃水浴 15min,再加入 2.0mL醋酸終止反應(yīng)，最后加入2.0mLTBA，混勻，沸水中加熱15min，流水冷卻，在532nm處測(cè)吸光度值。

1.2.3匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟SOD的影響

采用試劑盒黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力。

表1　SOD活力測(cè)定操作表

混勻，室溫靜置10min，1cm光徑，雙蒸水調(diào)零，550nm處測(cè)吸光度值。

組織勻漿中SOD活力計(jì)算公式：

SOD活力（U/mgprot）=（對(duì)照OD值-測(cè)定OD值）∕對(duì)照 OD值÷50%×稀釋倍數(shù)÷待測(cè)樣本蛋白濃度(mgprot/ml)

1.2.4匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟CAT的影響

采用試劑盒鉬酸銨顯色法測(cè)定CAT的活力。

表2　CAT活力測(cè)定操作表

混勻，0.5cm光徑，405nm處，雙蒸水調(diào)零，測(cè)吸光度值。

組織勻漿中CAT活力計(jì)算公式：

CAT活力（U/mgprot）=（對(duì)照OD值-測(cè)定OD值）×271 ×（1/60×取樣量）÷待測(cè)樣本蛋白濃度(mgprot/ml)

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS13.0進(jìn)行分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間分析采用One-Way ANOVA和SNK-q兩兩比較得到相應(yīng)P值。以P<0.05或P<0.01差異顯著，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1不同劑量匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟LPO影響

結(jié)果由表3可見，除雌性大鼠樣品組7和雄性大鼠樣品組5與對(duì)照組比較無顯著性差異外，其余各組肝臟LPO值均低于對(duì)照組(P<0.05)。說明匙羹藤總皂苷在 1.0mg/ml～6.0mg/ml濃度范圍可以抑制大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化。

表3　總皂苷對(duì)大鼠肝臟LPO的影響（n=4，±s）

表3　總皂苷對(duì)大鼠肝臟LPO的影響（n=4，±s）

注：樣品組與對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)，除*組的P>0.05外，其余各組P＜0.05。

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對(duì)照組　0 .00 　2.230±0.01　2.905±0.01 LPO含量(umol/g.蛋白) 　抑制率(%)樣品組1 　1.00 　1.945±0.02　2.519±0.02 　12.78 　13.29 2 　2.00 　1.955±0.03　2.596±0.01 　12.33 　10.64 3 　3.00 　1.900±0.01　2.110±0.03 　14.80 　27.37 4 　4.00 　1.756±0.03　2.098±0.04 　21.26 　27.78 5 　4.50 　1.652±0.06　2.084±0.08 　25.92 　28.26*6 　5.50 　1.632±0.05　1.986±0.00 　26.82 　31.64 7 　6.00 　1.643±0.02　1.985±0.02 　26.32*　31.67

2.2不同劑量匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟SOD的影響

結(jié)果見表4，匙羹藤總皂苷加入量在1.00～6.50mg之間，與對(duì)照組比較SOD活性明顯提高，說明匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟線粒體SOD的活性。

表4　總皂苷對(duì)大鼠肝臟SOD活性的影響（n=4，±s）

表4　總皂苷對(duì)大鼠肝臟SOD活性的影響（n=4，±s）

注：與對(duì)照組比較經(jīng)t經(jīng)驗(yàn)，樣品組各點(diǎn)p<0.05

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對(duì)照組　0 　2.43±0.01 　3.57±0.01 SOD活力（U/mgprot） 　提高率(%)樣品組1 　1.00 　2.89±0.03 　3.83±0.01 　18.93 　7.28 2 　2.00 　2.88±0.07 　3.81±0.13 　18.52 　6.72 3 　3.00 　2.91±0.06 　3.96±0.21 　19.75 　10.92 4 　4.00 　2.91±0.02 　4.05±0.26 　19.75 　13.45 5 　5.00 　3.15±0.20 　4.29±0.20 　29.63 　20.17 6 　5.50 　3.22±0.08 　4.89±0.11 　32.51 　36.97 7 　6.00 　3.46±0.01 　4.98±0.01 　42.39 　39.50 8 　6.50 　3.43±0.07 　5.08±0.02 　41.15 　42.30

2.3不同劑量匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟CAT的影響

結(jié)果見表5，匙羹藤總皂苷加入量在之間，與對(duì)照組比較CAT活性明顯提高，說明匙羹藤總皂苷可以提高大鼠肝臟線粒體CAT的活性。

表5　總皂苷對(duì)大鼠肝臟CAT活性的影響（n=4，±s）

表5　總皂苷對(duì)大鼠肝臟CAT活性的影響（n=4，±s）

注：與對(duì)照組比較經(jīng)t經(jīng)驗(yàn)，樣品組各點(diǎn)p<0.05

組別 　總皂苷(mg) 　雌 　雄 　雌 　雄對(duì)照組　0 　10.21±0.01　10.59±0.01 CAT活力（U/mgprot） 　提高率(%)樣品組1 　1.00 　10.82±0.03　11.02±0.01 　5.97 　4.06 2 　2.00 　11.06±0.07　11.89±0.13 　8.33 　12.27 3 　3.00 　12.19±0.06　12.02±0.21 　19.39 　13.50 4 　4.00 　12.35±0.02　12.56±0.26 　20.96 　18.60 5 　4.50 　13.25±0.20　12.94±0.20 　29.77 　22.19 6 　5.50 　13.78±0.08　13.59±0.11 　34.97 　28.33 7 　6.00 　14.20±0.01　13.97±0.01 　39.08 　31.92 8 　6.50 　14.58±0.07　14.28±0.02 　42.80 　34.84

2.4討論

研究大鼠肝臟LPO、SOD、CAT已經(jīng)有一套較成熟的實(shí)驗(yàn)方法，通過加入匙羹藤總皂苷對(duì)大鼠肝臟線粒體作用模型的影響，用細(xì)胞勻漿硫代巴比妥酸(Thiobarituric acid, TBA)比色，測(cè)定大鼠肝臟線粒體LPO的含量，說明匙羹藤總皂苷在1.00～6.00mg范圍內(nèi)具有抑制LPO及其代謝廢物的作用；采用試劑盒黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活力，測(cè)定體系中加入匙羹藤總皂苷（1.00～6.50mg/ml），可提高大鼠肝臟線粒體SOD的活性，采用試劑盒鉬酸銨顯色法測(cè)定CAT的活力，測(cè)定體系中加入匙羹藤總皂苷（1.00～6.50mg/ml），提高了大鼠肝臟線粒體CAT的活性，說明匙羹藤總皂苷能提高機(jī)體內(nèi)抗氧化酶的活性，以達(dá)到間接清除自由基之目的。通過匙羹藤對(duì)大鼠肝臟細(xì)胞抗氧化能力指標(biāo)LPO、SOD、CAT的影響的研究，預(yù)測(cè)其對(duì)人體抗氧化作用的功效,為其做為功能性食品添加劑的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)及開發(fā)前景。

[1] 李茜.廣西幾種特色壯藥的藥理毒性及活性成分的研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥學(xué)刊,2005,23(12):2232-2233.

[2] 甄漢深,梁潔,周芳.廣西匙羹藤莖 95%乙醇提取物降血糖作用及其機(jī)制的初步研究[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志,2007, 13(1):32-34.

[3] 扈玉華,路建榮,朱習(xí)會(huì).匙羹藤提取物體外抑菌活性的觀察[J].中國中醫(yī)藥信息雜志,2008,15(10):40-41.

[4] 吳耀生.新編生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002:120-145.

Study on antioxidant activity of total saponins of gymnema sylvestre

Objective: the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on rat liver superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and lipid peroxide (LPO) effect. Methods: by thiobarbituric acid (TBA) spectrophotometric method determination of rat liver lipid peroxidation (LPO) secondary decomposition product malondialdehyde (MDA) content, in order to examine the effect of total saponins of Gymnema sylvestre on experimental rat liver LPO effect by xanthine oxidase method determination of the activity of superoxide dismutase (SOD), ammonium molybdate significantly colorimetric determination of CAT activity. The effect of the size of the total saponins of Gymnema sylvestre the role of experimental rat liver SOD and cat. Results: with the control group comparison of total saponins of Gymnema sylvestre in 1.0mg/ml-6.0mg/ml concentration range can inhibit rat liver lipid peroxidation; can improve the activity of SOD and cat in rat liver in 1.0mg/ml-6..5mg/ml concentration within the scope of. Conclusion: the total saponins of Gymnema sylvestre can improve SOD and CAT activity in rat liver, reduce the production of MDA.

Superoxide dismutase (SOD); catalase (CAT); lipid peroxide (LPO); gymnemasylvestre

R93

A

1008-1151(2015)11-0057-02

2015-10-11

廣西自然科學(xué)基金項(xiàng)目“廣西特色中草藥匙羹藤總皂苷提取工藝及生物活性研究”（2012GXNSFAA239001）。

吳華慧（1973－），女，廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院講師，碩士，從事天然產(chǎn)物活性研究及醫(yī)藥化學(xué)教學(xué)工作。

李姝（1968－），女（壯族），廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院研究員，碩士，從事天然植物提取和抗氧化活性的研究。